营养制品和医药产品的基于细胞的质量控制生物测定

摘要

一种用于确定具有未知的翻译起始抑制活性水平的组合物的翻译起始抑制能力的方法，所述方法包括使eIF2α-WT细胞与所述组合物接触一段时间并在对抑制所述细胞增殖有效的温度下进行，测量所述eIF2α-WT细胞被所述样品诱导的增殖抑制水平，并将由所述样品诱导的增殖抑制水平与由具有已知所述活性量的标准品诱导的抑制水平相比较，在所述样品中所述翻译起始抑制活性的量与所述eIF2α-WT细胞的增殖抑制水平成比例。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2012年7月20日递交的美国临时专利申请第61/674,180号的 优先权，在此将其全部内容引入本文以作参考。

技术领域

本发明的实施方案大体上涉及食品、营养制品和医药产品的对人类或动 物健康有益的特性的测定。本发明的实施方案进一步改进方法，所述改进方 法采用以细胞为基础的测定，其使用新的细胞系来测定此类产品作为翻译起 始抑制剂的活性。

背景技术

信使RNA(mRNA)的翻译起始在调控细胞生长和恶性转化中起决定性的 作用，这是因为大多数致癌和细胞生长调控蛋白的表达是在翻译上调控的 (Flynn等人，1996，Cancer Surv.27:293；Sonenberg等人，1998，Curr.Opin. Cell Biol.10:268)。由于该原因，翻译起始是严密调控的细胞进程。翻译起始 负调控的失败可导致癌症的诱发、发作和发展(Donze等人，1995，Embo J.14: 3828；Rosenwald，1996，Bioessays 18:243-50；De Benedetti等人，2004， Oncogene 23:3189-99；和Rosenwald，2004，Oncogene 23:3230)。弱调控的 翻译起始的抑制也可引起转化表型的逆转(Jiang等人，2003，Cancer Cell Int. 3:2，Graff等人，1995，Int.J.Cancer 60:255)。eIF2·GTP·Met-tRNA_i复合体(也 称为三元复合体)是翻译起始的关键正调节因子。限制其有效性削减新一轮 蛋白质翻译的起始。虽然许多致癌蛋白和其它细胞生长因子的翻译在很大程 度上依赖于所述三元复合体，但持家基因的翻译却不同，由于该原因，有助 于限制所述三元复合体的量、有效性或活性的食品、营养制品和医药产品可 能提供预防和治疗疾病的安全的手段。此外，在三元复合体或更一般来讲翻 译起始的抑制剂的存在下，某些肿瘤抑制剂以及前凋亡基因和/或蛋白质的表 达事实上增加。致癌蛋白翻译的减少，特别是与肿瘤抑制剂和前凋亡基因的 上调组合，倾向于全面阻止和/或抑制恶性表型。

在源于鱼、特别是原产自寒冷海水的野生种群的那些的油中发现大量二 十碳五烯酸(EPA)，n-3多不饱和脂肪酸(n-3PUFA)。养殖鱼类与野生鱼类相 比典型地包含相当低水平的n-3PUFA。已观察到当将海洋鱼油施用到人类前 列腺癌患者时，eIF2α被磷酸化，表明功能性eIF2对三元复合体的有效性已降 低，这与在动物模型或基于细胞的实验体系中使用EPA和三元复合体的合成 抑制剂的发现相一致。因此，包含翻译起始抑制剂的饮食补充剂(dietary  supplements)代表对治疗和/或预防癌症和/或增殖性疾病(其中异常细胞增殖 为特征性的病理异常)具有吸引力的商品。此类饮食补充剂也可用作翻译起 始调节剂，并代表对治疗和/或预防代谢疾病如肥胖症和糖尿病具有吸引力的 商品。

对于消费者可广泛地得到各种来源的鱼油来作为食品或营养补充剂 (nutritional supplement)。包含于产品的不同生产小批(lot)、大批(batch)、样品 或剂量的油或源于油的馏分或组分可在质量或效价上有所变化，这取决于其 来源(例如，气候、鱼种类或生长条件、供应商)或加工条件。产品的单一小 批、大批、样品或剂量的含量甚至可为同样的情况。包含翻译起始的自然或 合成抑制剂的其它食品、营养制品或医药产品可在质量或效价上因类似的原 因而变化。

对于产品对潜在消费者的生理效应或药效需要质量控制和/或保证。

发明内容

对人类疾病具有治疗/预防作用的饮食补充剂代表了世界范围内快速发 展、拥有数十亿美金的产业。然而，该产业中主要的未解决的问题是缺少对 提取于自然资源的产品的质量控制以保证特定的生物学活性和效价、在提取 /生产自相同植物/动物来源的不同制剂中生物学活性上的均质性、以及在提 取自相同植物或动物物种但源于不同地理区域和/或工业来源的制剂中相当 的效价。

翻译起始的抑制剂、上调剂或其它调节剂具有广谱抗癌、抗细胞增殖的 效果以及对能量平衡的广谱效果。包含翻译起始的抑制剂、上调剂或其它调 节剂的营养制品包括但不限于鱼油制剂，其可用于预防特征为包括癌症的异 常细胞增殖的人类疾病。然而，目前确定该种营养制品生物学活性的生物测 定的缺失，使其无法控制不同品牌或来源中或来自单一品牌或来源的不同大 批或产品中的其质量、效价和/或均质性。

因此，在某些示例性实施方案中，提供食品、营养制品和医药产品在该 产品调节mRNA翻译起始的能力方面的质量控制和/或保证方法，从而满足向 消费者提供关于该产品潜在健康益处的准确信息的需求。

提供翻译起始特异的生物测定，其可用于定量评价化合物，如包含翻译 起始抑制剂、上调剂或调节剂的营养制品的生物学活性。本文所提供的翻译 起始特异的测定对营养制品的质量(如，生物学活性)、效价和大批均质性 (batch homogeneity)进行评价，所述营养制品包含产品，例如用作翻译起始 抑制剂、上调剂或其它调节剂的内源产品或添加剂。

这些测定方法提供精确而快速的手段来确定食品、营养制品或医药产品 的给定样品可调节翻译起始的程度，并从而对消耗此类产品或对其施用此类 产品的人类或动物有益。这些测定方法通常允许对此类产品的样品抑制 mRNA翻译起始的能力进行测验。本文所描述的示例性测定能够检测样品抑 制三元复合体的形成、有效性或活性的能力，而不管三元复合体是否经历 eIF2α的磷酸化或其它方式。

在某些示例性实施方案中，可对产品样品上调翻译某些mRNA转录本的 能力进行测验。此类转录本的翻译的上调可表明包含于此类样品中的EPA或 其它3-n PUFA的存在、水平、有效性和/或活性。在某些实施方案中，可检 测到样品增加某些mRNA转录本翻译的能力，所述mRNA转录本的5′非翻译 区(5′UTRs)包含两个以上开放阅读框(ORFs)。在某些实施方案中，样品使 ATF-4、BRCA1mRNAb、CD59、TCTP和GCN4中的一种或多种的翻译增加 的能力可作为此样品的效价和/或给予消耗相关产品或施用相关产品的人类 或动物健康益处的能力的量度来试验。此类测定可检测由于这些mRNA上调 翻译所致的蛋白质增加的量、有效性或活性。标记蛋白翻译增加、上调或其 它方面被调节的程度可通过与对照比较试验结果来确定。不希望受任何具体 理论的约束，该增加的翻译可被eIF2α的磷酸化和/或三元复合体的抑制所促 进。

本发明能够通过检测基因的核酸产物对食品、营养制品或医药产品的样 品的有益活性来进行测定，在包含于此样品中的EPA或其它3-n PUFA的存在 下，所述基因的转录增加、上调或其它方面被调节。

在某些实施方案中，本发明提供在EPA、其它3-n PUFA或其它有益试剂 的存在下增加、上调或其它方面被调节的基因转录本的检测。此转录本以非 限定方式可包括编码ATF-4、BiP、CHOP、Xpb-1和氨基酸合成酶的那些转 录本。本发明的某些实施方案提供例如通过逆转录、核酸扩增(如，本领域 已知的PCR或等温扩增)或核酸杂交方法检测编码此类蛋白的mRNA转录本。 增加、上调或其它方面被调节的基因转录的检测也可使用报告基因测定来进 行，例如在允许DNA转录发生的体系中，在接触试验或对照样品前将目标基 因的启动子可操作地连接到报告基因上。通过将试验样品中观察到的转录水 平或报告基因活性与外部或内部(如，双重报道)标准或对照所观察到的那些 进行比较来确定转录增加、上调或其它方面被调节的程度。

