碳酸酐酶IV在制备肺腺癌诊断制剂中的应用

摘要

本发明涉及碳酸酐酶IV在制备肺腺癌诊断制剂中的应用。发明通过对肺腺癌高通量转录组数据进行Meta分析，获得差异表达基因，运用分析工具对差异表达基因进行功能分析，进而筛选出候选基因，并运用经典分子生物方法验证了碳酸酐酶IV与肺腺癌的相关性，碳酸酐酶IV可用于制备肺腺癌辅助诊疗制剂，具有重要的临床应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及碳酸酐酶IV在制备肺腺癌诊断制剂中 的新用途。

背景技术

碳酸酐酶(carbonic anhydrase，CA)是一类含锌的金属酶，其功能是催化 二氧化碳的水合和碳酸的水解，对二氧化碳的运输、水电解质和pH平衡有重要 的调节作用。目前至少已经发现15种不同类型的碳酸酐酶同工酶，其中碳酸酐 酶III和IV的活性相对较强，碳酸酐酶IV主要存在于脂肪组织、肝脏、心肌和 慢骨骼肌纤维中，其自身抗体已经分别在系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎和糖 尿病人中被检测到，同时IV型抗碳酸酐酶抗体在肾脏疾病体液免疫方面的发生 发展中起到了重要作用。

肺腺癌(lung adenocarcinoma)又称非小细胞肺癌(NSCLC)，是肺癌的一种。 不同于鳞状细胞肺癌，肺腺癌较容易发生于女性及不抽烟者。在肺部的位置常较 周边，肿瘤扩大的速度较慢(倍增时间约120天)。早期无征兆，通常诊断出来 时已经是晚期。非小细胞肺癌占肺癌总数的75％-80％。近年来很多学者从细胞、 分子水平来阐明与其发病相关等方面的因素进行研究，以期对其发生机理及侵袭、 复发相关性作出预测并指导临床治疗。研究发现，有多种因素共同参与肺腺癌的 发病机制，包括癌基因突变及活性表达、抑癌基因的缺失和突变以及生长因子异 常表达、信号紊乱等。此外，对肺腺癌的发病机制的研究表明信号转导通路在肿 瘤的发生、发展和转移中起重要作用。同时，由于体内各种调控机制复杂多变、 影响因素众多，故尽管关于肺腺癌发病的分子机理研究不断开展且取得了不少新 进展，但其确切的机理尚待阐明，很可能涉及多通路参与调控。

本发明对已发表的肺腺癌高通量转录组数据进行Meta分析，获得1063个差 异表达基因，其中表达水平上调的基因464个，表达水平下调的基因599个，并 利用KEGG、GO、OMIM等各种生物学信息数据库和MATLAB等分析工具对 差异表达基因进行功能分析，进而筛选出候选基因carbonic anhydrase IV(CA4)， 并进一步采用分子生物学方法证实了CA4基因与非小细胞肺癌的关系：CA4与 非小细胞肺癌具有很好的相关性，可用于制备非小细胞肺癌辅助诊断或者预后制 剂，具有重要的临床应用价值。

发明内容

本发明目的是提供了CA4在制备肺腺癌诊断制剂中的新用途。

为实现上述目的，本发明对已发表的肺腺癌高通量转录组数据进行Meta分 析，获得1063个差异表达基因，其中表达水平上调的基因464个，表达水平下 调的基因599个，并利用KEGG、GO、OMIM等各种生物学信息数据库和 MATLAB等分析工具对差异表达基因进行功能分析，进而筛选出影响肺腺癌发 生发展的关键基因和重要的信号通路，另外基于数据挖掘分析的结果，筛选出候 选基因CA4和RAMP3。进而，本发明通过荧光定量PCR方法在5例肺腺癌患病 病人的癌组织和5例正常组织为样本验证筛选到的肺腺癌致病基因CA4和 RAMP3在肺腺癌患病病人的癌组织和正常组织的表达情况，结果显示CA4和 RAMP3在肺腺癌患病病人的癌组织中表达均下降，但是CA4基因表达下降更显 著。

