一种发形霞水母丝氨酸蛋白酶抑制剂及其编码基因与应用

摘要

本发明属于生物医药技术领域，目前尚未见对水母Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂的有关研究报道。本发明提供了一种发形霞水母Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂及其制备方法，所述的发形霞水母丝氨酸蛋白酶抑制剂，具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。本发明还提供了发形霞水母丝氨酸蛋白酶抑制剂的编码基因，具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。同时，本发明还提供了发形霞水母丝氨酸蛋白酶抑制剂及其编码基因在制备抗菌药物、消炎药物、皮肤防护剂等中的应用。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种发形霞水母丝氨酸蛋白酶抑 制剂及其编码基因与应用。

背景技术

海洋是生物资源的宝库，全球80％以上的物种蕴藏于海洋中。由于长期生 存在高盐、高压和缺氧的海洋特殊生态环境中，海洋生物的生理结构和代谢产 物与陆地生物不同，产生并积累了大量具有特殊化学结构、特殊生理活性和功 能的物质，是开发新型海洋药物的重要资源。海洋生物资源主要包括海洋生物 毒素、生理活性物质、生物信息物质及生物功能材料等。海洋生物活性物质是 海洋生物资源的重要组成部分，迄今已在海洋生物中发现三千余种新型活性物 质，其中不少海洋生物活性物质已被证实具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌、抗心脑 血管疾病、抗疲劳以及增强免疫等功效。海洋生物活性物质的开发利用成为现 代药物与保健食品研究的热点。目前，海洋生物资源的活性研究主要侧重于抗 肿瘤与抗菌等方面，而具有显著生物活性的海洋生物资源主要包括海洋微生物 和海洋无脊椎动物(如海鞘、海绵、水母、海葵、海兔等)。

海洋微生物种类繁多，据统计有200万～2亿种。海洋无脊椎动物缺乏后天免 疫系统的多样化抗体，仅能依靠先天免疫系统抵抗入侵细菌或病原体。在漫长 的自然选择压力和复杂的海洋环境作用下，海洋无脊椎动物的先天免疫系统非 常有效且很强大。研究发现，海洋无脊椎动物的内源性抗菌活性物质非常丰富， 已成为开发新型抗菌药物的重要资源。水母属刺胞动物门，是一类分布广泛、 生物总量非常庞大的海洋浮游生物。水母体内富含多种生物活性物质，包括水 母毒素蛋白和一些活性强烈、具有良好开发前景的新功能蛋白。已有研究发现， 水母体内也含有较多的抗菌肽及凝集素类等，这对于生存在复杂海水表层环境 中的水母抵御外界细菌、病毒入侵有重要意义。提示从水母体内很可能获得具 有抗病毒、抑菌作用的活性物质。

丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine protease inhibitor)是一类具有共同来源的多肽类 丝氨酸蛋白酶抑制剂的总称(超过500个家族成员)，广泛分布于真核生物和病毒 中，通过调节丝氨酸蛋白酶的活性，参与纤溶、炎症反应、细胞迁移、细胞分 化以及细胞凋亡等许多重要的生命活动。此外，在凝血系统和补体系统中发挥 作用的蛋白酶也会受丝氨酸蛋白酶抑制剂的调控以避免其蛋白酶活性对周围组 织造成破坏。近年来研究发现，丝氨酸蛋白酶抑制剂在先天免疫防御过程中也 发挥重要的作用。已知大部分动植物的病原微生物会向宿主体内分泌蛋白酶， 破坏宿主的物理防御以进一步加强感染。宿主体内的丝氨酸蛋白酶抑制剂则通 过抑制病原微生物分泌的蛋白酶活性，参与宿主的天然免疫防御过程。