某些示例性实施方案提供通过检测在EPA、其它3-n PUFA或其它有益试 剂的存在下由增加、上调或其它方面被调节的基因转录本编码的蛋白质从而 对食品、营养制品和医药产品的测定。此类蛋白质以不限定的方法可包括 ATF-4、BiP、CHOP、Xpb-1和氨基酸合成酶。在试验样品存在下观察到的 此类蛋白质的水平可与标准或其它对照样品存在下所观察到的那些进行比 较来确定试验样品的效价。

在另一实施方案中，提供确定许多单独组合物的大批均质性的方法，其 包括以下步骤：检测所述单独组合物至少之一的翻译起始抑制、上调或其它 调节的活性，并将单独组合物至少之一的翻译起始抑制、上调或其它调节的 活性与标准进行比较来确定大批均质性。

因此，在某些示例性实施方案中，提供确定物质(如，源于鱼油的物质 和/或包含EPA的物质)是否具有一种或多种有益的生物学、营养或医药特性 的方法。所述方法包括以下步骤：提供第二样品，其包括在其5′UTR具有至 少两个开放阅读框的第二mRNA序列，其中所述第二mRNA序列编码第二生 物标记物蛋白；使第二样品与该物质相接触；并检测第一和第二生物标记物 蛋白的翻译水平，其中如果该物质具有一种或多种有益的生物学、营养或医 药特性，则所述第二生物标记物蛋白的翻译水平大于第一生物标记物的翻译 水平。在某些方面，第一样品与标准品或对照物相接触。在另外的方面，第 一mRNA和第二mRNA具有相同的序列。在其它方面，第一生物标记物蛋白 和第二生物标记物蛋白为相同的蛋白。在某些方面，第一和第二生物标记物 蛋白选自由乳腺癌易感性基因1(BRCA1)转录本b产物、转录激活因子 4(ATF-4)、翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)、保护素(CD59)和通用控制非去阻遏蛋 白(nonderepressible)4(GCN4)组成的组。在其它方面，检测翻译水平的步骤通 过蛋白质分析(Western analysis)、ELISA和免疫细胞化学的一种或多种来进 行。在某些方面，样品为其中可适当地发生DNA转录和/或mRNA翻译的动 物、细胞或无细胞系统(如，兔网织红细胞裂解液系统)。细胞可源于人类、 其它哺乳动物(包括但不限于小鼠和大鼠)、鸡或其它鸟类或者酵母。无细胞 系统包括兔网织红细胞、小麦胚芽或哺乳动物细胞胞质提取物例如HeLa  S100提取物。在某些方面，5′UTR为天然产生或合成的。在其它方面，5′UTR 可操作地连接到编码报告蛋白的编码序列上。在某些方面，翻译水平由测定 报告蛋白的一种或多种活性来确定。在其它方面，第二生物标记物蛋白的翻 译水平至少为第一生物标记物的翻译水平的150％。在某些方面，该物质将 进行n-3多不饱和脂肪酸(PUFA)(如，二十碳五烯酸(EPA))活性的测定。在某 些方面，该物质为食品样品、营养制品样品或药物制品样品。

在某些示例性实施方案中，提供确定物质(如，源于鱼油的物质和/或包 含EPA的物质)是否具有一种或多种有益的生物学、营养或医药特性的方法。 所述方法包括以下步骤：提供包括在其5′UTR具有至少两个开放阅读框的 mRNA序列的样品，其中所述mRNA序列编码生物标记物蛋白；使样品与该 物质相接触；检测生物标记物蛋白的翻译水平；并检测内标蛋白的翻译水平， 其中如果该物质具有一种或多种有益的生物学、营养或医药特性，则所述生 物标记物蛋白的翻译水平大于内标蛋白的翻译水平。在某些方面，内标蛋白 由在其5′UTR具有一个或无开放阅读框的mRNA序列编码。在其它方面，生 物标记物蛋白选自由BRCA1转录本b产物、ATF-4、TCTP、CD59和GCN4组 成的组。在其它方面，检测翻译水平的步骤通过蛋白质分析、ELISA和免疫 细胞化学的一种或多种来进行。在另一方面，5′UTR为天然产生或合成的。 在其它方面，5′UTR可操作地连接到编码报告蛋白的编码序列上。在其它方 面，翻译水平由测定报告蛋白的一种或多种活性来确定。在其它方面，生物 标记物蛋白的翻译水平至少为内标的翻译水平的150％。在某些方面，该物 质将进行n-3PUFA(如，EPA)活性的测定。在某些方面，该物质为食品样品、 营养制品样品或药物制品样品。

在某些示例性实施方案中，本发明提供检测物质(如，源于鱼油的物质 和/或包含EPA的物质)是否调节生物标记物基因的转录上调的方法。所述方 法包括以下步骤：提供第一试验系统，其包括具有可操作地连接到第一生物 标记物启动子上的第一报告蛋白编码区的mRNA序列；提供第二试验系统， 其包括具有可操作地连接到第二生物标记物启动子上的第二报告蛋白编码 区的mRNA序列；使第二试验系统与该物质相接触；检测第一和第二mRNA 序列的转录水平；比较第一和第二mRNA的转录水平和确定是否第二mRNA 序列的转录水平大于第一mRNA序列的转录水平，并且如果第二mRNA的转 录水平大于第一mRNA的转录水平，如果该物质调节生物标记物基因的转录 上调，鉴定该物质为生物标记基因的上调剂。在本发明的某些方面，第一和 第二试验系统为动物测定、基于细胞的测定或无细胞测定。在某些方面，第 一试验系统与标准品或对照物相接触。在其它方面，第一mRNA和第二mRNA 具有相同序列和/或第一报告蛋白和第二报告蛋白为相同蛋白。在某些方面， 通过实时PCR确定转录水平(如，体外或体内(如，细胞内))。在某些方面，通 过检测一种或多种报告蛋白活性来确定转录活性。在其它方面，生物标记物 基因编码前凋亡蛋白或肿瘤抑制蛋白(如，CHOP、BiP、ATF-4、Xbp-1或氨 基酸合成酶等)。在某些方面，第二mRNA序列的转录至少为第一mRNA序列 转录水平的150％。在某些方面，该物质进行n-3PUFA(如，EPA)活性测定。 在某些方面，该物质为食品样品、营养制品样品或药物制品样品。

在某些示例性实施方案中，本发明提供制造质量控制的鱼油产品的方 法。所述方法包括以下步骤：提供第一样品，其包括在第一mRNA序列的5′ 非翻译区具有至少两个开放阅读框的第一mRNA序列，其中所述第一mRNA 序列编码第一生物标记物蛋白；提供第二样品，其包括在第二mRNA序列的 5′非翻译区(UTR)具有至少两个开放阅读框的第二mRNA序列，其中所述第二 mRNA序列编码第二生物标记物蛋白；使第二样品与鱼油产品相接触，包括 翻译水平并鉴定；检测第一和第二生物标记物蛋白的翻译水平，其中如果该 鱼油产品可向受试者提供一种或多种有益的生物学、营养或医药特性，则第 二生物标记物蛋白的翻译水平大于第一生物标记物的翻译水平；并选择具有 较大翻译水平的鱼油产品作为质量控制的鱼油产品。在本发明的某些方面， 第一样品与标准品或对照物相接触。在其它方面，第一mRNA和第二mRNA 具有相同序列。在另一方面，第一生物标记物蛋白和第二生物标记物蛋白为 相同蛋白(如，BRCA1转录本b产物、ATF-4、TCTP、CD59和GCN4)。

在某些示例性实施方案中，本发明提供制造质量控制的鱼油产品的方 法。所述方法包括以下步骤：提供样品，其包括在mRNA序列的5′非翻译区 具有至少两个开放阅读框的mRNA序列，其中所述mRNA序列编码生物标记 物蛋白；使该样品与鱼油产品相接触；检测生物标记物蛋白的翻译水平；检 测内标蛋白的翻译水平；比较并鉴定其中如果该鱼油产品可向受试者提供一 种或多种有益的生物学、营养或医药特性，则生物标记物蛋白的翻译水平大 于内标蛋白的翻译水平；以及选择具有较大翻译水平的鱼油产品作为质量控 制的鱼油产品。在某些方面，生物标记物蛋白选自由BRCA1转录本b产物、 ATF-4、TCTP、CD59和GCN4组成的组。

在某些示例性实施方案中，本发明提供制造质量控制的鱼油产品的方 法。所述方法包括以下步骤：提供第一试验系统，其包括具有可操作地连接 到第一生物标记物启动子上的第一报告蛋白编码区的mRNA序列；提供第二 试验系统，其包括具有可操作地连接到第二生物标记物启动子上的第二报告 蛋白编码区的mRNA序列；使第二试验系统与鱼油产品相接触；检测第一和 第二mRNA序列的转录水平，比较并筛选其中如果该鱼油产品可向受试者提 供一种或多种有益的生物学、营养或医药特性，则第二mRNA序列的转录水 平大于第一mRNA序列的转录水平；并选择具有较大翻译水平的鱼油产品作 为质量控制鱼油产品。在某些方面，生物标记物启动子为选自由CHOP启动 子、BiP启动子、ATF-4启动子、Xbp-1启动子或氨基酸合成酶启动子等或者 受翻译起始的抑制诱导的其它类似的启动子组成的组。

