用于蛋白质纯化的亲和试剂

摘要

本文公开了用于从粗溶液纯化蛋白质的方法和组合物。

说明书

交叉引用

本申请要求2012年03月16日提交的美国临时申请第61/611,999号的权益，所述申请以引用的方式并入本文中。

背景技术

具有潜在商业价值的蛋白质和其它分子以商业上适用的量存在于天然来源中，用作食品成分(例如核酮糖二磷酸羧化酶加氧酶、种子贮藏蛋白、豆血红蛋白)、工业酶(例如木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等)、结构材料或药物。蛋白质或其它分子的纯度对于最优效用来说可能是重要的。

纯植物、动物或微生物蛋白质的商业来源的稀有性突显了本领域中对于从粗溶液高效并且经济地纯化蛋白质或其它分子的通用可缩放方法的现有需要。

发明内容

本文公开了用于分离一或多种靶蛋白的方法，其包含：(a)在结合pH下将包含所述一或多种靶蛋白的组合物施用到包含一或多种可转换亲和试剂的底物，以使得所述靶蛋白与所述可转换亲和试剂结合；和(b)在释放pH下将溶液施用到包含所述一或多种可转换亲和试剂的所述底物，以使得所述一或多种靶蛋白从所述一或多种可转换亲和试剂释放，因此分离所述一或多种靶蛋白。一些实施例进一步包含(c)在步骤(a)与步骤(b)之间，在所述结合pH下施用洗涤溶液，其中所述洗涤溶液移除一或多种污染物。在一个实施例中，所述一或多种可转换亲和试剂不包含抗体。在一个实施例中，所述一或多种靶蛋白是抗体。在一个实施例中，所述一或多种靶蛋白可以用以治疗疾病或病症。在一个实施例中，所述疾病或病症是癌症。

在一些实施例中，所述一或多种靶蛋白包含植物蛋白。在一个实施例中，所述一或多种靶蛋白选自由以下组成的群组：豆血红蛋白、非共生血红蛋白、血红蛋白、肌红蛋白、血绿蛋白、无脊椎动物血红蛋白、神经球蛋白、细胞球蛋白、原球蛋白、截短2/2球蛋白、HbN、蓝藻球蛋白、HbO、Glb3和细胞色素、地狱之门球蛋白I(Hell′sgate globin I)、细菌血红蛋白、纤毛肌红蛋白、黄素血红蛋白、核糖体蛋白、肌动蛋白、己糖激酶、乳酸脱氢酶、果糖二磷酸醛缩酶、磷酸果糖激酶、丙糖磷酸异构酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸变位酶、烯醇酶、丙酮酸激酶、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、糖蛋白、凝集素、粘蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、丙酮酸脱羧酶、肌动蛋白、翻译延长因子、组蛋白、核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶加氧酶(核酮糖二磷酸羧化酶加氧酶)、核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶加氧酶活化酶(核酮糖二磷酸羧化酶加氧酶活化酶)、白蛋白、大豆球蛋白、伴大豆球蛋白、球蛋白、豌豆球蛋白、伴白蛋白、麦胶蛋白、谷蛋白、麸质、麦谷蛋白、大麦醇溶蛋白、醇溶谷蛋白、菜豆蛋白(蛋白质)、蛋白质体、黑麦醇溶蛋白、伸展蛋白、小麦麸质、胶原蛋白、玉米蛋白、高梁醇溶蛋白、燕麦蛋白、脱水蛋白、亲水素、胚胎发生晚期丰富蛋白、天然未折叠蛋白、任何种子贮藏蛋白、油质蛋白、油体钙蛋白、油体固醇蛋白或其它油体蛋白、营养贮藏蛋白A、营养贮藏蛋白B、蒙恩(moong)种子贮藏8S球蛋白、豌豆球蛋白、豌豆白蛋白或其组合。

在一些实施例中，所述一或多种可转换亲和试剂包含小分子化合物。在一些实施例中，所述小分子化合物包含肽、类肽、3-肽或D-肽亚单位。在一些实施例中，所述结合pH在约7与约11之间。在一些实施例中，所述结合pH是约9。在一些实施例中，所述释放pH在约3与约7之间。在一些实施例中，所述释放pH是约6。在一些实施例中，所述一或多种靶蛋白用以生产消费品。在一些实施例中，所述消费品是肉类替代品。在一些实施例中，所述消费品是乳酪替代品。在一些实施例中，所述消费品是牛奶替代品。在一些实施例中，所述消费品是蛋类替代品。

