在线衍生测定化妆品中甲醛的方法

摘要

本发明涉及一种在线衍生-液相色谱法测定化妆品中甲醛的测定方法，步骤如下：1)提取：称取试样，置于具塞刻度离心管中，加入适量乙腈，涡旋溶解；用乙腈定容，盖上塞后涡旋混匀；过微孔滤膜，滤液2h内供HPLC测定；2)甲醛标准工作溶液的制备；3)测定：根据样液中甲醛浓度的情况选定峰面积相近的标准工作溶液系列，标准工作溶液和样液等体积参插进样测定，用保留时间定性，外标法定量；4)空白试验：除不加试样外，按上述1)和3)操作步骤进行；5)结果计算和表述：按公式计算试样中甲醛的残留量或采用色谱数据处理系统计算，计算结果需扣除空白值。本发明简化了样品制备步骤，提高了检测效率，快速、简便、重现性高。

说明书

技术领域

本发明涉及一种在线衍生-液相色谱法测定化妆品中甲醛的测定方法。

背景技术

甲醛俗称福尔马林，是无色、具有强烈气味的刺激性气体，其35％～40％的水溶液通称福尔马林。甲醛被世界卫生组织确认为致癌和致畸物质，在我国有毒化学品控制名单上高居第二。2011年1月，欧盟非食品消费类产品快速预警系统通报了我国输欧化妆品中的游离甲醛含量超标问题。对照欧盟的化妆品指令76/768/EEC中的限量，被通报的三批护发素中游离甲醛含量超过了限量值的8倍之多，将遭到退货乃至销毁处理。2011年11月，美国安全化妆品运动联盟宣布，部分强生婴儿洗发水含有可致癌的二恶烷及释放出微量甲醛的季铵盐-15，并号召消费者抵制强生婴儿洗发水，直至这些产品不再含有害化学物质。化妆品中甲醛超标问题越来越引起消费者的关注。

化妆品中含有甲醛以及可释放甲醛的杀菌防腐剂，甲醛缓释剂通常被添加至化妆品中，通过缓慢释放甲醛或衍生物达到杀菌防腐目的。我国《化妆品卫生规范》(2007版)规定甲醛为限用物质，口腔卫生产品≤0.1％，其他产品≤0.2％(均以游离甲醛计)，指甲硬化剂≤5％，同时禁止用于喷雾产品。当成品中甲醛质量分数超过0.05％(以游离甲醛计)时，必须在产品标签上标印“含甲醛”。化妆品中使用率较高的甲醛缓释剂类防腐剂主要有：2-溴-2-硝基-1,3-丙二醇、双(羟甲基)咪唑烷基脲、咪唑烷基脲、DMDM乙内酰脲、季铵盐-15、乌洛托品、多聚甲醛等，多达十几种，《化妆品卫生规范》(2007版)规定其限量为0.1％～0.6％不等。

国外某研究组分析了瑞典的润肤霜，结果显示10％的样品中含有甲醛(0.02％～0.09％)，这些产品虽没有直接加入甲醛，但大多含有可释放甲醛的防腐剂。国内市场上有许多除臭或抑汗类化妆品含有高达20％～40％浓度的乌洛托品，可能对消费者的健康构成威胁。文献报道甲醛引起过敏或皮炎所需的阈浓度很低，分别为30μg/L(0.003％)和250μg/L(0.0025％)。

欧盟化妆品化学分析方法工作组在开发甲醛缓释剂类防腐剂的分析方法时发现，这些物质在溶于水和其它极性溶剂时很快释放出甲醛。甲醛供体释放甲醛量的多少和甲醛释放体所处的物理化学环境有关，随pH值、温度和时间的增加而增加。化妆品中甲醛的测定方法主要有比色法、柱前衍生-色谱法、柱后衍生法和核磁共振法。化妆品中甲醛检测的难点是，在样品前处理过程中，甲醛缓释剂大量分解导致甲醛检测结果偏高。比色法能测定甲醛总量，在衍生化过程中甲醛缓释剂分解，检测甲醛为游离甲醛、复合甲醛和聚合甲醛总量。柱后衍生法能测定游离甲醛，液相色谱将游离甲醛和甲醛缓释剂分开，柱后衍生避免了甲醛缓释剂的干扰，但是在样品提取和净化过程，甲醛缓释剂在溶于水或其它极性溶剂时会释放出甲醛。 柱前衍生-色谱法，采用衍生反应-萃取阻断法，能有效抑制甲醛缓释剂分解释放甲醛，但是人工操作耗时，重现性不佳。核磁共振法作为一种纯物理方法，虽不会影响游离甲醛和甲醛缓释剂之间的平衡，但核磁共振仪器昂贵，方法难以推广。