在本发明某些另外的示例性实施方案中，提供使用核酸检测法例如由于 Ω-3脂肪酸活性造成的样品中增加的转录本实时PCR来检测的方法。进一步 提供通过检测在Ω-3脂肪酸转录上调的启动子的影响下由基因所编码的报告 蛋白活性来检测样品中由于Ω-3脂肪酸活性而增加的转录本的方法。进一步 提供检测在其5′UTR具有两个以上开放阅读框的转录本的翻译增加的方法。 仍进一步提供使用检测样品中由于Ω-3脂肪酸活性而增加的转录本的方法来 制造质量控制的食品、营养制品和医药产品的方法。

在本发明某些另外的示例性实施方案中，提供用于确定具有翻译起始抑 制活性的组合物的效价的方法，所述方法包括以下步骤：使eIF2α-WT细胞与 所述组合物在有效抑制所述细胞增殖的温度下接触一段时间，并确定由所述 组合物诱导的所述细胞增殖的抑制程度，其中所述组合物中所述活性的量与 所述eIF2α-WT细胞的增殖抑制程度成比例。

附图说明

从说明性实施方案连同附图的以下详细描述将更全面的理解本发明的 前述以及其它特性和优势，在所述附图中：

图1为使用抗-总eIF2α或β-肌动蛋白抗体的免疫印迹，泳道1为转导有无 shRNA的pLVTHM载体的细胞，泳道2和3为转导有包含eIF2α-WT和eIF2α- S51A ORF和shRNA#1098盒的pLVTHM载体的细胞。

图2为示出通过母本(Mat)和重组(Rec)的eIF2α-WT(GFP)与 eIF2α-S51A/RFP或eIF2α-WT/RFP细胞的实时PCR确定的内源eIF2αmRNA水 平的图。泳道1为转导有无shRNA的pLVTHM载体的细胞，泳道2和3为转导 有包含eIF2α-WT和eIF2α-S51A ORF和shRNA#1098盒的pLVTHM载体的细 胞。

图3为免疫印迹。图2中的细胞用培养基或EPA处理，并将裂解物用 pS51-eIF2α(上)或总eIF2α(下)的抗体探测。Rec＝重组，End＝内源eIF2α。

图4为示出eIF2α-S51A表达细胞对由EPA诱导的细胞增殖的抑制的抗性 而母本PC-3细胞(MAT)或转导有重组eIF2αRFP和shRNA的PC-3细胞以剂量 依赖的方式对由EPA诱导的细胞增殖的抑制敏感的图。

具体实施方式

已得到了相互矛盾的意见，即，某些mRNA的翻译在三元复合体缺乏时 比其丰富时更加有效(Aktas等人，2004，Journal of Nutrition 134(9): 2487S-2491S；Halperin和Aktas，国际专利申请公开号WO2008/008333)。这 包括编码转录因子ATF-4(其转录上调许多ER应激反应基因)例如前凋亡 C/EBP-同源蛋白(CHOP)或ER分子伴侣结合蛋白(BiP)的mRNA(Harding等 人，2000，Mol.Cell 6:1099)。当三元复合体缺乏时，BRCA1mRNA亚型(命 名为mRNAb)也更加有效的翻译。观察到在从动物癌症模型或者人类患者切 离的癌细胞和肿瘤中n-3多不饱和脂肪酸二十碳五烯酸(EPA)上调 CHOP(GenBank登录号S40706)和葡萄糖调节蛋白78(BiP，RefSeq登录号 NM_005347)，且其增加了乳腺癌细胞系和动物肿瘤中BRCA1mRNAb的翻 译。

BRCA1mRNA和编码转录激活因子4(ATF-4，RefSeq登录号NM_001675) 的mRNA各自在其5′非翻译区(5′UTR)包含多个开放阅读框(ORFs)。在不想受 科学理论的约束下，现已鉴定出分别在其5′UTR包含两个以上ORF的额外的 mRNA。此类mRNA包括，但不限于，编码翻译控制肿瘤蛋白(TCTP，RefSeq 登录号NM_003295.2)、保护素(CD59)和通用控制非去阻遏蛋白4(GCN4， RefSeq登录号NC_00113)的基因的mRNA转录本。根据某些示例性实施方案， 可测定食品、营养制品或医药产品的样品的对在其5′UTR具有多ORF的 mRNA转录本所编码的蛋白质的存在、水平或生物学活性增加的能力。具体 地，可测定此样品调节BRCA1、ATF-4、TCTP、CD59和GCN4中一个或多个 的存在、水平或活性的增加的能力。

在三元复合体抑制剂的存在下也发生某些基因的转录增加。除了编码 ATF-4、BiP和CHOP的基因外，在翻译起始抑制剂存在下显示转录增加的基 因为编码X-box结合蛋白1(Xbp-1，RefSeq登录号NM_001079539.1)和氨基酸 合成酶的那些。此类基因为根据本发明测定的翻译起始抑制剂提供适当的试 验生物标记物，例如鱼油中发现的那些。在试验动物、细胞或无细胞系统暴 露于试验食品、营养制品或医药产品样品前后，可通过本领域已知的方法检 测这些基因转录本并定量其水平，以及比较转录本水平以确定试验样品促进 标记基因转录的程度。任选地，试验生物标记物转录本的水平可与对照转录 本(如，持家基因)或分离自暴露于已知生物学活性的标准或对照的动物、细 胞或无细胞系统的转录本的水平进行比较。类似地，可检测和定量生物标记 物转录本的蛋白质产物，以及将它们的水平与未处理的动物、细胞或无细胞 系统，或者暴露于已知生物学活性的标准品或对照物的动物、细胞或系统的 那些进行比较。

如本文所使用的术语“营养制品”为“营养的”和“药物的”的组合，并且是 指对生物体如人类具有一种或多种有益影响的可吸收物质。术语营养制品也 可指存在于可吸收物质中的一种或多种化合物。可吸收物质包括，但不限于 饮食补充剂、食品和饮品等。术语“营养制品”和“营养补充剂”可互换使用。 物质(如，食品、营养制品或药物制品)具有有益的生物学、营养或医药特性 是指该物质提供个体如本文所述的一种或多种健康益处的能力(如，本文所 述的一种或多种疾病和/或紊乱的预防、降低和/或治疗)。

本发明的营养制品包括源于鱼类的油类，所述鱼类例如为冷水鱼类、温 水鱼类、淡水鱼类、盐水鱼类、半咸水鱼类(brackish water fish)、野生鱼类和 养殖鱼类等，以及脂肪酸制品，如包含Ω-3脂肪酸的那些。

如本文所使用的术语“Ω-3脂肪酸”是指多不饱和脂肪酸，例如发现于来 自油性鱼例如鲭鱼、鲑鱼和沙丁鱼等，或植物源例如芡欧鼠尾草(chia)、紫 苏、亚麻、胡桃、马齿苋、越橘(ligonberry)、沙棘和大麻等的籽和来自植物 例如阿萨伊棕榈(acai palm)的果实的油中的那些。Ω-3脂肪酸包括，但不限于， α-亚油酸(ALA)、二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)等。

本发明的某些方面涉及测定组合物抑制上调或调节翻译起始或基因转 录的效价的方法。本文使用的术语“效价(potency)”意欲包括，但不限于，化 合物，如营养制品抑制、上调或其它调节翻译起始或基因转录的效力。组合 物的效价可定义为相对于标准或对照，该组合物抑制、上调或其它调节翻译 起始或基因转录的能力。

本发明的标准或对照为当用本文所述的一种或多种生物测定来测量时 具有翻译起始抑制或转录抑制、上调或调节活性的化合物或组合物。标准可 由各种来源例如Ω-3脂肪酸或本文所述的其它试剂来获得。标准可在实验室 合成或从商业来源获得。可分别稀释或浓缩标准来减少或增加其翻译抑制、 上调或调节活性。任选地，标准或对照对于试验系统可以是内源的，如基因、 基因启动子、mRNA转录本或蛋白质(如持家基因、启动子、转录本或蛋白质)， 其转录或翻译基本上不受试验物的影响，如β-肌动蛋白、泛蛋白、b-微管蛋 白和GADPH等。

在某些方面，标准或对照为Ω-3脂肪酸，例如二十碳五烯酸。标准或对 照可源于鱼油(如海洋鱼油)或亚麻籽油。

在其它方面，标准或对照为基本上对将测定其效价或生物学活性的物质 的作用不敏感的生物标记物。作为在该上下文中所使用的，关于基因或基因 启动子的转录调控、或mRNA转录本或蛋白质的翻译调控，术语“基本上不 敏感”是指或者完全不受被试验物影响，或者调至比生物标记物对于试验物 活性显著更小的程度(如，至少10倍、100倍或至少大于1000倍)。