丝氨酸蛋白酶抑制剂主要包括:α-巨球蛋白，serpin，Kunitz和Kazal等类型。

目前围绕水生动物Kazal型抑制剂开展的一些研究发现，Kazal型丝氨酸蛋白 酶抑制剂具有明显的抑菌活性。如在斑节对虾(Penaeus monodon)的血细胞中发 现的含5个Kazal结构域的抑制剂SPIPm2对枯草杆菌蛋白酶有显著抑制活性，推 测其可能在病原细菌的感染过程中发挥免疫作用(参见文献：Somprasong N, Rimphanitehay A,Kittassanakajon A.A five-domain Kazal-type Serine proteinase  inhibitor from black tiger shrimp Penaeus monodon and its inhibitory activities[J]. Developmental and Comparative Immunology,2006,30(11):998-1008.)；在中国明对 虾(Fenneropenaeus chinensis)的肝胰腺中发现了含9个Kazal结构域的抑制剂 FcSPI-1，研究表明其不仅在病原微生物侵染时发挥作用，而且也参与自身蛋白 酶活力的调节(参见文献：Wang Z H,Zhao X F,Wang J X.Characterization, kinetics,and possible function of Kazal-type proteinase inhibitors of Chinese white  shrimp,Fenneropenaeus chinensis[J].Fish&Shellfish  Immunology,2009,26(6):885-897.)；在水螅中发现的具有3个Kazal结构域的抑制 剂Kazal2具有很强的杀灭金黄色葡萄球菌的能力(参见文献：Augustin R,Siebert  S,Boscht C.Identification of a Kazal-type serine protease inhibitor with potent  anti-staphylococcal activity as part of Hydra’s innate immune system[J]. Developmental and Comparative Immunology,2009,33(7):830-837.)；在中国明对虾 (Fenneropenaeus chinensis)中发现的rFc-Kazal对鳗弧菌、金黄色葡萄球菌、杀鲑 气单胞菌、苏云金芽孢杆菌均有一定的抑菌作用(参见文献：黄明，刘逸尘， 张亦陈，等.中国明对虾Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因(Fc-Kaza1)的重组表达 及活性分析[J].水产学报,2011,35(9):1310-1318.)。

目前，国内外尚未见水母Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂的有关研究报道。

本发明人所在的课题组一直致力于水母体内活性组分的提取和研究，已获 得中国发明专利：专利号ZL201310189933.5，发明名称为“一种发形霞水母硫 氧还蛋白及其编码基因与应用”，授权公告号CN103232979B；专利号 ZL201310188702.2，发明名称为“一种发形霞水母过氧化物还原酶及其编码基 因与应用”，授权公告号CN103255113B；已申请中国专利：申请号 201310258184.7，发明名称为“一种发形霞水母虾红素样金属蛋白酶CALP1及其 编码基因与表达方法”，申请公布号CN 104195124A；申请号201310629343.X， 发明名称为“一种水母心血管毒素粗提物的制备方法”，申请公布号： CN103613653A；申请号201310628068.X，发明名称为“一种水母溶血毒素粗提 物的制备方法”，申请公布号CN103626861A等。

发明内容

本发明的目的在于提供一种发形霞水母丝氨酸蛋白酶抑制剂及其编码基 因，本发明的另一目的在于提供该发形霞水母丝氨酸蛋白酶抑制剂的制备方法， 本发明第三目的在于提供该发形霞水母丝氨酸蛋白酶抑制剂在制备抗菌药物、 消炎药物、皮肤防护剂等中的应用。

本发明通过构建发形霞水母触手组织cDNA文库，并对该文库重组克隆的 序列进行测定和注释分析，获得了发形霞水母丝氨酸蛋白酶抑制剂的编码基因。 该发形霞水母丝氨酸蛋白酶抑制剂是首次发现的具有明显抗菌活性的水母类丝 氨酸蛋白酶抑制剂，是水母体内先天免疫系统的重要活性组分，该蛋白在抗菌、 消炎药物研究中具有良好的应用前景。

本发明的主要技术方案是，通过构建发形霞水母触手组织cDNA文库，对 其进行测序和筛选，获得发形霞水母丝氨酸蛋白酶抑制剂的编码基因并进行重 组表达，然后对其抑制丝氨酸蛋白酶类活性和抗菌活性进行研究。

本发明的第一方面，提供了一种发形霞水母丝氨酸蛋白酶抑制剂，所述的 一种发形霞水母丝氨酸蛋白酶抑制剂，具有如下(ⅰ)或(ⅱ)的蛋白质：

(ⅰ)SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(ⅱ)SEQ ID NO:2所示的氨基酸序经取代、缺失和/或添加一个或几个氨 基酸且同等功能的由(ⅰ)衍生的蛋白质。

所述的一种发形霞水母丝氨酸蛋白酶抑制剂，如SEQ ID NO:2所示的氨基 酸序列，该蛋白含信号肽，为分泌蛋白，定位于细胞外，分子量为19.02kDa， 等电点为8.75。