发明内容

为了解决上述的化妆品中甲醛的测定方法中存在的技术缺陷，本发明的目的是提供一种在线衍生-液相色谱法测定化妆品中甲醛的方法，该方法采用乙腈提取样品中甲醛，2，4-二硝基苯肼的乙腈-乙酸(4:1，v/v)溶液为衍生液，在线自动衍生，液相色谱法测定。

为了实现上述的目的，本发明采用了以下的技术方案：

在线衍生测定化妆品中甲醛的方法，该方法包括以下的步骤：

1)提取

称取试样0.2g，精确至0.001g，置于10mL具塞刻度离心管中，加入适量乙腈，涡旋溶解；用乙腈定容至10mL，盖上塞后涡旋混匀1min，以不低于3000r/min的速率离心3min；过微孔滤膜，滤液2h内供HPLC测定；

2)甲醛标准工作溶液的制备

移取适量的甲醛标准储备溶液，置于10mL容量瓶中，用乙腈定容至10mL，盖上塞后涡旋混匀，供HPLC测定；上述的甲醛标准储备溶液的浓度为100mg/L；

3)测定

根据样液中甲醛浓度的情况选定峰面积相近的标准工作溶液系列，标准工作溶液和样液中甲醛衍生物的响应值均应在仪器检测的线性范围内，标准工作溶液和样液等体积参插进样测定，用保留时间定性，外标法定量；液相色谱条件为：

a)色谱柱：C₁₈柱，150mm×4.6mm内径，5μm，或相当者；

b)流动相：乙腈-水，体积比为65：35；

c)流速：1.0mL/min；

d)检测波长：355nm；

e)自动衍生程序：吸取衍生液10μL，样品溶液5μL，衍生液10μL，充分混合，反应2min，进样；上述的衍生液为2，4-二硝基苯肼的乙腈溶液与乙酸构成的混合溶液，2，4-二硝基苯肼的浓度为2g/L，衍生液中乙腈:乙酸的体积比为4：1；

4)空白试验

除不加试样外，按上述1)和3)操作步骤进行；

5)结果计算和表述

按以下公式计算试样中甲醛的残留量或采用色谱数据处理系统计算，计算结果需扣除空 白值：

$X=\frac{A\times c\times V}{\mathrm{As}\times m}$

式中：

X——试样中甲醛的残留量，单位为μg/g；

A——样液中甲醛衍生物的峰面积；

c——标准溶液中甲醛衍生物的浓度，单位为mg/L；

V——样液最终定容体积，单位为mL；

As——标准溶液中甲醛衍生物的峰面积；

m——试样溶液所代表的试样质量，单位为g。

本发明采用乙腈提取化妆品中甲醛，2，4-二硝基苯肼的乙腈-乙酸(4:1，v/v)溶液为衍生液，在线衍生-液相色谱法测定。本发明简化了样品制备步骤，有效抑制了甲醛缓释剂的分解，缩短了分析时间，提高了检测效率，快速、简便、重现性高，适合大批量样品中游离甲醛含量的快速测定。

附图说明

图1为甲醛衍生物的峰面积随衍生时间的变化图。

图2为浓度1.0μg/mL甲醛标准衍生溶液的色谱图。

图3为洗手液空白样品色谱图。

图4为添加甲醛标样后的样品色谱图。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式做一个详细的说明。

1.1方法提要

乙腈提取样品中甲醛。在线自动衍生后，在355nm波长处液相色谱测定，外标法定量。1.2仪器和试剂 

高效液相色谱仪(配有二极管阵列检测器或紫外检测器)，高速离心机，涡旋仪。甲醛标准储备溶液(100mg/L)，2，4-二硝基苯肼(DNPH)，乙腈、甲醇、四氢呋喃、丙酮均为色谱纯。除另有说明外，所用试剂均为分析纯，所用水为超纯水。

1.3测定步骤

1.3.1提取

称取试样0.2g，精确至0.001g，置于10mL具塞刻度离心管中，加入适量乙腈，涡旋溶解；用乙腈定容至10mL，盖上塞后涡旋混匀1min，以不低于3000r/min的速率离心3min；过微孔滤膜，滤液供HPLC测定。