在某些方面，试验样品为校准的，以便其活性组分在线性范围，并不使 试验体系饱和。校准方法在本领域内是众所周知的并包括简单稀释和连续稀 释等。

本发明提供其中使用本文所述的一种或多种生物测定来将组合物的翻 译或转录抑制、上调或调节活性与标准进行比较的测定。组合物的活性水平 可为标准或对照活性的0.001％、0.01％、0.1％、1％、5％、10％、15％、20％、 25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、 85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、 101％、102％、103％、104％、105％、106％、107％、108％、109％、110％、 115％、120％、125％、130％、135％、140％、145％、150％、155％、160％、 165％、170％、175％、180％、185％、190％、195％、200％、250％、300％、 350％、400％、450％、500％、550％、600％、650％、700％、750％、800％、 850％、900％、950％、1000％或大于1000％。

在某些方面，对于翻译起始或基因转录的活性的抑制、上调或其它调节 在标准或对照活性的约1％至200％之间、约5％至195％之间、约10％至190％ 之间、约20％至180％之间、约30％至170％之间、约40％至160％之间、约50％ 至150％之间、约60％至140％之间、约65％至135％之间、约70％至130％之间、 约75％至125％之间、约80％至120％之间、约85％至115％之间、约90％至110％ 之间、约91％至109％之间、约92％至108％之间、约93％至107％之间、约94％ 至106％之间、约95％至105％之间、约96％至104％之间、约97％至103％之间、 约98％至102％之间或约99％至101％之间。在其它方面，对于翻译起始或基 因转录的活性的抑制、上调或其它调节在标准活性的约50％至约150％之间、 标准活性的约80％至约120％之间、标准活性的90％至110％之间或者标准或对 照活性的95％至105％之间。

术语"约"或"大约"通常指测量值和方法的类型在可接受的误差范围内。 例如，其可意指在给定值或范围的20％内，更优选在10％内，最优选还在5％ 内。可选地，特别是在生物系统中，术语"约"指在约log(即，数量级)内，优 选在给定值的一个因子(factor)或两个因子内。

在本发明的某些实施方案中，对照或标准可具有零活性。因此，对于给 定活性来说可获得二元结果(即，正或负)。在这样的情况下，如果需要精确 定量活性，则将测量绝对值(absolute scale)或与具有至少某一已知水平的活性 的标准比较来测量。

营养制品或包括本发明的营养制品的组合物，相对于对照/标准，可分 别稀释或浓缩来减少或增加其翻译或转录的抑制、上调或调节的活性。

本发明还提供其中通过使用一种或多种本文所述的生物测定比较两种 以上(如，10、100、1000、10,000、1,000,000以上)组合物的相对活性来测定 组合物的大批或小批的均质性的测定。如本文所使用的，术语“大批均质性” 或“小批均质性”意指，但不限于，在大批或小批中两种以上组合物的相对翻 译起始抑制上调或调节活性、或转录上调活性。如本文所使用的，术语“大 批”或“小批”是指，但不限于，两种以上组合物的组。大批或小批包括一起 制备的组合物或两种以上来源(如，地域、植物、动物、商购和/或合成来源) 的组合物。如本文所使用的，术语“大批”或“小批”还可指组合物的单一库， 产品或试验样品将从其中采集或生产，或者不然其将进一步划分(divide)或级 分(fractionate)。

在至少某些实例中，本文公开的营养制品可用于治疗与异常细胞增殖相 关的紊乱，例如细胞增殖性紊乱(如，癌症)。细胞增殖性紊乱的治疗意欲包 括抑制包含快速增殖的增殖。如本文所使用的，术语“细胞增殖性紊乱”包括 特征在于在多细胞生物中一种或多种细胞亚群的不良或不当增殖的紊乱。术 语“癌症”是指各种类型的恶性赘生物(neoplasm)，其大部分可侵入周围组织， 并可转移至不同部位(参见，例如PDR医学字典第1版，1995)。术语“赘生物” 和“肿瘤”是指通过快于正常的细胞增殖而生长，并在起动增殖的刺激物移除 后继续生长的异常组织(参见，例如PDR医学字典第1版，1995)。此类异常组 织显示出结构组织性以及与正常组织的功能性协调的部分或全部缺失，其既 可为良性(即，良性肿瘤)也可为恶性(即，恶性肿瘤)。

表述“细胞增殖性紊乱的治疗”意欲包括阻止受试者中赘生物的诱导、发 生、建立或生长，或者降低受试者中已存在的赘生物的生长。该表述还描述 了抑制赘生物细胞侵入邻近组织或赘生物从一个部位至另一个的转移。意欲 由本发明包含的赘生物类型的实例包括但不限于与以下器官的癌症相关的 那些赘生物：乳腺、皮肤、骨、前列腺、卵巢、子宫、子宫颈、肝脏、肺、 脑、喉、胆囊、胰腺、直肠、甲状旁腺、甲状腺、肾上腺、免疫系统、神经 组织、头颈部(head and neck)、结肠、胃、支气管和/或肾。

细胞增殖性紊乱可进一步包括与血管平滑肌细胞高度增殖相关的紊乱 例如增殖性心血管紊乱，如动脉粥样硬化和再狭窄。细胞增殖性紊乱还可包 括例如增殖性皮肤紊乱，如X连锁鱼鳞病、银屑病、特异反应性皮炎、变应 性接触性皮炎、表皮松解性角化过度(epidermolytic hyperkeratosis)和脂溢性 皮炎的紊乱。细胞增殖性紊乱可进一步包括例如常染色体显性多囊肾病 (autosomal dominant polycystic kidney disease)(ADPKD)、肥大细胞增多症 (mastocytosis)的紊乱，以及由传染性试剂例如病毒引起的细胞增殖性紊乱。

在至少某些实例中，根据本文公开的方法测定和/或生产的营养制品可 用于与能量平衡相关的紊乱的治疗，例如包括但不限于，糖尿病、肥胖症、 糖原贮积症(glycogen storage diseases)、脂质贮积症(lipid storage disorders)和 线粒体疾病等的代谢紊乱(还可参见万维网址： emedicine.com/ped/GENETICS_AND_METABOLIC_DISEASE.htm)。在某些 方面中，根据本文公开的方法测定和/或生产的营养制品通过与瘦素受体的 5′UTR相互作用来调节体重增加。

本文所描述的检测方法可用来在体外以及体内检测生物样品中一种或 多种目标DNA序列、RNA序列、蛋白质或多肽。例如，mRNA的体外检测技 术包括RNA杂交(Northern hybridizations)和原位杂交。与本发明的标记物相 对应的多肽的体外检测技术包括酶联免疫吸附法(ELISAs)、蛋白质印迹、免 疫沉淀和免疫荧光。检测基因组DNA的体外技术包括DNA杂交(Southern  hybridizations)。此外，蛋白质和/或多肽的体内检测技术包括向受试者引进 定向蛋白质和/或多肽的标记抗体。例如，抗体可用放射性标记物标记，该放 射性标记物在受试者中的存在和定位可通过标准成像技术来检测。

检测和/或定量的一般原理涉及在适当的条件下制备可包含一种或多种 目标DNA序列、RNA序列、蛋白质或多肽的样品或反应混合物和探针，和足 以允许标记物和探针相互作用并结合的一段时间，因而在反应混合物中形成 可除去和/或检测的复合体。这些测定可以各种方式进行。

例如，一种进行此类测定的方法涉及将目标DNA序列、RNA序列、蛋 白质或多肽或者探针锚定至固相支持物(也称作基板)上，并在反应结束时检 测锚定在固相上的目标的靶DNA序列、RNA序列、蛋白质或多肽/探针复合 体。在此方法的一个实施方案中，测定标记物的存在和/或浓度的样品可锚定 在载体或固相支持物上。在另一实施方案中，可能为相反的情况，其中可将 所述探针锚定到固相并且可使来自受试者的样品作为测定的未锚定组分进 行反应。

存在许多已建立的将测定组分与固相锚定的方法。其包括，但不限于， 通过生物素和链霉亲和素偶联而固定的标记物或探针分子。此类生物素化的 测定组分可使用本领域已知技术(如，生物素化试剂盒，Pierce Chemicals， Rockford，IL)，由生物素-NHS(N-羟基-琥珀酰亚胺)来制备，并固定于链霉 亲和素涂布的96孔板(Pierce Chemical)的孔内。在某些实施方案中，固定了测 定组分的表面可预先制备和保存。

此类测定的其它适合的载体或固相支持物包括能够结合标记或探针所 属的此类分子的任何材料。众所周知的支持物或载体包括，但不限于，玻璃、 聚苯乙烯、尼龙、聚丙烯、尼龙、聚乙烯、葡聚糖、淀粉酶、天然和改性的 纤维素、聚丙烯酰胺、辉长岩(gabbros)和磁铁矿。