本发明目的是提供了一种肺腺癌检测试剂盒，所述的检测试剂盒检测CA4 基因。进一步的，所述的试剂盒还包括其他检测试剂。

进一步，所述的检测试剂盒为检测上述CA4表达水平的荧光定量PCR试剂 盒。优选采用引物对为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。

进一步，该PCR试剂盒适合于目前存在市场上的所有类型荧光定量基因扩 增仪，灵敏度高，定量快速准确、稳定性好，具有良好的应用前景。

进一步，上述荧光定量PCR试剂盒组分包括：特异性引物、内参引物、荧 光定量PCR反应液。其中所述的特异性引物包括上游引物和下游引物，上游引 物序列为SEQ ID NO.1，下游引物序列为SEQ ID NO.2。所述内参引物为β-actin 内参引物，上游引物序列为SEQ ID NO.3，下游引物序列为SEQ ID NO.4。

本发明还公开了一种检测肺腺癌的荧光定量PCR试剂盒的使用方法，荧光 定量PCR体系：上游引物；下游引物；样品RNA 10pg-100ng；PowerGreen  PCR Master Mix(invitrogen，货号4367659)，加RNase-Free Water至25μL。荧 光定量PCR程序：95℃10min预变性，接30-40个循环：95℃5-30s，60℃30-90s。

所述的试剂盒还包含RNA抽提试剂。优选Reagent(invitrogen，货 号15596-018)进行样本RNA提取。

本发明还检测了本试剂盒灵敏性，结果显示本试剂盒检测范围为 10⁶-10²copies/μl，最小检出浓度为100copies/μl。

本发明目的是提供了一种肺腺癌检测试剂盒，所述的检测试剂盒检测CA4 蛋白。进一步的，所述的试剂盒还包括其他检测试剂。

进一步，所述检测试剂盒为检测CA4蛋白的ELISA检测试剂盒。所述试剂 盒中的抗体可采用市售的CA4单克隆抗体。进一步，所述的试剂盒包括：包被 CA4单克隆抗体的固相载体，酶标二抗，酶的底物，蛋白标准品，阴性对照品， 稀释液，洗涤液，酶反应终止液等，优选HRP标记的IgG抗体、辣根过氧化物 酶。

进一步，所述检测试剂盒为检测CA4蛋白的胶体金检测试剂盒，所述的抗 体可采用市售的CA4单克隆抗体。进一步，所述的胶体金检测试剂盒采用胶体 金免疫层析技术或胶体金渗滤法。进一步，所述的胶体金检测试剂盒硝酸纤维素 膜上的检测区(T)喷点有抗CA4单克隆抗体、质控区(C)喷点有羊抗鼠免疫球蛋 白IgG。

本发明目的是提供CA4基因和/或CA4蛋白在制备肺腺癌的诊断或者预后产 品中的应用。

本发明首先分别提取了5例肺腺癌患病病人的癌组织和5例正常组织，对其 总RNA的进行提取，设计了用于扩增CA4基因的2条引物SEQ ID NO.1和SEQ  ID NO.2，用于扩增内参基因β-actin的2条引物SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。 制备了含有CA4基因序列的标准DNA模板，并进行了敏感性实验。进而，采用 qRT-PCR的方法比较CA4基因在肺腺癌组织和正常组织中的表达水平。结果表 明：qRT-PCR扩增结果稳定，其中CA4在正常组织中的表达水平明显高于肺腺 癌癌组织，实验结果验证了生物信息学筛选结果。进一步，发明人在116例肺腺 癌患病病人的癌组织及癌旁组织中检测CA4基因表达情况，结果显示115例肺 腺癌患病病人的癌组织中CA4基因表达低于癌旁组织中的表达，检出准确率达 99％，即CA4基因与肺腺癌具有很好的相关性，可用于制备肺腺癌辅助诊断或 者预后制剂。