本发明还提供了一种发形霞水母丝氨酸蛋白酶抑制剂的编码基因，为如下 (ⅰ)或(ⅱ)的DNA分子：

(ⅰ)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；

(ⅱ)与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列同源性在80％以上的核苷酸序列。

所述的一种发形霞水母丝氨酸蛋白酶抑制剂基因，该核苷酸序列全长 773bp，如SEQ ID NO:1所示。

本发明产物为Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂，含有3个典型的Kazal结构域， 每个结构域均包括50-60个氨基酸残基和6个半胱氨酸形成3对二硫键。Kazal抑制 剂的抑制特异性由位于Kazal结构域的第二个半胱氨酸后的第二个氨基酸Pl决 定，所以含有不同的Pl氨基酸残基的结构域具有不同的抑制特异性。本发明中的 丝氨酸蛋白酶抑制剂的P1为丙氨酸和精氨酸，推测其具有抑制弹性蛋白酶和胰 蛋白酶活性。

本发明的第二方面，提供了一种发形霞水母丝氨酸蛋白酶抑制剂的制备方 法，该方法包括如下步骤：

(A)构建发形霞水母触手组织cDNA文库；

(B)对上述发形霞水母触手组织cDNA文库重组克隆的序列进行测定和分 析，获得编码丝氨酸蛋白酶抑制剂的核苷酸序列；

(C)构建发形霞水母丝氨酸蛋白酶抑制剂的表达质粒，重组工程菌；

(D)发形霞水母丝氨酸蛋白酶抑制剂的表达；

(E)重组发形霞水母丝氨酸蛋白酶抑制剂的纯化。

所述步骤(A)中的发形霞水母触手组织cDNA文库通过如下方法构建：

1)抽提发形霞水母触手组织总RNA；

2)分离mRNA，合成发形霞水母触手组织cDNA；

3)将上述cDNA插入pUC19质粒载体，再转化至大肠杆菌DH5α中，涂 布于LB培养基平板进行蓝白斑筛选，即构建成发形霞水母触手组织cDNA文库。

所述步骤(C)中的构建发形霞水母丝氨酸蛋白酶抑制剂的表达质粒，重组 工程菌，具体步骤为：

1)根据发形霞水母丝氨酸蛋白酶抑制剂基因序列以及原核表达载体 pGEX-6P-1的酶切位点，设计一对带有特异性酶切位点EcoRⅠ和XhoⅠ的PCR 引物，如下所示：

上游引物：5’CGGAATTCATGACCAAGCCATT 3’(SEQ ID NO:3)

下游引物：5’CCGCTCGAGTTTTCTGCATTG 3’(SEQ ID NO:4)

PCR反应条件为：95℃保温30sec；95℃保温30sec，55.5℃保温30sec， 68℃保温1min，38个循环；68℃保温5min；

2)酶切回收后的PCR产物及pGEX-6P-1原核表达质粒；

3)利用两个酶切位点将编码序列连接到pGEX-6P-1载体上，构建重组表达 质粒，然后转化到大肠杆菌Rosetta(DE3).pLysS获得重组工程菌。

所述步骤(D)中的发形霞水母丝氨酸蛋白酶抑制剂的表达条件为：12℃、 1mM IPTG、150rpm下诱导7小时，在此诱导条件下重组蛋白能够以可溶形式 表达。

所述步骤(E)中的纯化为采用GSTrap HP 4B FF亲和层析柱一步纯化即得， 洗脱条件为分别占总体积90％的结合缓冲液与10％的洗脱缓冲液；其中，结合 缓冲液为1.8mM KH2PO4，140mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4， pH 7.3，洗脱缓冲液为50mM Tris-HCl，10mM还原型谷胱甘肽，pH 8.0。

本发明的制备方法简单，成本低廉。

本发明的第三方面，提供了发形霞水母丝氨酸蛋白酶抑制剂及其编码基因 在制备抗菌药物、消炎药物、皮肤防护剂中的应用。

本发明进一步提供了所述的发形霞水母丝氨酸蛋白酶抑制剂及其编码基因 在制备枯草蛋白酶A抑制剂、蛋白酶K抑制剂、弹性蛋白酶抑制剂等中的应用。

本发明提供了发形霞水母丝氨酸蛋白酶抑制剂及其编码基因在制备抗菌药 物中的应用，所述的细菌为金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、大 肠杆菌和创伤弧菌等。