为了用以上提及的方法进行测定，将未固定组分加入到在其上面锚定第 二组分的固相。反应完成后，在任何形成的复合体保持固定在固相上的条件 下可移除(如，通过洗涤)未复合的组分。可以本文概述的若干方法来完成与 固相锚定的目标DNA序列、RNA序列、蛋白质或多肽/探针复合体的检测。

在某些示例性实施方案中，为了测定的检测和读出目的，当探针为未锚 定的测定组分时，可用本领域所熟知的可检测标记物直接或间接地将其标 记。可检测的标记的实例包括各种放射性部分、酶、辅基、荧光标记物、发 光标记物、生物发光标记物、金属颗粒、蛋白质-蛋白质结合对和蛋白质-抗 体结合对等。荧光蛋白的实例包括，但不限于黄色荧光蛋白(YFP)、绿色荧 光蛋白(GFP)、蓝绿色荧光蛋白(CFP)、繖形酮、荧光黄、荧光黄异硫氰酸盐 (酯)、若丹明、二氯三嗪基胺荧光黄(dichlorotriazinylamine fluorescein)、丹磺 酰氯和藻红素等。生物发光标记物的实例包括，但不限于，荧光素酶(如， 细菌、萤火虫和叩头虫等)、荧光素和水母蛋白(aequorin)等。具有目视可检 测信号的酶系统的实例包括，但不限于半乳糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、磷酸酶、 过氧化物酶和胆碱酯酶等。可鉴定标记还包括放射性化合物例如¹²⁵I、³⁵S、 ¹⁴C、³H或³²P。可鉴定标记物可从各种来源商购可得。

在许多综述中描述了荧光标记以及它们与核苷酸和/或寡核苷酸的连 接，所述综述包括Haugland，Handbook of Fluorescent Probes and Research  Chemical，第九版(Molecular Probes,Inc.,Eugene,2002)；Keller和Manak，DNA  Probes，第二版(Stockton Press,New York,1993)；Eckstein，编者， Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach(IRL Press,Oxford, 1991)；以及Wetmur,Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 26:227-259(1991)。具体的可应用于本发明的方法学公开于以下文献的实例 中：美国专利号4,757,141、5,151,507和5,091,519。在一方面，一种或多种荧 光染料用作标记，例如，如以下美国专利号所公开的：5,188,934(4,7二氯荧 光黄染料)；5,366,860(光可分解性若丹明染料)；5,847,162(4,7-二氯若丹明染 料)；4,318,846(醚取代的荧光黄染料)；5,800,996(能量转移染料)；Lee等人； 5,066,580(黄嘌呤染料)；5,688,648(能量转移染料)；等。如以下专利和专利 公布所公开的还可用量子点(quantum dots)来进行标记：美国专利号 6,322,901、6,576,291、6,423,551、6,251,303、6,319,426、6,426,513、6,444,143、 5,990,479、6,207,392、2002/0045045和2003/0017264。如本文所使用的，术 语“荧光标记”包括通过一种或多种分子的荧光吸收和/或发射的特性来传递 信息的信号部。此荧光特性包括荧光强度、荧光寿命、发射光谱特征和能量 转移等。

在另一实施方案中，探针识别标记物的能力的检测可在不标记任一测定 组分(探针或标记)的情况下，通过利用例如实时生物分子相互作用分析(BIA) 等技术来完成(参见，如，Sjolander等人(1991)Anal.Chem.63:2338-2345和 Szabo等人(1995)Curr.Opin.Struct.Biol.5:699-705)。如本文所使用的，“BIA” 或“表面等离子共振”是在不标记任何相互作用物的情况下实时研究生物特 异性相互作用的技术(如，BIAcore)。结合表面的质量上的变化(反映了结合 事件)导致表面附近光的折射率的改变(表面等离子共振(SPR)的光学现象)， 产生可用于指示生物分子间的实时反应的可检测信号。

任选地，在另一实施方案中，可用一种或多种目标DNA序列、RNA序 列、蛋白质或多肽，以及探针在液相中作为溶质来进行类似的检测和/或定量 测定。在此测定中，通过许多标准技术的任一，将目标的复合DNA序列、 RNA序列、蛋白质或多肽以及探针从未复合的组分中分离，所述标准技术包 括但不限于：差速离心、色谱、电泳和免疫沉淀。在差速离心中，由于基于 其不同的大小和密度的复合体的沉降平衡不同，可通过一系列离心步骤将目 标DNA序列、RNA序列、蛋白质或多肽/探针的复合体从未复合的测定组分 中分离(参见，例如，Rivas和Minton(1993)Trends Biochem Sci.18:284)。还可 利用标准色谱技术从未复合的分子中分离复合的分子。例如，凝胶过滤色谱 通过在柱形中采用适当的凝胶过滤树脂基于大小来分离分子，例如，相对大 的复合体可从相对小的未复合组分中分离。同样地，目标DNA序列、RNA 序列、蛋白质或多肽/探针的复合体与未复合组分相比相对不同的电荷性质可 开发为，例如通过利用离子交换层析树脂将复合体从未复合组分中区分。此 类树脂和层析技术为本领域技术人员众所周知的(参见，如，Heegaard(1998) J.Mol.Recognit.11:141；Hage和Tweed(1997)J.Chromatogr.B.Biomed.Sci. Appl.12:499)。还可采用凝胶电泳从未结合的组分中分离复合的测定组分(参 见，如，Ausubel等人编辑，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley &Sons,New York,19871999)。在该技术中，例如基于大小或电荷来分离蛋 白质或核酸复合体。为了在电泳过程期间保持结合相互作用，典型地优选在 缺乏还原剂下的非变性凝胶基质材料和条件。对特定的测定及其组分的适当 条件将为本领域技术人员众所周知的。

在某些示例性实施方案中，使用本领域已知的方法，在生物学样品中， 可通过原位和/或体外形式之一来测定目标mRNA序列的水平。许多表达检测 方法使用分离的RNA。对于体外方法，可利用不对mRNA分离进行选择的任 何RNA分离技术来从血细胞中纯化RNA(参见，例如，Ausubel等人编辑， Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York 1987 1999)。此外，使用本领域技术人员众所周知的技术可容易地处理大量细胞 和/或样品，例如，如Chomezynski的一步RNA分离法(1989,U.S.专利号 4,843,155)。

分离的mRNA可用于杂交或扩增测定，其包括，但不限于，DNA或RNA 分析、聚合酶链式反应分析和探针阵列。在某些示例性实施方案中，检测 mRNA水平的诊断法涉及将分离的mRNA与核酸分子(探针)接触，所述核酸 分子可与由将检测的基因所编码的mRNA杂交。该核酸探针可为，例如，全 长cDNA、或其部分，如长度至少7、15、30、50、100、250或500个核苷酸 的寡核苷酸，并足以在严格的条件下与编码本发明的标记物的mRNA或基因 组DNA特异性杂交。本文描述了用于本发明的诊断测定的其它合适的探针。

在一种形式中，mRNA固定在固体表面，并与探针接触，例如通过使分 离的mRNA在琼脂糖凝胶上电泳并将mRNA从凝胶转移至膜，如硝化纤维素。 在可选的形式中，例如，在基因芯片阵列中一个或多个探针固定在固体表面， 而mRNA与该探针接触。技术人员可容易地适应于检测本发明标记物所编码 的mRNA水平的已知的mRNA检测方法。

确定样品中与本发明的标记物相对应的mRNA水平的可选方法涉及核 酸扩增的方法，如，通过rtPCR(在U.S.专利号4,683,195和4,683,202中陈述的 实验性实施方案)、COLD-PCR(Li等人(2008)Nat.Med.14:579)、连接酶链式 反应(Barany,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:189)、自主序列复制(self  sustained sequence replication)(Guatelli等人，1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA  87:1874)、转录扩增系统(Kwoh等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA  86:1173)、Q-β复制酶(Lizardi等人(1988)Bio/Technology 6:1197)、滚环复制(U.S. 专利号5,854,033)或任何其它核酸扩增方法，随后用本领域技术人员众所周 知的技术检测扩增的分子。如果此类分子以非常低的数量存在，那么这些检 测方案对于检测核酸分子特别有用。如本文所使用的，将扩增引物定义为一 对核酸分子，其可与基因的5′或3′区域(分别为正链和负链，反之亦然)退火， 并包含之间的短区域。通常，扩增引物长度为约10至30个核苷酸，侧翼区域 长度为约50至200个核苷酸。在适当的条件下以及用适当的试剂，此引物允 许包含引物侧翼的核苷酸序列的核酸分子的扩增。

对于原位法，检测前无需将mRNA从样品(如，体液(如，血细胞))中分离。 在此类方法中，使用已知的组织学方法制备/加工细胞或组织样品。随后将样 品固定在支持物上，典型地为载玻片，然后与编码标记物的mRNA可杂交的 探针接触。