附图说明

图1CA4基因荧光定量扩增曲线图

图2CA4基因荧光定量溶解曲线图

图3CA4基因在癌组织及正常组织中相对表达量图

图4RAMP3基因荧光定量扩增曲线图

图5RAMP3基因荧光定量溶解曲线图

图6RAMP3基因在癌组织及正常组织中相对表达量图

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解 为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和 宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范 围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常 按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。

实施例1肺腺癌高通量转录组数据Meta分析

GEO(Gene Expression Omnibus)数据库是由NCBI(美国国立生物技术信 息中心)开发维护，GEO数据库作为最大的基因表达数据的数据库，该数据库 以芯片数据为主，此外亦包含一些非芯片类型的数据如SAGE(基因表达系列分 析)数据、SARST(核糖体序列标签连续分析)数据、MS(质谱)数据、蛋白质组 数据和新一代高通量测序数据(MPSS，大规模平行测序技术)等。检索采用关键 词为("lung adenocarcinoma"[MeSH Terms]OR"lung adenocarcinoma"[All Fields]) AND"Homo sapiens"[porgn]。限制研究类型为“expression profiling by array”符合 以下标准的数据集将纳入我们的研究中：①所选数据集必须是全基因组的表达 mRNA转录组数据②这些数据来自于肺腺癌病例组和对照组的活检组织或培养 的细胞；③本研究均考虑经标准化或者原始数据集；经筛选将15套数据集纳入 我们的研究中(见表1)。

表1 15套肺腺癌全基因组数据集的基本情况

通过转录组数据分析软件对原始数据进行背景校正和标准化后，利用微阵列 显著性分软件(significance analysis of microarray，SAM)对15套基因芯片的结 果进行归一化处理后进行t-test，筛选差异表达基因，分析过程中设定假阳性率 (false discovery rate,FDR)为≤0.01，共筛选出1063个差异表达基因，其中表达 水平上调的基因464个，表达水平下调的基因599个。为了更好的研究差异表达 基因的功能，我们通过DAVID对差异表达基因进行GO功能富集和KEGG通路 富集，另外我们对表达上调的基因和下调的基因分别进行GO功能富集。最终我 们挑选2个下调基因RAMP3(eceptor(G protein-coupled)activity modifying protein 3)和CA4(carbonic anhydrase IV)作为候选基因进行经典的分子生物学实验验 证。

实施例2肺腺癌组织及正常组织RAMP3和CA4基因表达情况

一材料和方法

1、材料

收集5例肺腺癌癌组织及5例正常组织，对其进行分组及编号。

2、方法

2.1肺腺癌组织及正常组织总RNA的提取

采用Reagent(invitrogen，货号15596-018)进行样本RNA提取， 实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：

收集样本后冻存于液氮，取出后把组织放入已预冷的研钵中进行研磨，待组 织样本成粉末状后：

①加入Trizol，室温保存5分钟；

②加氯仿0.2ml，用力振荡离心管，充分混匀，室温下放置5分钟-10分钟；

③12000rpm高速离心15分钟后吸取上层水相(吸70％)到另一新离心管管中, 注意不要吸到两层水相之间的蛋白物质。移入新管,加入等体积的-20℃预冷异丙 醇,充分颠倒混匀，置于冰上10分钟；

④12000rpm高速离15分钟后小心弃掉上清液，按I ml/ml Trizol的比例加入 75％DEPC乙醇洗漆沉淀(4℃保存)，洗漆沉淀物，振荡混合，4℃下12000rpm 高速离心5分钟；

⑤弃去乙醇液体，室温下放置5分钟以充分晾干沉淀,加入DEPC处理过的水 溶解沉淀；

⑥用Nanodrop2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度,冻存于-70℃。RNA 质量判定标准：RNA样本的OD260/OD280值为1.7-2.2之间；总RNA电泳图谱 有清晰的28S、18S条带；70℃水浴保温1小时后的电泳图谱与水浴保温前的图 谱无明显差异。