本发明提供了发形霞水母丝氨酸蛋白酶抑制剂及其编码基因在制备消炎药 物中的应用，发形霞水母kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂能明显抑制金黄色葡萄球 菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、大肠杆菌和创伤弧菌等生长，因此发形霞水 母丝氨酸蛋白酶抑制剂可用于制备消炎药物，所述的炎症为致病菌金黄色葡萄 球菌、创伤弧菌和条件致病菌大肠杆菌引起的感染等。

本发明提供了发形霞水母丝氨酸蛋白酶抑制剂及其编码基因在制备皮肤防 护剂中的应用，所述的皮肤防护剂为防海洋生物蛰伤后感染等。本发明的发形 霞水母丝氨酸蛋白酶抑制剂一方面可以利用蛋白酶抑制剂对蛋白酶的抑制作用 来减弱病原微生物对人体的伤害；同时，因为丝氨酸蛋白酶蛋白酶抑制剂还具 有抑菌作用，可以预防微生物感染。皮肤防护剂类型可以是水母蛰伤皮肤防护 剂的组分，也可以是预防海洋生物伤和开放性创伤海水浸泡后的海洋微生物感 染的皮肤防护剂组分。

本发明获得的重组发形霞水母Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂具有显著的抑制 丝氨酸蛋白酶类活性和抑菌活性。在检测重组蛋白对丝氨酸蛋白酶类抑制能力 的实验中，随着重组发形霞水母丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白浓度的增加，反应体 系中丝氨酸蛋白酶类的抑制率明显升高。在检测重组发形霞水母丝氨酸蛋白酶 抑制剂与微生物结合的实验中，发现Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂与金黄色葡萄 球菌、枯草杆菌、白色念珠菌、大肠杆菌和副溶血弧菌有弱结合活性，与白色 念珠菌和创伤弧菌有强结合活性。在检测重组蛋白对微生物抑制能力的实验中， 随着重组发形霞水母丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白浓度的升高，其对金黄色葡萄球 菌、枯草杆菌、白色念珠菌、大肠杆菌、创伤弧菌等微生物的生长抑制效果明 显增强。本实验证实了重组发形霞水母Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂对丝氨酸蛋 白酶类的抑制能力和抗菌活性。

因此，本发明首次重组了发形霞水母Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂并发现其 具有显著的抗菌活性，本发明中发形霞水母来源的Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂 具备显著的开发价值，在抗菌与消炎药物、化妆品、食品与农业行业具有一定 的应用潜力。本发明中涉及的发形霞水母丝氨酸蛋白酶抑制剂在开发抗菌药物、 消炎药物、皮肤防护剂方面将有很大的应用价值。

附图说明

图1为发形霞水母(Cyanea capillata)Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂与其他物种 Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂的序列多重比对。其中，黑色代表完全同源的区域。

图2为本发明中发形霞水母丝氨酸蛋白酶抑制剂开放阅读框编码序列的梯度 PCR产物的电泳结果。其中，M：核酸分子量Marker；1-12：PCR产物。

图3为本发明中重组发形霞水母丝氨酸蛋白酶抑制剂诱导表达的SDS-PAGE电 泳结果。其中，M：蛋白分子量Marker；1：未诱导的重组大肠杆菌；2：经1mM IPTG 16℃诱导7h后超声裂解液；3：经1mM IPTG 16℃诱导7h后超声上清；4： 经1mM IPTG 16℃诱导7h后超声沉淀；5：经1mM IPTG 20℃诱导7h后超声 裂解液；6：经1mM IPTG 20℃诱导7h后超声上清；7：经1mM IPTG 20℃诱 导7h后超声沉淀；红色方框指示重组蛋白的位置。

图4为本发明中重组发形霞水母丝氨酸蛋白酶抑制剂分离纯化的SDS-PAGE电 泳结果。其中，1：诱导前的重组大肠杆菌；2:诱导后的重组大肠杆菌超声裂解 液3：诱导后的重组大肠杆菌超声裂解上清；4：纯化重组蛋白时穿透峰；5：纯 化重组蛋白时洗脱峰；红色方框指示重组蛋白的位置。