作为基于目标DNA序列、RNA序列、蛋白质或多肽的绝对表达水平而 进行检测的可选方案，这些检测可基于目标DNA序列、RNA序列、蛋白质或 多肽的标准化表达水平。通过比较目标DNA序列、RNA序列、蛋白质或多肽 的表达与非标记物基因(如，标准品或对照)的表达来校正目标DNA序列、 RNA序列、蛋白质或多肽的绝对表达水平，从而标准化表达水平。该标准化 允许将一个来源的样品与另一来源的样品的表达水平进行比较。

在另一示例性实施方案中，检测蛋白质或多肽。在某些示例性实施方案 中，检测本发明的多肽的试剂为能够结合与本发明的标记物相对应的多肽的 抗体，例如具可检测标记的抗体。抗体可为多克隆的或更优选单克隆的。可 使用完整的抗体或其片段(如，Fab或F(ab′)₂)。关于探针或抗体的术语“标记 的”，意欲包含通过将可检测物质与探针或抗体偶联(即，物理连接)的探针或 抗体的直接标记，以及通过与被直接标记的另一试剂反应的探针或抗体的间 接标记。间接标记的实例包括使用荧光标记的二抗和含生物素的DNA探针的 末端标记来检测第一抗体，以便其可用荧光标记的链霉亲和素来检测。

可通过用选定的蛋白质或多肽免疫适当的受试者来制备多克隆抗体。选 定的蛋白质在免疫了的受试者中的滴度可通过标准技术，例如使用固定化蛋 白质的酶联免疫吸附法(ELISA)，随时间监测。若需要，可从哺乳动物中(如， 从血液中)分离直接抗选定蛋白质的抗体分子并进一步通过众所周知的技术 例如蛋白质A层析来纯化以获得IgG组分。在免疫后适当的时间，如，当抗选 定蛋白抗体的滴度为最高时，可从受试者中获得产生抗体的细胞，并可用来 通过标准技术制备单克隆抗体，该标准技术例如最初由Kohler和Milstein (1975)Nature 256:495-497)所描述的杂交瘤技术(另见，Brown等人(1981)J. Immunol.127:539-46；Brown等人(1980)J.Biol.Chem.255:4980-83；Yeh等人 (1976)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:2927-31；和Yeh等人(1982)Int.J.Cancer 29:269-75)、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等人(1983)Immunol.Today 4:72)、 EBV-杂交瘤技术(Cole等人(1985)，Monoclonal Antibodies and Cancer  Therapy，Alan R.Liss,Inc.，第77-96页)或三源杂交瘤(trioma)技术。生产单 克隆抗体杂交瘤的技术是众所周知的(通常参见R.H.Kenneth，见Monoclonal  Antibodies:A New Dimension In Biological Analyses，Plenum Publishing Corp.， New York，N.Y.(1980)；E.A.Lemer(1981)Yale J.Biol.Med.54:387-402； Gefter等人(1977)Somatic Cell Genet.3:231-36)。简言之，永生细胞系(immortal  cell line)(典型地骨髓瘤)与来自用如上所述的选定的蛋白质免疫的哺乳动物 的淋巴细胞(典型地脾细胞)融合，筛选所得杂交瘤细胞的培养上清液来鉴定 生产与选定蛋白质结合的单克隆抗体的杂交瘤。

可采用各种形式来确定样品是否包含与给定抗体结合的蛋白质。此类形 式的实例包括，但不限于，酶免疫测定法(EIA)、放射免疫测定法(RIA)、蛋 白质印迹分析和酶联免疫吸附法(ELISA)等。技术人员可容易地适应已知的 用于确定是否细胞(如，体液细胞例如血细胞)表达本发明的标记物的蛋白质/ 抗体检测方法。

在一种形式中，可将抗体或抗体片段用于例如蛋白质印迹或免疫荧光技 术的方法来检测表达的蛋白。在此类应用中，通常优选在固体支持物上固定 抗体或者蛋白质。适合的固相支持物或载体包括能够结合抗原或抗体的任何 支持物。众所周知的支持物或载体包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、 葡聚糖、尼龙、淀粉酶、天然和改性的纤维素、聚丙烯酰胺、辉长岩和磁铁 矿等。

本领域技术人员将已知许多其它适合的用来结合抗体或抗原的载体，并 能够将此类支持物适应于本发明。例如，分离自细胞(如，体液细胞例如血 细胞)的蛋白质可在聚丙烯酰胺凝胶上跑电泳并固定在固相支持物例如硝化 纤维素上。随后可用适当的缓冲液洗涤支持物，接着用可检测标记的抗体处 理。然后用缓冲液第二次洗涤固相支持物来除去未结合的抗体。固体支持物 上的结合标记物(bound label)的量可通过常规方法来检测。

在某些示例性实施方案中，本发明的测定可在以下中进行：动物模型(包 括，但不限于马、牛、绵羊、猪、山羊、兔、豚鼠、大鼠、小鼠、沙鼠(gcrbils) 和非人类灵长类动物等)、细胞(如，来自微生物的细胞(如，细菌细胞、染病 毒细胞(viral cell)和酵母细胞等))或无细胞系统(如体外转录测定、体外翻译测 定、细胞裂解物测定和分级的细胞裂解物测定等)。

应理解已描述的本发明的实施方案仅为本发明原理的某些应用的说明。 在不脱离本发明的真实精髓和范围的情况下，可由本领域技术人员基于本文 所提供的教义进行多种修改。为了所有目的，贯穿本申请所引用的所有文献、 专利和公开的专利申请的内容将其全部内容在此引入以作参考。

以下实施例将作为本发明的典型来陈述。根据本公开、图、表和所附权 利要求，这些实施例和其它等价的实施方案将是显而易见的，故不将这些实 施例解释为本发明范围的限定。

实施例1

生物测定用样品的制备

在消化时许多营养制品的活性成分如鱼油被释放。因此必须在试管中模 拟该消化，从而试验鱼油的体外活性(例如细胞培养)。实现这一点有几种方 法，下面描述一种这类方法作为非限制性实例。

鱼油水解

将鱼油(10g.～12mmol)和NaOH(2.16g.54mmol)混合在水(50ml)、无水 乙醇(70ml)和甲苯(10ml)中。将混合物磁力搅拌并在N₂下回流1.5h。将反应 混合物冷却至室温，用1N HCl(81ml)处理并用正己烷(100ml)提取。用乙醇 /水(1:1,v/v)的混合物洗涤有机相直至水相达到pH 5。将分离的有机相经无水 Na₂SO₄干燥，在室温真空下过滤并除去溶剂。所得残留物为鱼油水解物，将 其进行定量组成分析和生物学活性表征。

实施例2

通过实时PCR对生物标记物mRNA的检测

实时PCR为检测特定RNA水平改变的定量方法；因此，在三元复合体抑 制剂的存在下，对于转录上调的前凋亡和肿瘤抑制剂基因的实时PCR为评价 三元复合体的有效性提供快速精确的定量测定，并为由Ω-3脂肪酸诱导的 eIF2α磷酸化检测的有效替代测定。已确定，该新测定还显示出与通过使用 已有的基于ATF-4细胞的测定所获得的那些有显著的相关性，所述基于ATF-4 细胞的测定高度依赖于三元复合体的有效性。因此，根据Ω-3脂肪酸和其它 影响三元复合体起始mRNA翻译的有效性的有益化合物的活性，改进质量控 制和保证食品、营养制品和医药产品的方法。

标准实时PCR测定

1.对于各条件，将在含5至10％胎牛血清或小牛血清的标准培养基例如， 如DMEM或RPMI1640中生长的人、小鼠或大鼠源细胞例如，如大鼠肝细胞、 小鼠或人类成纤维细胞进行铺板(6孔或100mm板的三个孔，或其它容器中)；

