一种昆虫细胞色素P450基因及其应用

摘要

本发明提供一种昆虫细胞色素P450基因及其应用，包括昆虫细胞色素P450基因、基因片段及其dsRNA和dsRNA在致死害虫中的应用。首先对飞蝗的细胞色素P450基因进行克隆、测序后，获得CYP4G102基因，其核苷酸全长序列为SEQ ID NO：1，氨基酸序列为SEQ ID NO：2。而后获得序列为SEQ ID NO：3的该基因片段，由该片段合成dsRNA。将上述合成的dsRNA注入飞蝗体腔后，此种昆虫因蜕皮后体壁保水性能减弱，导致体内水分过度散失而死亡，死亡率达到100％。本发明为基于RNA干扰的害虫防治提供分子靶标，可用于害虫防治。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及昆虫细胞色素P450基因、基因片段及其dsRNA和 dsRNA在致死害虫中的应用。

背景技术

在我国，农业产业的可持续发展在国家发展战略中具有举足轻重的作用，农业虫害的综 合防治是农业植物保护的重要工作。飞蝗具有迁飞性和暴发性，蝗灾是我国农业历史上的重 大自然灾害。蝗灾治理仍主要采取化学防治方法，杀虫剂的大规模应用对农业生产和生态环 境造成了严重威胁。在绿色植保的发展理念的指导下，探索新型环保的害虫防治方法成为植 物保护领域的发展方向。

目前，基于RNA干扰(RNA interference,RNAi)的害虫控制方法，已成为新的害虫防治 手段。该技术利用昆虫自身基因片段，通过RNAi抑制昆虫体内生长发育或生化代谢中关键 基因的表达，以控制害虫为害。该技术具有抗虫专一性，对非靶标生物无杀伤作用和对环境 无毒无害的优势。

RNAi常用的导入方法有注射、饲喂、浸泡、组织培养、病毒感染、转基因等。利用RNAi 技术防治害虫的可行性已被证实，2007年发表于Nature Biotechnology中的两篇学术论文报道 了该领域进展。已成功培育出dsRNA转基因玉米和棉花植株，诱导特异性RNAi反应，达到 了防治害虫的目的(Baum et al,2007；Mao et al,2007)。研究表明，RNA干扰技术能够有效 控制害虫，在农业植保防治领域具有广阔的发展前景。而实现基于RNAi害虫有效控制的关 键问题是筛选害虫特异性和高效致死作用的dsRNA。

昆虫表皮脂类主要成分为碳氢化合物、醇及蜡脂等，其可防止昆虫体内水分的过分蒸发， 同时在昆虫防御、生殖及通讯等方面也发挥着重要作用，因此抑制昆虫表皮脂类合成可达到 害虫防治的目的。细胞色素P450单氧化酶基因CYP4G102主要负责飞蝗表皮脂类物质的合 成，由于CYP4G基因是昆虫所特有的，故采用该基因开展基于RNAi的害虫防治应用是安全 的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种昆虫细胞色素P450基因、基因片段及其dsRNA和dsRNA在 致死害虫中的应用。

本发明提供的一种昆虫细胞色素P450基因(全长序列)，其核苷酸序列是SEQ ID NO： 1，序列长度为1686bp；氨基酸序列是SEQ ID NO：2，序列长度为561aa。

本发明提供的一种昆虫细胞色素P450基因片段，其核苷酸序列是SEQ ID NO：3。

本发明提供的一种昆虫细胞色素P450基因片段的获得的方法，包括如下步骤：对飞蝗细 胞色素P450基因(CYP4G102)氨基酸序列分析后，选择细胞色素P4504G家族的特征区域， 设计上游引物SEQ ID NO：4和下游引物SEQ ID NO：5，以含有核苷酸序列SEQ ID NO：1 的质粒为模板，通过PCR扩增获得SEQ ID NO：3的DNA片段，该片段含有T7启动子，核 苷酸序列长度为443bp。

进一步，以SEQ ID NO：3的DNA片段为模板，利用试剂盒合成dsRNA(dsCYP4G102)。

SEQ ID NO：3合成的dsRNA(简称为dsCYP4G102)在致死害虫中的应用：注射上述 dsRNA到昆虫体腔，结果表明：SEQ ID NO：3合成的dsRNA可以特异性地沉默飞蝗细胞色 素P450基因CYP4G102的mRNA表达，导致飞蝗体壁保水性能减弱，体内水分过度散失而 死亡。

