一株高产纤维素酶的黑曲霉

摘要

本发明公开了一株高产纤维素酶的黑曲霉，本发明属于黑曲霉领域，特别涉及高产纤维素酶的黑曲霉菌株。本发明所提供的黑曲霉(Aspergillusniger)，该菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.7927。发酵罐实验跟踪的各项性能指标表明，该菌株代谢正常，产纤维素酶能力强，是一株优良的纤维素酶高产菌株。

说明书

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，具体是一株高产纤维素酶的黑曲霉。

背景技术

纤维素酶是指能水解纤维素的β-1，4糖苷键，使纤维素降解为纤维二糖和葡萄糖 的一组酶的总称，是由多个水解酶组成的复杂酶系。该酶主要由外切β-葡聚糖酶、 内切β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和滤纸酶组成。纤维素酶主要由真菌、细菌和放线菌 等微生物产生。由于纤维素酶能将环境中广泛存在的纤维素质原料如秸秆、稻草、木 屑等水解为葡萄糖，因此纤维素酶在纺织、饲料、发酵工业、食品和环境工程等领域 具有巨大的市场潜力，甚至在中国完全有可能成为第一大酶种，因此纤维素酶是酶制 剂工业中的一个新的增长点。

目前对纤维素酶产生菌的研究大多数集中于木霉属，而木霉属由于存在安全性， 在食品和饲料上的应用受到限制。而黑曲霉是一种纤维素酶的产生菌，具较好的安全 性，所以目前国内外对其产纤维素酶能力的研究报道逐渐增多。如1996年赵小立等 以黑曲霉为出发菌株，采用铜蒸汽激光诱变处理获得了4株高产的突变菌株，每克湿 曲的最高酶活：cmc酶活为2839mg葡萄糖/g·h、滤纸酶活为299mg葡萄糖/g·h、β- 葡萄糖苷酶活为1091mg葡萄糖/g·h【钱育军等，黑曲霉产纤维素酶菌种的激光选育. 中国激光，1996(07)：第667-672页】。2007年胡立明等通过液体深层发酵方法研究 黑曲霉产酶条件进行研究，获得的最佳产酶条件为：纤维素粉3％、硝酸钾3％、聚 乙二醇0.1％，初始pH6.5，接种量10％、32℃培养5d，纤维素酶各组分酶活力 分别为：滤纸酶活力、CMC酶活和β-葡萄糖苷酶活力分别为24.52U/mL、20.63U/mL 和6.89U/mL【胡立明等，黑曲霉产纤维素酶液体发酵条件的研究.河南工业大学学 报(自然科学版)，2007(01)：第70-74页】。2012年杜晓梅等以啤酒糟为主要原料，采 用黑曲霉3.316(Aspergillus niger3.316)固态发酵生产纤维素酶，对培养基组成和培 养条件进行优化。结果表明：啤酒糟和麸皮的质量比为8：2、水料质量比为1.5：1、 硫酸铵质量分数为3％、发酵时间为4d时，所产纤维素酶活性最大，滤纸酶活性和羧 甲基纤维素酶活性分别达72.6118和692.1700nkat【杜晓梅等，黑曲霉3.316固态 发酵啤酒糟生产纤维素酶.青岛科技大学学报(自然科学版)，2012(03)：第263-268 页】。

虽然众多的研究者对应用黑曲霉生产纤维素酶进行了研究，但如何提高纤维素酶 的活力仍然是一个亟待解决的难题。该难题的解决对于开阔其应用领域和市场份额具 有重要的的意义。

发明内容

本发明提供一种产高活力纤维素酶的黑曲霉。

本发明提供的黑曲霉Aspergillus niger Li-2013-03是由实验室保藏的一株产纤 维素酶的黑曲霉AspergillusnigerLi-2010经亚硝基胍多轮诱变筛选，然后对优良菌 株经发酵性能测试筛选得到产高活力纤维素酶的黑曲霉菌株Aspergillus niger  Li-2013-03。

本发明提供的产高活力纤维素酶的菌株具体为黑曲霉Aspergillus niger  Li-2013-03。该菌株已于2013年7月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 邮编100101)，保藏号为CGMCC NO.7927。

本发明黑曲霉菌株Aspergillus nigerLi-2013-03(CGMCC No.7927)具有以下微 生物学特征：

1、形态学特征：

黑曲霉菌株CGMCC No.7927，生物学形态为包括分生孢子、胞梗、顶囊、产 胞结构等几部分。分生孢子头球形至辐射形，直径150-450μm，分生孢子梗发生于 基质。胞梗茎1000-3000(长度)×12-20(直径)μm，黄色或黄褐色，壁平滑；顶囊球形 或近似球形，直径45-75μm，表面全面可育；产胞结构双层，梗基10-20(长 度)×4.5-7.0(直径)μm，瓶梗6-10(长度)×2.5-3.5(直径)μm，分生孢子球形或近球形， 直径3-4.5μm，褐色，壁粗糙。

2、培养学特征：

菌株在麦芽汁琼脂培养基上生长迅速，28℃4天孢子可铺满斜面；质地丝绒状或 稍带絮状；分生孢子结构大量，褐黑色，无渗出液；菌落反面略带黄色。

3、生理生化特征：

黑曲霉菌株CGMCC No.7927可在玉米秸秆、稻草、木屑、马铃薯、玉米粉、 可溶性淀粉、糖蜜等碳源上生长，最适pH范围5-6，最适生长温度范围28-33℃， 最适产酶温度范围28-30℃。