2.用待评价的化合物或用对照/标准载体处理；

3.六小时后收集细胞；

4.分离RNA；

5.逆转录RNA；

6.扩增生物标记物mRNA(如，其编码CHOP、BiP、ATF-4、Xbp-1或氨 基酸合成酶)的逆转录本以及18S RNA(内标)的逆转录本；

7.在相对于18S逆转录本标准化后定量生物标记物的逆转录本；

8.横向比较不同处理的样品(如，用试验化合物或载体处理的)的生物标 记物逆转录本的量。

细胞内实时PCR测定

1.铺细胞(如，在96孔板或其它多小室的形式中)；

2.用不同剂量的化合物或载体处理；

3.6小时后裂解细胞；

4.在相同孔内逆转录；

5.在相同孔中扩增生物标记物mRNA(如，其编码CHOP、BiP、ATF-4、 Xbp-1或氨基酸合成酶)的逆转录本和18S RNA的逆转录本；

6.在相对于18S逆转录本标准化后定量生物标记物的逆转录本；

7.横向比较不同处理的样品(如，用试验化合物或载体处理的)的生物标 记物逆转录本的量。

与已有ATF-4测定中所得的结果进行比较，当扩增编码CHOP的mRNA 转录本时所得的结果示于图1。

实施例3

通过报告基因测定的生物标记物基因转录活性的检测

测定食品、营养制品和医药组合物中Ω-3脂肪酸的存在和活性的另一方 法为使用报告基因构建体来测量标记物基因转录活性的上调。根据该方法， 每个此类构建体包含编码报告蛋白(如，荧光素酶、绿色荧光蛋白、红色荧 光蛋白(Red、远Red、dsRed、dsRed2)、橙色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、蓝 绿色荧光蛋白、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶、水通道蛋白、氯霉素乙酰 转移酶或其它产生可检测信号或者具有通过本领域技术人员已知的方法对 检测易感的酶促或其它活性的蛋白质)的核酸序列。可操作地连接到构建体 的报告蛋白编码序列的是天然产生或合成的启动子区，该启动子区在Ω-3脂 肪酸或其它适当的mRNA翻译起始抑制剂，如三元复合体抑制剂的存在下转 录上调。适当的启动子包括，以非限制形式，编码生物标记物例如CHOP、 BiP、ATF-4、Xbp-1或氨基酸合成酶的基因的启动子。在允许发生核酸转录 和mRNA翻译的条件下，用试验样品接触或处理系统。适当的阴性对照包括， 但不限于，未如此接触或处理的平行试验系统，或者用合适的标准样品接触 或处理的试验系统。在试验和对照系统二者中，通过本领域众所周知的方法 检测和定量报告蛋白的功能，比较试验和标准系统中报告子功能的水平来确 定存在于试验样品中的Ω-3脂肪酸的效价。在此测定中，使用ATF-4启动子构 建体或也包括天然ATF-45′UTR的CHOP启动子的构建体所获得的信号比使 用其它启动子所获得的信号增大到更大的程度，这是因为ATF-4在Ω-3脂肪酸 存在下既转录上调又翻译上调。记住，可将报告子构建体设计为对于预期的 源于暴露至试验样品所获得的报告子活性水平来说，保持信号水平在线性范 围内，这取决于其测定前预计的效价，如，基于用样品或可比较的来源所获 得的结果或方法等。

本发明的某些报告子构建体还与高效转录启动子和高效翻译5′UTR，例 如CHOP启动子和ATF-45′UTR相结合，来提供优选几何的信号放大，从而提 供与仅包括两个元件之一的报告子构建体相比有益的信号-噪音比。此报告 子构建体特别用于期望高敏感性的测定，例如当比较处理的初级阶段过程中 通常会遇到的稀释或弱阳性样品或者检测极小的活性时。使用本领域技术人 员已知的方法并如本文所述，启动子和5′UTR可结合至单一报告子构建体中。 有用的启动子包括，以非限定形式，编码生物标记物例如CHOP、BiP、ATF-4、 Xbp-1或氨基酸合成酶等以及其它本领域已知及本文所述的基因的启动子。 有用的5′UTR包括ATF-4、BRCA1mRNAb、CD59、TCTP和GCN4等以及其 它本领域已知及本文所述的。当选择的元件，即5′UTR和启动子对相同或相 似试剂或信号响应时，包括两种元件的有用的报告子构建体特别有利。

实施例4

生物标记物蛋白质翻译增加的检测

为了确定食品、营养制品或医药产品中Ω-3脂肪酸或其它有益试剂的效 价，将mRNA转录本(其包含两个以上ORF的5′UTR序列可操作地连接到编码 报告蛋白的序列上)暴露于允许发生蛋白质翻译的条件下，如动物、细胞或 无细胞翻译系统，例如兔网织红细胞裂解液或包含将mRNA有效翻译成蛋白 质所必需的其它细胞组分的体外系统。该转录本可在系统内生产(如，动物、 细胞或包含报告子构建体和适当的核酸聚合酶如RNA聚合酶的其它混合物 中表达)，或可外源产生并加入系统。系统任选地可包含内源或其它对照报 告子mRNA，该对照报告子mRNA的翻译效率不受该测定要检测的Ω-3脂肪 酸或其它有益试剂存在的影响，从而允许试验和对照的翻译活性水平相对于 试验和对照的翻译可用的转录本的相对量而标准化。任选地，报告mRNA水 平可在各种试验样品和比较的报告子功能水平之间标准化。

对于试验转录本的适当的5′UTR包括，以不限定的形式，编码生物标记 物蛋白例如BRCA1、ATF-4、TCTP、CD59或GCN4的基因或mRNA转录本的 5′UTR。对照转录本的适当的5′UTR可选自编码持家蛋白和/或分别在其 5′UTR中具有一个或更少(即，零)ORF的基因或mRNA转录本。

用食品、营养制品或医药组合物的样品处理或接触以上所述系统，试验 和对照报告蛋白功能的量(如，在试验样品中；试验样品和未处理样品之间； 试验样品和用对于Ω-3脂肪酸或其它有益试剂的效价的标准处理的样品之 间)，通过本领域众所周知的方法检测并定量，其中提高的报告子功能的水 平与试验报告子mRNA的翻译活性以及因此与包含于试验样品中的Ω-3脂肪 酸或其它有益试剂的效价正相关。

实施例5

来自鱼油的质量控制的营养制品和其它产品的制造

如上所述，鱼油是Ω-3脂肪酸的重要来源；然而，在这些有益化合物的 含量和生物活性上鱼油的供给彼此间很不相同。本发明提供制造鱼油来源的 产品的方法，该产品具有已知的、均一的Ω-3脂肪酸的生物活性。

鱼类被捕获，当活的或新杀的，在食品级制造条件下压榨以从鱼肉中有 效提取油类。通过过滤、螯合和/或其它相关领域技术人员已知的方法将重金 属和其它环境污染物除去。任选地，随后可进一步加工鱼油以例如改善口感、 香味和/或外观，以加入其它有益试剂(包括，以不限定的形式，植物甾醇或 其它有益化合物)或以浓缩Ω-3脂肪酸和/或其它有益试剂。任选地，可将未处 理、部分处理(如，解毒的)、分级或其它加工的鱼油包装于，例如瓶子或其 它非消耗性容器，或消耗性容器例如食品或药物级胶囊，如凝胶类胶囊(gel  capsule)或片剂(caplet)。任选地，可将包含于鱼油中的Ω-3脂肪酸和/或其它有 益试剂富集、部分纯化或甚至全部纯化，即分离。

在一个以上的上述的制造阶段，使用本文前述实施例中所描述的方法来 测定鱼油、半成品或成品影响一个以上编码生物标记物例如ATF-4、CHOP、 BiP、Xbp-1或氨基酸合成酶的基因的转录增加，或任选地，在5′UTR(其包括， 以不限定的形式，来自编码生物标记物例如BRCA1、ATF-4、TCTP、CD59 或GCN4的mRNA的5′UTR)包含两个以上ORF的mRNA的翻译增加的能力。 在制造早期所获得的测定结果可使在进一步的生产步骤期间对Ω-3脂肪酸的 浓度进行调整成为可能，或者可在其它方面指导产品组分的组装、混合或配 制以产生Ω-3脂肪酸的生物活性效价已知的食品、营养制品或医药产品。任 选地，成品的样品(如，等分(aliquot)液体或粉末、或单一片剂，各自代表从 中取出或筛选的各大批或小批)可在分销前测定，从而能够根据产品所具有 的有益的生物学、营养或医药特性水平，如，相对于抑制翻译起始、或与生 物标记物基因转录或mRNA翻译的抑制、上调或其它调节相关的治疗或预防 性质进行标记或使其它要求市场化。

实施例6

开发稳健、灵敏的以细胞为基础的测定，以使得营养制品级鱼油(NFO)制剂 /大批的抗癌生物活性定量。

研究设计：

表达突变体(eIF2α-S51A EPA-抗性)或野生型(eIF2α-WT₂EPA-敏感性) eIF2α的转基因人前列腺癌细胞系的产生。

目的：为了确定人前列腺癌细胞系中eIF2α的磷酸化与n-3PUFAs抗癌活 性之间的因果关系。将细胞设计为分别在内源eIF2α缺失下表达非可磷酸化 突变体(eIF2α-S51A)或重组野生型eIF2α(eIF2α-WT)以及红色荧光蛋白或绿 色荧光蛋白。为了区别重组eIF2α蛋白和内源eIF2α蛋白，将重组eIF2α的N- 末端标记有血凝素(HA)标签来确保重组eIF2α(S51A突变体或WT)与荧光蛋 白的共表达。使用近来公开的技术，其中两种蛋白质可以1:1的比例翻译。这 通过将它们的编码序列作为一个单顺反子mRNA克隆来完成，条件是这两种 蛋白质的氨基酸序列被蛋白酶2A切割位点分隔。换言之，由一个开放阅读框 (ORF)翻译的前体蛋白(pro-protein)被蛋白酶2A切割而产生HA标记的eIF2α (WT或S51A)以及RFP或GFP蛋白。在本文的具体构建体中，由蛋白酶2A裂 解构建的HA标记的天然eIF2α和具有蛋白酶2A识别序列的荧光蛋白融合体。 为了用shRNA沉默内源eIF2α而不影响重组eIF2α(WT或S51A)，将eIF2α基因 的所有5’和3’UTR元件从质粒中切除。