附图说明

图1：飞蝗2龄若虫注射dsRNA 24h后，细胞色素P450(LmCYP4G102)基因的mRNA 表达情况。β-actin为内参基因，**P<0.01(dsGFP：注射dsGFP的对照组，dsCYP4G102： 注射dsCYP4G102的实验组)。

图2：飞蝗2龄若虫注射dsRNA后对若虫生长发育的影响。注射dsCYP4G102的实验组 若虫在蜕皮至3龄后不久便死亡，虫体出现失水皱缩(图2A)、变脆易碎(图2B)的表型。 (dsGFP：注射dsGFP的对照组，dsCYP4G102：注射dsCYP4G102的实验组)。

图3：飞蝗2龄若虫注射dsRNA后，蜕皮至3龄时若虫体重的比较。注射dsCYP4G102 的实验组若虫蜕皮死亡后体重明显减轻。***代表两组之间体重差异极显著(P<0.0001,T-test) (dsGFP：注射dsGFP的对照组，dsCYP4G102：注射dsCYP4G102的实验组)。

具体实施方式

实施例1：飞蝗细胞色素P450基因cDNA全长序列的获得

基于飞蝗转录组数据库，采用生物信息学方法对飞蝗细胞色素P450基因进行搜索，经过 序列分析，获得相关基因部分序列。通过cDNA末端快速克隆PCR技术，获得飞蝗细胞色素P450 基因(LmCYP4G102)cDNA全长序列，核苷酸序列长度为1686bp，编码561个氨基酸。

实施例2：飞蝗细胞色素P450基因片段及其dsRNA的获得

1)飞蝗细胞色素P450基因片段的获得

根据细胞色素P4504G家族特征区域的序列，采用primer premier 5.0软件设计特异性引 物，上游引物序列为SEQ ID NO：4，下游引物序列为SEQ ID NO：5，所有引物均由生工生 物工程(上海)股份有限公司合成。以含有SEQ ID NO：1的质粒为模板，PCR扩增获得飞 蝗细胞色素P450基因片段，用SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega)试剂盒 将所获飞蝗细胞色素P450基因片段进行纯化。

2)飞蝗细胞色素P450基因片段dsRNA的合成

以1)步骤获得的飞蝗细胞色素P450基因片段SEQ ID NO：3为模板，按照T7RiboMAX^TMExpress RNAi System(Promega)试剂盒说明书，体外转录合成dsRNA(dsCYP4G102)。得到 的dsRNA用1％的琼脂糖凝胶电泳检测其单一性，用NANODROP(Thermo Scientific,USA) 将其定量至终浓度为2μg/μL，保存至-80℃冰箱备用。

实施例3：细胞色素P450基因片段合成的dsRNA致死飞蝗实验

1、飞蝗细胞色素P450基因CYP4G102片段合成的dsRNA注射

选取飞蝗2龄第2天大小均一、健康状况一致的若虫，设置注射dsGFP的对照组和注射 SEQ ID NO：3的dsRNA(dsCYP4G102)的实验组。采用微量注射器将体外合成的dsRNA 注射至若虫体腔，dsRNA的注射量为4μg/头，每组各60头若虫，设置3个生物学重复。注 射完毕后，将若虫置于纱笼中放于人工气候箱中饲养(光照：黑暗时间＝14h:10h，温度30±2℃， 湿度60％)，给以新鲜小麦幼苗喂食。

2、飞蝗细胞色素P450基因沉默效率检测

取注射dsRNA 24h后的若虫，对照组和实验组均取12头，雌雄各半，设置3个生物学 重复。Trizol法提取总RNA，采用M-MLV反转录酶获得第一链cDNA，以此为模板进行 Real-time PCR，检测目的基因(LmCYP4G102)和内参基因(β-actin)的相对表达量，以计 算目的基因的沉默效率。结果表明该基因的沉默效率达90％(图1)。

3、注射dsRNA后飞蝗表型的观察

2龄若虫注射dsRNA后，对照组与注射dsCYP4G102实验组的若虫在取食量、体型变化 及体重增长方面并无显著差异，而且均可顺利蜕皮至3龄，但dsCYP4G102注射组若虫在蜕 至3龄后不久(约20min)便死亡，放置一段时间后(约3-4h)，虫体出现失水皱缩的表型， 极易破碎(图2A-B)。此时，将对照组与注射dsCYP4G102实验组的3龄若虫按雌雄分类， 称量体重进行比较。结果发现dsCYP4G102注射组若虫体重明显减轻(图3)。

4、注射dsRNA后飞蝗死亡情况统计

注射dsCYP4G102的飞蝗实验组死亡率为100％。这与注射dsGFP的对照组(死亡率为0％) 相比，致死效果明显。