本发明黑曲霉菌株CGMCC No.7927的筛选技术路线为：出发菌株→斜面培 养→孢子悬液的制备→诱变处理→平板分离→初筛→复筛→遗传稳定性测定→扩大 实验(发酵性能测定)。

按诱变筛选方案，对突变株逐级筛选淘汰，最后对优良菌株经发酵性能测试筛选， 得到一株高产酶性能菌株黑曲霉菌Aspergillus nigerLi-2013-03，发酵96小时后纤 维素酶的外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和滤纸酶活力分别达到 620U/mL、1289U/mL、456U/mL和732U/mL。

有益效果：本发明提供的黑曲霉Aspergillus nigerLi-2013-03具有纤维素酶产量 高的优点，经筛选过程培养基优化，与出发菌株相比生长迅速，28℃发酵4天直径 75mm，发酵液纤维素酶的的外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和滤 纸酶活力分别达到620U/mL、1289U/mL、456U/mL和732U/mL，分别比出发菌株 提高了9.21倍、7.43倍、8.15倍和10.31倍。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段 均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本 发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言， 在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各 种改变或改动也属于本发明的保护范围。

本发明提供的黑曲霉菌株Aspergillus nigerLi-2013-03是由实验室保藏的一株 产纤维素酶产的黑曲霉Aspergillus nigerLi-2010经多轮亚硝基胍诱变，然后对突变 株逐级筛选淘汰，最后对优良菌株经发酵性能测试筛选得到产高活力纤维素酶的黑曲 霉菌株Aspergillus nigerLi-2013-03。

本发明提供的产高活力纤维素酶的菌株具体为黑曲霉Aspergillus niger  Li-2013-03。该菌株已于2013年7月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 邮编100101)，保藏号为CGMCC NO.7927。

产高活力纤维素酶菌株的筛选方法，包括以下步骤：

1)斜面培养：将原始黑曲霉菌株Aspergillus niger Li-2010划线接种斜面培养 基，30℃培养2～3d，直至菌丝体成熟、产大量黑色孢子。所述斜面培养基组成如下： 12°Brix麦芽汁1000mL，pH值自然，121℃灭菌20min；

2)孢子悬液制备(以下步骤均在无菌条件下操作)：向试管斜面加入15mL无菌 水，把孢子刮下，用滤纸过滤，将滤过液倒入已灭菌、并加有5-10粒无菌玻璃珠的 150mL三角瓶中，将三角瓶放入摇床振荡10-15min，使孢子分散。

3)亚硝基胍(NTG)诱变

A.用无菌水将孢子悬浮液调节为稀释成10⁶-10⁷个/mL。

B.取10mL菌悬液转移至100mL三角瓶中，加入10mg的NTG，配制成终浓 度为10mg/mL的NTG溶液，并加入4-5滴丙酮，以利于NTG溶解。

C.在30℃下200rpm振荡反应30min，5000rpm离心10min收集菌体，用无 菌生理盐水洗涤数次，中止反应。

D.适当稀释将孢子浓度调节为10³个/mL，取最后稀释度的菌液0.2mL，稀释涂 布于纤维素-刚果红平板筛选培养基上。在30℃培养2～3天后挑取透明圈/菌 落直径较大的菌株200支。(所述纤维素-刚果红平板筛选培养基组成如下： 纤维素粉10g、刚果红0.2g、硫酸铵5g、硫酸镁0.25g、磷酸二氢钾1g、氯 化钠0.1g、明胶2g、琼脂20g、自来水定容1000mL，pH值5-6，121℃灭 菌20min)。

E.复筛：将获得的200株菌分别用无菌牙签接种于斜面培养基，30℃培养至孢 子铺满斜面。分别将孢子以无菌水洗下接种于装有50mL复筛培养基的 250mL三角瓶中进行发酵，接种量10％(v/v)，30℃、100r/min培养96h， 分别测定各菌株的纤维素酶活性。(所述复筛培养基组成如下：纤维素粉50g、 硫酸铵5g、硫酸镁0.25g、磷酸二氢钾1g、氯化钠0.1g、自来水定容1000mL， pH值5-6，121℃灭菌20min)。选取纤维素酶酶活力最高的菌株进行放大 实验。

4)遗传稳定性试验

将Li-2013-03菌株在斜面上连续十次传代，并用摇瓶复筛的方法检测每次传代 后的发酵情况。实验发现，在斜面上连续十次传代，该菌种性状没有明显变化，各项 性能指标都正常，说明该菌种的遗传稳定性较强。

5)放大试验

①种子培养：将纤维素酶酶活力最高的菌株Aspergillus nigerLi-2013-03接入 500mL三角瓶中，种子培养基装量100毫升，30℃、150rpm摇床培养72-96h。

③种子罐培养：将种子液以10％(v/v)接种量接入装有7.5L发酵液的10L发 酵罐中，控制pH值恒定为6.0±0.2，培养温度30±0.1℃，搅拌速度300rpm，通 风量(v/v)1：0.8-1.2，培养时间96h，溶解氧20-30％。所述发酵培养基组成为：纤 维素粉100g、硫酸铵5g、硫酸镁0.25g、磷酸二氢钾1g、氯化钠0.1g、自来水定 容1000mL，pH值5-6，121℃灭菌20min。

发酵结束后，取发酵上清液(粗酶液)进行酶活力检测经测定，菌株Aspergillus  nigerLi-2013-03的外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和滤纸酶活力分 别达到620U/mL、1289U/mL、456U/mL和732U/mL，分别比出发菌株Aspergillus  nigerLi-2010提高了9.21倍、7.43倍、8.15倍和10.31倍。