实验设计：本设计需要用暂时调控的重组eIF2α(WT或S51A)蛋白质替换 内源eIF2α。为了完成该设计，利用pLVTHM慢病毒载体(lentiviral vector)。 该载体包含用于表达哺乳动物细胞中的ORF的控制人延伸因子1启动子的盒 和用于shRNA介导的基因沉默的控制病毒性LTR/SIN的盒。使用与GFP串联 连接的eIF2α-WT和与RFP编码序列串联连接的eIF2α-51A。蛋白酶2A切割位 点插入eIF2α(WT或S51A)和荧光蛋白之间。RFP和GFP用于标记细胞。选择 这两种报告子(reporters)是因为它们能够在体内或体外使用适当的过滤器在 显微镜下容易地区分。为优化翻译，ORF以完美的Kozak共有序列 (GCCACCATGG)为先导。为了鉴定最好的靶向内源eIF2α而不是重组eIF2α 的shRNA序列，选择靶向内源eIF2α的5’或3’UTR的几种候选慢病毒shRNA， 使用免疫印迹分析来评价各shRNA。通过这些研究可证实，shRNA序列之一， shRNA#1098，使内源eIF2α表达几乎全部消除。该shRNA克隆至pLVTHM载 体的shRNA表达盒中。

将内源eIF2α的表达用重组蛋白(eIF2α-S51A或eIF2α-WT)替换的转基因人 前列腺癌细胞系的产生。

用编码eIF2α-S51A或eIF2α-WT以及RFP的pLVTHM载体转导人PC-3前 列腺癌细胞系，并且通过FACS分选来选择表达类似的RFP水平的细胞。扩增 细胞，并且使用高分辨率SDS-PAGE电泳和免疫印迹分析利用识别内源和重 组eIF2α的山羊抗-eIF2α抗体和共轭抗山羊抗体的Alexa-68表征相对于内源 eIF2α的转基因eIF2α(WT或S51A)的表达。用上述慢病毒载体转导的前列腺 癌细胞表达两种eIF2α亚型，一个是较快迁移蛋白，对应于内源eIF2α，一个 是较慢迁移蛋白，对应于标记的重组eIF2α(HA标签添加约1.5kd)。通过用单 克隆抗HA抗体和共轭抗小鼠抗体的Alexa-800的同一凝胶进行印迹来证实该 较慢迁移蛋白的确为转基因eIF2α(未示出)。由于抗-eIF2α抗体可识别内源和 重组eIF2α，推测是具有相同的亲和性，内源和重组eIF2α的相对表达可通过 免疫印迹分析利用单一的抗-eIF2α抗体来定量。

用编码eIF2α-S51A/RFP或eIF2α-WT/RFP以及shRNA#1098的pLVTHM 载体转导PC-3人前列腺癌细胞系，将细胞裂解液用抗-总eIF2α或β-肌动蛋白 抗体印迹。图1中，泳道1为用无shRNA的pLVTHM载体转导的细胞，泳道2 和3为用包含eIF2α-WT或eIF2α-S51A ORF以及shRNA#1098盒的pLVTHM载 体转导的细胞。用无shRNA插入的pLVTHM载体转导的细胞表达大致与内源 eIF2α差不多的重组蛋白。

内源eIF2α蛋白的表达在用包含shRNA#1098的pLVTHM载体转导的细 胞中极大地降低。该病毒性载体组成性地降低内源eIF2αmRNA表达～85％ (图2)。这些数据表明，内源eIF2α成功地被重组eIF2α(WT或S51A突变体)替 换，同时维持总体eIF2α水平尽可能地接近于亲本细胞中的水平。

表征转基因细胞系对EPA-诱导的eIF2α磷酸化的响应。EPA引起内源IF2α 和重组eIF2α-WT二者的磷酸化但不引起重组eIF2α-S51A的磷酸化(参见例如 图3的EPA的作用)。结果，EPA引起母本或重组eIF2α-WT表达细胞中显著的 eIF2α的磷酸化，而不引起重组eIF2α-S51A表达细胞中显著的eIF2α的磷酸化。

用靶向内源eIF2α表达的重组eIF2αRFP和shRNA(#1在内源而不是重组 mRNA的3’UTR的1098位)表达载体转导的母本PC-3细胞(MAT)或PC-3细胞 在EPA浓度渐增的情况下培养。净细胞增殖在诱导五天后通过SRB测定来定 量，并表示为用培养基处理的对照细胞的百分比。如图4所示，表达重组 eIF2α-WT的PC-3细胞以剂量依赖的方式对EPA引起的细胞增殖抑制敏感，而 表达重组eIF2α-S51A的那些细胞是抗性的。

总之，本文已描述了以细胞为基础的测定，利用分子工程细胞 (molecularly engineered cells)测量通过eIF2α-介导的翻译起始的抑制来发挥 生物学活性的Ω-3浓缩物或其它营养制品的翻译起始抑制特异活性。该测定 精确且灵敏，因为它们是在内源eIF2α活性缺失下测量样品中的活性。

这些发现证实了，本文公开的转基因人癌细胞是用于评价诱导eIF2α磷 酸化的本发明营养制品和Ω-3浓缩物的生物学活性以及用于定量控制此类制 剂的优异工具。

PC-3eIF2α-WT(菌株351)和PC-3eIF2α-S51A(菌株411)细胞培养物在 2012年6月22日保藏于美国模式培养物保藏中心(American Type Culture  Collection,ATCC Manassas,VA)，并分别收到ATCC登录号PTA-13010和 PTA-13011。

本发明的以细胞为基础的测定如下进行：

细胞：将约1000和约2000之间的eIF2α-S51A或eIF2α-WT细胞在约37℃ 的温度下培养于96孔板的各孔中约1天。

培养基：完全(添加5％胎牛血清)组织培养培养基RPMI-1640(Invitrogen, CA)

材料：

96孔组织培养板

磺酰罗丹明B(Sulforhodamine B)染料(SRB,0.57％v/w,Sigma,IL)

三羧酸乙酸(Tricarbocilicacetic acid)(TCA,10％,Sigma IL)

冰醋酸(1％,Sigma,IL)

10mM Tris碱(Sigma,IL)

100mM化合物原液(compound stock)

制备/铺板细胞

癌细胞生长至80％覆盖率(confluency)

根据标准步骤胰蛋白酶化

中和胰蛋白酶，分离细胞并计数。

相对于96孔板的各孔以100μl培养基铺板1000个细胞

孔的边缘留空(Leave wells at the edges empty)

4个化合物需要1个板

在另一板上铺板细胞(每细胞系12孔)，将其标记为“第0天”板

添加化合物(第二天)

添加50μl的10％TCA至第0天板，4℃储存

在培养基中制备40、12、3.6、1.62和0(溶剂)μM的化合物

保持溶剂(DMSO)浓度在整个稀释中相同

将100μl的各化合物稀释液添加至细胞系的各板中的三个孔

化合物终浓度为20、6、1.8、0.54和0μM

将细胞放回培养箱

添加化合物5天后添加100μl的10％TCA

4℃下培养最低1h。

SRB染色

根据Vichai和Kirtikara(Nature Methods 2006,vol 1:1112-1115)的步骤

a)细胞染色

从冷室中移出细胞

倒出内容物

用一次蒸馏的H₂O洗涤四次

除去过量的H0

将板干燥(吹干或晾干)

向各孔添加100μl 0.057％SRB溶液

室温培养30min

倒出干燥物

用1％醋酸洗涤四次

晾干板

b)测量OD

向各孔添加200μl 10mM TRIS-碱(～pH 10.5)

振荡板5-10min

读取酶标仪中510nM下的OD

计算细胞生长抑制的百分比，％细胞生长控制＝

((平均OD样品-平均OD第0天)/(平均OD介质-平均OD第0天))×100

％生长抑制＝100-％对照细胞生长

本测定使用用于比较目的标准品，其为预先测定的营养制品或预定量的 EPA。制备eIF2α-S51A细胞并用作用于独立于eIF2α抑制细胞增殖的物质的阴 性对照。图4为标准曲线的实例。标准曲线示出增殖抑制量与本发明的营养 制品或EPA的量成比例。因为增殖抑制度与本发明的营养制品的量成比例因 此每个测定进行标准化来确定样品中的活性量。