图5为检测重组发形霞水母丝氨酸蛋白酶抑制剂对丝氨酸蛋白酶类抑制能力的 结果。其中A为对枯草蛋白酶A的抑制能力，B为对蛋白酶K的抑制能力，C 为对弹性蛋白酶的抑制能力。结果显示,发形霞水母丝氨酸蛋白酶抑制剂对3种 丝氨酸蛋白酶达到最大抑制活性时与酶的摩尔比分别为:2000:1(枯草蛋白酶A)、 2000:1(蛋白酶K)和80:1(弹性蛋白酶)。发形霞水母丝氨酸蛋白酶抑制剂的抑 制作用随着其浓度升高而增强，达到一定浓度后其抑制作用不再增加，胰蛋白 酶和糜蛋白酶则未检测到抑制活性(结果未显示)。

图6为重组发形霞水母丝氨酸蛋白酶抑制剂与细菌的结合实验检测结果。上排 显示的是SDS洗脱的蛋白，下排是TBS洗脱后的菌体蛋白。1-9号分别是未诱 导组(阴性对照组)，纯化后的发形霞水母丝氨酸蛋白酶抑制剂(阳性对照组)， 金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、大肠杆菌、副溶血弧菌、溶藻 性弧菌和创伤弧菌。结果显示Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂与白色念珠菌和创伤 弧菌有强结合活性，与金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和副溶血弧 菌有弱结合活性，与溶藻性弧菌未检测到结合活性。

图7为检测重组发形霞水母丝氨酸蛋白酶抑制剂对微生物生长的抑制能力的结 果。可见发形霞水母丝氨酸蛋白酶抑制剂对金黄色葡萄球菌(A)、枯草芽孢杆菌 (B)、白色念珠菌(C)、大肠杆菌(D)和创伤弧菌(E)都有明显的生长抑制活性。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明进行详细描述。但下列实施例不应看作对 本发明范围的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

本发明选择的发形霞水母(Cyanea capillata)采集自浙江省三门湾海域， 并经集美大学水产学院洪惠馨教授鉴定(L.Xiao et al,Toxicon,2009,53: 146–152)。

实施例1：发形霞水母丝氨酸蛋白酶抑制剂的筛选和序列分析

1)发形霞水母触手组织总RNA的抽提根据Invitrogen公司的Trizol试剂盒 说明进行，氯仿去除蛋白质，获得约7μg总RNA；

2)mRNA的分离按照QIANGEN公司的Oligotex mRNA Spin-column Kit 说明进行，cDNA的合成则参照Clontech公司的SMART cDNA Library  Construction Kit说明进行；

3)将cDNA插入pUC19质粒载体(购自Takara公司)，再转化至大肠杆菌 DH5α(购自北京博迈德公司)中，涂布于15cm培养皿进行蓝白斑筛选，即构 成发形霞水母触手组织cDNA文库。

该文库共有菌落1923个，其中蓝斑35个，重组率98.18％，库容量1.92*106， 插入长度≥400bp的有效序列1035条，采用100bp、90％的原则对这些序列进 行unigene归并，得到unigene数为528条。同时对序列进行全长分析，在20 条序列中有12条序列有相关同源信息，结果为其中12条全长，完整性比率： 12/12×100％＝100％，表明该cDNA文库具有较好的质量。对该cDNA文库进 行随机测序，所得序列经去载体后进行BLASTx分析 (http://blast.ncbi.nlm.nig.gov)。

4)发形霞水母丝氨酸蛋白酶抑制剂基因来自上述cDNA文库中编号为1E09 的克隆。序列全长773bp，包含一个531bp的开放阅读框，编码含176个氨基 酸残基的蛋白质，分子量19.02kDa，等电点8.75。Blastx搜索结果显示该蛋白 与多个物种的Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂高度同源(如图1)，是水母来源Kazal 型丝氨酸蛋白酶抑制剂家族的新分子。对其进一步的生物信息学分析显示，该 蛋白含有信号肽，为分泌蛋白，定位于细胞外。

实施例2：发形霞水母丝氨酸蛋白酶抑制剂重组表达质粒的构建及工程菌重组

1)根据发形霞水母丝氨酸蛋白酶抑制剂基因序列以及原核表达载体 pGEX-6P-1(购自Novagen公司)的酶切位点，设计并合成一对引物，其中上游 引物包含酶切位点EcoR I(GAATTC)，下游引物包含酶切位点XhoⅠ(CTCGAG)， 两引物的序列具体如下：