1.3.2甲醛标准工作溶液的制备

移取适量的甲醛标准储备溶液，置于10mL容量瓶中，用乙腈定容至10mL，盖上塞后涡旋混匀，供HPLC测定；

1.3.3测定

1.3.3.1液相色谱条件 

液相色谱条件为：

a)色谱柱：C₁₈柱，150mm×4.6mm(内径)，3.5μm，或相当者；

b)流动相：乙腈-水(65+35，V+V)；

c)流速：1.0mL/min；

d)检测波长：355nm；

e)自动衍生程序：吸取衍生液10μL，样品溶液5μL，衍生液10μL，充分混合，反应2min，进样。

1.3.3.2色谱测定

根据样液中甲醛浓度的情况选定峰面积相近的标准工作溶液系列。标准工作溶液和样液中甲醛衍生物的响应值均应在仪器检测的线性范围内。标准工作溶液和样液等体积参插进样测定。用保留时间定性，外标法定量。在上述色谱条件下甲醛衍生物的保留时间约为3min。1.3.4空白试验

除不加试样外，按上述1.3.1和1.3.3操作步骤进行。

1.4结果计算和表述

按以下公式计算试样中甲醛的残留量或采用色谱数据处理系统计算，计算结果需扣除空

白值：

$X=\frac{A\times c\times V}{\mathrm{As}\times m}$

式中：

X——试样中甲醛的残留量，单位为μg/g；

A——样液中甲醛衍生物的峰面积；

c——标准溶液中甲醛衍生物的浓度，单位为mg/L；

V——样液最终定容体积，单位为mL；

A_s——标准溶液中甲醛衍生物的峰面积；

m——试样溶液所代表的试样质量，单位为g。

2.1衍生反应条件的选择

分别采用乙腈-磷酸盐缓冲液(pH 2)(1:1，v/v)和乙腈-乙酸(5:1，v/v)配制DNPH溶液，两者室温下衍生甲醛的衍生效率相近。取10mg/L甲醛标准溶液，采用上述两种DNPH溶液，分别采用离线衍生和自动衍生程序，甲醛衍生物的峰面积与衍生时间的曲线见图1。采用乙腈-乙酸(4:1，v/v)配制DNPH溶液，在线衍生反应2min，甲醛衍生完全，衍生效率达到了离线衍生的90％。

2.2提取溶剂的选择

选择化妆品中使用率较高的双(羟甲基)咪唑烷基脲、咪唑烷基脲、1,3-二羟甲基-5,5-二甲基海因(DMDM乙内酰脲)、季铵盐-15、乌洛托品5种甲醛缓释剂，试验提取溶剂对甲醛缓释剂释放甲醛量的影响。

甲醛供体释放甲醛量的多少和甲醛释放体所处的物理及化学环境有关，随着pH值、温度和时间的增加所释放的甲醛量增加。分别称取5种甲醛缓释剂10mg，分别加入1mL甲醇、乙腈、四氢呋喃、丙酮、pH2缓冲液、pH7水、pH9缓冲液，涡旋1min，室温静置5min，取适量溶液在线衍生，检测释放甲醛含量。结果表明，甲醇和水溶液促进甲醛供体醇解和水解，释放甲醛量较高；乙腈、四氢呋喃和丙酮能较好抑制甲醛供体分解。丙酮易挥发且与甲醛竞争与衍生剂反应。选择乙腈为提取溶剂，在线衍生甲醛，能有效避免甲醛缓释剂分解。2.3提取时间的选择

试验乙腈为提取溶剂时，提取时间增加对甲醛缓释剂释放甲醛量的影响。分别称取8种甲醛缓释剂10mg，加入1mL乙腈，涡旋1min，室温静置5min、1h、2h、24h，取适量溶液在线衍生，检测释放甲醛含量。结果表明，室温静置5min时，溶液中甲醛释放量如下：DMDM乙内酰脲>季铵盐-15>双(羟甲基)咪唑烷基脲>咪唑烷基脲>乌洛托品。静置2h时，5种甲醛缓释剂释放甲醛总量比静置5min时递增7％；静置24h时，5种甲醛缓释剂释放甲醛总量比静置5min时递增55％。因此选择乙腈提取液，2h内进行HPLC测定。

2.4校正曲线、检出限及回收率

在方法所确定的实验条件下，甲醛标准溶液的质量浓度(X)在1.0～10.0mg/L范围内与其峰面积(Y)呈现良好的线性关系，得到的校正曲线为Y＝218X+8.21，r²＝0.9999。选择洗手液空白样品，分别添加50、100、200μg/g 3个浓度水平的甲醛，平行测定6次，甲醛的回收率为83.0％～98.4％，相对标准偏差(RSD)<5.0％，方法的定量限(以信噪比(S/N)>10计)为50μg/g。图2为浓度1.0μg/mL甲醛标准衍生溶液的色谱图，图3为洗手液空白样品和图4为添加甲醛标样后的样品色谱图。