2.2逆转录合成cDNA

采用III Reverse Transcriptase(invitrogen，货号18080-044)进 行cDNA反转录，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：

使用逆转录试剂盒,用逆转录缓冲液对lμg总RNA进行逆反录合成cDNA。采用 25μl反应体系，每个样品取1μg总RNA作为模板RNA,在PCR管中分别加入 以下组分：

5×逆转录缓冲液5μl，10mmol/l dNTP 1.25μl，0.1mmol/l DTT 2.5μl，30μmmol/l  Oligo dT 2μl,200U/μl MMLV 1.25μl，模板RNA 1μg，加入灭菌水至总体系25μl。 42℃孵育1小时,72℃10分钟,短暂离心。cDNA保存放-20℃冰箱备用。

2.3Real-Time PCR

2.3.1仪器及分析方法

用ABI 7500型荧光定量PCR仪，采用2-△△CT法进行数据的相对定量分析。 2.3.2引物设计

采用在线引物设计软件，引物设计后由invitrogen公司合成。具体引物序列 如下：

表2引物序列

操作过程如下：

(一)反应体系：用PowerGreen PCR Master Mix(invitrogen，货号 4367659)进行扩增，实验操作按产品说明书进行。扩增程序为：95°10min，(95℃ 15sec，60℃60sec)×45个循环。

表3 RealTime反应体系

组分 加入量 2×mix 10μl 上游引物(10uM) 0.5μl 下游引物(10uM) 0.5μl 模板 2μl 加入灭菌蒸馏水 至25μl

(二)引物筛选

将各样本cDNA混合后，以此为模板进行5倍梯度稀释，稀释后样品各取2μl 作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增，同时在60-95℃进行融 解曲线分析，根据扩增效率高和溶解曲线单峰原则进行引物筛选。

(三)样品RealTimePCR检测

将各样品cDNA 10倍稀释后取2μl作模板，分别用目的基因引物和内参基因 引物进行扩增。同时在60-95℃进行溶解曲线分析。

二实验结果

CA4与RAMP3实时定量PCR扩增曲线(分别见图1和图3)拐点清楚，扩 增曲线整体平行性好，表明各反应管的扩增效率相近，极限平而无上扬现在，曲 线指数期斜率较大，说明扩增效率较高；样本扩增产物溶解曲线CA4(见图2) 和RAMP3(见图4)都是单峰，说明扩增产物只有一条，为特异性扩增；根据 qRT-PCR的相对定量公式：2-ΔCt×100％，比较CA4与RAMP3基因在肺腺癌组 织和正常组织中的表达水平。结果显示(具体见图5)：qRT-PCR扩增结果稳定， 其中CA4与RAMP3在癌组织中的表达水平都低于正常组织，CA4基因表达下调 较RAMP3基因更加明显，以上结果验证了高通量转录组表达数据的整合分析 CA4与RAMP3在非小细胞型肺癌组织中低表达的结果。

实施例3肺腺癌癌组织及癌旁组织CA4基因表达情况

一材料和方法

1、材料

非小细胞型肺癌取自于2005年-2010年住院病例，取134例肺腺癌癌组织及 癌旁组织，对其进行分别编号。

2、方法

参考实施例2中的实验方法。

二结果

116例肺腺癌样品中，115例样品中CA4在癌组织中的表达水平低于癌旁组 织，仅有1例样品中CA4在癌组织中的表达水平与癌旁组织没有明确区别，准 确率为99％，表明CA4基因与肺腺癌具有很好的相关性，可用于制备肺腺癌辅 助诊断或者预后制剂。

实施例4一种检测肺腺癌中CA4基因的检测试剂盒

试剂盒组分：

本发明采用生物信息学结合分子生物学实验验证，筛选出肺腺癌致病相关基 因CA4，并提供了检测CA4表达水平的荧光定量PCR试剂盒，既方便临床使用， 又保证了结果的一致性，具有很好的临床应用前景。