上游引物：5’CGGAATTCATGACCAAGCCATT 3’(SEQ ID NO:3)

下游引物：5’CCGCTCGAGTTTTCTGCATTG 3’(SEQ ID NO:4)

经过梯度PCR实验后，选定55.5℃为最佳退火温度，对目的基因进行PCR 大量扩增，PCR反应条件为：95℃保温5min；95℃保温30sec，55.5℃保 温30sec，68℃保温1min，38个循环；68℃保温5min。PCR反应后获得5’ 端分别包含NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点的PCR产物，核酸电泳显示PCR产物条带 在正确位置(如图2)，约528bp，回收PCR产物；

2)根据产品说明用NEB公司的NdeⅠ和XhoⅠ核酸内切酶分别酶切回收后 的PCR产物及pGEX-6P-1原核表达质粒；

3)回收酶切产物后再根据NEB公司的T4DNA连接酶说明进行连接反应， 将连接反应产物转化至大肠杆菌Rosetta(DE3).pLysS(购自北京博迈德公司)后 涂布于含氨苄霉素(100μg/ml)和氯霉素(34μg/ml)的培养皿上培养16小时。 挑取单菌落至含5ml具有氨苄霉素(100μg/ml)和氯霉素(34μg/ml)的LB 培养基摇菌培养12小时，经菌液PCR、质粒酶切验证等方法鉴定重组成功后， 以pGEX F/R为测序引物对重组质粒进行双向测序，验证克隆的基因为目的基 因，说明发形霞水母丝氨酸蛋白酶抑制剂重组表达质粒正确构建。

实施例3：发形霞水母丝氨酸蛋白酶抑制剂的表达

将测序正确的重组大肠杆菌Rosetta(DE3).pLysS菌液加入含氨苄霉素(100 μg/ml)和氯霉素(34μg/ml)的液体LB培养基中，37℃，250rpm摇床培养至 OD₆₀₀为0.6-0.8时开始加入诱导剂IPTG进行诱导。

确定重组蛋白的最佳表达条件为：12℃、1mM IPTG、150rpm下诱导7 小时。诱导后离心收集菌体，经SDS-PAGE电泳可见在此诱导条件下重组蛋白 能够以可溶形式表达，分子量与预测值(加上GST标签后约45kDa)相符，如 图3所示。

实施例4：重组发形霞水母丝氨酸蛋白酶抑制剂的纯化

将诱导后的菌液离心(10000×g*10min)收集菌体，然后使用结合缓冲液 (1.8mM KH2PO4,140mM NaCl,2.7mM KCl,10mM Na2HPO4,pH 7.3)充分重 悬菌体，进行超声裂菌，超声裂解液离心(10000×g*10min)后取上清进行纯 化。最终根据GE Healthcare公司的GST Trap HP 4B FF层析柱以及分离纯化系统的操作说明进行亲和层析，即得到较纯的发形霞水母丝氨酸蛋白 酶抑制剂。

SDS-PAGE电泳(如图4)可见目的条带与预测位置相符，纯度在90％以上， 使用的洗脱条件为：90％的结合缓冲液与10％的洗脱缓冲液(50mM Tris-HCl,10 mM还原型谷胱甘肽，pH 8.0)。

实施例5：重组发形霞水母丝氨酸蛋白酶抑制剂抑制丝氨酸蛋白酶活性的检测

通过实施例4的亲和层析方法获得较为单一的目的蛋白后，蛋白酶活性抑 制实验用到的蛋白酶分别是：枯草蛋白酶A、蛋白酶K、糜蛋白酶、胰蛋白酶 和弹性蛋白酶。本实验所有试剂和底物都由结合缓冲液配制。实验步骤:

第一步：在96孔板中加入50μl抑制剂和150μl蛋白酶(100mM Tris-HCl pH8.0)，25℃孵育10min，405nm测吸光度值OD1；

第二步：加入10μl显色底物，孵育5min；

第三步：50μl 50％(v/v)乙酸终止反应，405nm测吸光度值OD2；

实际吸光度值＝OD2-OD1；

结果：均为三次结果的平均值

Ri＝1-(OD405有抑制剂-OD405对照)/(OD405无抑制剂-OD405对照) 反应体系见表1：

所得的数据做剂量反应曲线，纵坐标为蛋白酶的剩余反应活性，横坐标为 反应体系中丝氨酸蛋白酶抑制剂与蛋白酶的摩尔比。

实验结果如图5所示，随着重组丝氨酸蛋白酶抑制剂浓度的升高，反应体 系中剩余酶活性减少，抑制剂对枯草杆菌蛋白酶、蛋白酶K和弹性蛋白酶的抑 制率明显增大。

实施例6：重组发形霞水母丝氨酸蛋白酶抑制剂结合微生物能力的检测

通过实施例4的亲和层析方法获得较为单一的目的蛋白后，检测该蛋白与 微生物的结合能力。实验用到的微生物分别是：金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、 白色念珠菌、大肠杆菌、副溶血弧菌、溶藻性弧菌和创伤弧菌。本实验所有试 剂和底物都由结合缓冲液配制。培养基为LB液体培养基。实验步骤：

第一步：将本实验室保存的微生物复苏后，在5ml LB液体培养基中37℃ (注白色念珠菌为28℃)150rpm过夜培养。

第二步：将菌液离心(5000×g*5min)收集菌体，然后使用TBS缓冲液(24.8 mM Tris,50mM NaCl,2.7mM KCl,pH 7.4)洗涤菌体3次，加入1ml重组蛋白 (浓度为1mg/ml)，室温孵育1h。

第三步：将菌液离心(5000×g*5min)收集菌体，然后使用TBS缓冲液洗 涤菌体3次，加入200μl含12％SDS的TBS缓冲液，温和震荡15min。

第四步：取40μl震荡后的样品准备电泳，即为SDS洗脱的蛋白样品。 将剩余样品用TBS缓冲液洗涤3次，后用100μl TBS缓冲液溶解，作为TBS 洗脱后的菌体蛋白样品。

第五步：进行蛋白印迹分析，收集到的各样品进行10％SDS-PAGE电泳并 开展后续转膜操作，将目的蛋白转移至PVDF膜上。将转好的PVDF膜置于含 5％脱脂牛乳的TBST封闭液中室温孵育3小时，用TBST洗涤三次。以1：2000 体积的稀释比例用TBST稀释小鼠抗GST抗体(一抗)，将洗好的PVDF膜浸 入，4℃孵育过夜。重新洗涤PVDF膜后，使用1：4000体积稀释比例的辣根 过氧化物酶(HRP)羊抗小鼠IgG室温孵育3小时，最后使用英国Syngene公 司的G：BOX系统进行显影。

实验结果如图6所示，可观察到重组丝氨酸蛋白酶抑制剂与金黄色葡萄球 菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和副溶血弧菌有弱结合活性，与白色念珠菌和创 伤弧菌有强结合活性，与溶藻性弧菌未检测到结合活性。

实施例7：重组发形霞水母丝氨酸蛋白酶抑制剂抑制微生物生长能力的检测

通过实施例4的亲和层析方法获得较为单一的目的蛋白后，其对微生物生 长抑制实验用到的微生物分别是：金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、白色念珠菌、 大肠杆菌和创伤弧菌。本实验所有试剂和底物都由结合缓冲液配制。培养基为 LB液体培养基。实验步骤：

第一步：将本实验室保存的微生物复苏后，在5ml LB液体培养基中37℃ (注白色念珠菌为28℃)150rpm过夜培养。

第二步：将过夜培养的微生物用LB培养基稀释100倍后，再加入丝氨酸 蛋白酶抑制剂样品(浓度分别为0、0.25、0.5、1mg/ml)，用96孔板培养48 小时。每隔1小时在595nm测吸光度值。每组平行做三个复孔。

第三步：数据处理，根据酶标仪检测原理，菌体浓度越高，吸光度值越高。 将抑制剂浓度为0mg/ml作为阴性对照组，其他作为处理组，比较微生物生长 变化趋势。

实验结果如图7所示，随着重组丝氨酸蛋白酶抑制剂浓度的升高，其对金 黄色葡萄球菌、枯草杆菌、白色念珠菌、大肠杆菌和创伤弧菌的生长抑制有不 同程度增大。

以上结果说明本发明的重组发形霞水母丝氨酸蛋白酶抑制剂具有显著的抑 制丝氨酸蛋白酶类活性和抗菌活性，可用于开发抗菌药物、消炎药物、皮肤防 护剂等。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业 的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中 描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还 会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发 明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。