在一些实施例中，本发明提供一种包含非多肽pH可转换试剂的组合物，其在第一pH下结合标靶并且在第二pH下不结合所述标靶。

在一些实施例中，所述pH可转换试剂是类肽。在一些实施例中，所述类肽包含N个亚单位。在一些实施例中，所述N个亚单位是1、2、3、4或5个亚单位。在一些实施例中，N个亚单位是2个亚单位。在一些实施例中，所述类肽在多个多样性点被修饰。在一些实施例中，所述多个多样性点是至少1、2、3、4、5、6个多样性点。在一些实施例中，所述多个多样性点是4个多样性点。

在一些实施例中，所述类肽包含三嗪。在一些实施例中，所述三嗪是被三取代的。

在一些实施例中，其中所述pH可转换试剂具有主链结构，其包含：

在一些实施例中，所述组合物包含非对映异构体的混合物。所述组合物可以包含对映异构体的混合物。所述组合物可以包含基本上纯的非对映异构体，其中所述基本上纯的非对映异构体是指从其它非对映异构体纯化的多于70％的非对映异构体。所述组合物可以包含基本上纯的对映异构体，其中所述基本上纯的对映异构体是指从其它对映异构体纯化的多于70％的对映异构体。

在一些实施例中，所述类肽是不可由蛋白酶降解的。

在一些实施例中，所述第一pH大于7。在一些实施例中，所述第一pH小于7。在一些实施例中，所述第二pH大于7。在一些实施例中，所述第二pH小于7。

在一些实施例中，所述pH可转换试剂结合到底物。在一些实施例中，所述底物是选自包含以下的群组的珠子：琼脂糖、琼脂糖凝胶、聚苯乙烯、苯乙烯、氧化铁、磁性的或顺磁性的。在一些实施例中，所述底物涂布有选自包含以下的群组的涂层：二氧化硅、羧基官能团、醛官能团或N-羟基丁二酰亚胺官能团。在一些实施例中，所述底物涂布有能够结合伯胺和硫醇的官能团。在一些实施例中，所述底物是用于色谱法的树脂的组分。在一些实施例中，所述树脂用于蛋白质纯化色谱法。在一些实施例中，所述树脂用于亲和蛋白质纯化色谱法。

在一些实施例中，本发明是一种消费产品，其包含pH可转换试剂。在一些实施例中，可转换试剂以少于1,000百万分率靶蛋白的浓度存在。在一些实施例中，所述组合物的至少90％干重包含基于植物的蛋白质。在一些实施例中，所述消费品实质上不含叶绿素、二氢卟吩、类金属、过渡金属、纤维素或复杂多糖。在一些实施例中，所述消费产品是食品安全的。

在一些实施例中，所述组合物包含蛋白质内含物，其中所述蛋白质内含物从植物获得；其中所述组合物实质上不含所述植物中所见的气味剂。在一些实施例中，所述组合物包含所述pH可转换试剂以少于1,000百万分率靶蛋白的浓度存在。在一些实施例中，所述组合物的最少90％包含基于植物的蛋白质。在一些实施例中，所述组合物实质上不含叶绿素、二氢卟吩、类金属、过渡金属、纤维素或复杂多糖。在一些实施例中，所述消费产品是食品安全的。

在一些实施例中，所述组合物包含蛋白质内含物，其中所述蛋白质内含物从植物获得；其中所述组合物实质上不含所述植物中所见的着色剂。在一些实施例中，所述组合物包含所述pH可转换试剂以少于1,000百万分率靶蛋白的浓度存在。在一些实施例中，所述组合物的至少90％包含基于植物的蛋白质。在一些实施例中，所述组合物实质上不含叶绿素、二氢卟吩、类金属、过渡金属、纤维素或复杂多糖。在一些实施例中，所述消费产品是食品安全的。

在一些实施例中，本发明提供一种用于鉴别非多肽pH可转换试剂的方法，所述方法包含：a)通过标签定向的合成来产生非多肽的库；b)使所述库的至少一子集在第一pH下在溶液中暴露于蛋白质；c)将所述溶液的pH改变到第二pH；和d)鉴别非多肽pH可转换试剂，其在第一pH下结合标靶并且在第二pH下不结合所述标靶。

在一些实施例中，本发明提供一种用于分离一或多种靶蛋白的方法，其包含：a)将包含所述一或多种靶蛋白的组合物施用到底物；其中所述底物包含一或多种非多肽pH可转换试剂；其中所述施用步骤的至少一部分在第一pH下进行；其中在所述第一pH下，所述一或多种靶蛋白中的至少一者与所述一或多种非多肽pH可转换试剂结合；b)通过将所述溶液的pH调节到第二pH来释放所述靶蛋白；其中在所述第二pH下，所述靶蛋白中的至少一或多者不结合所述非多肽pH可转换试剂；和c)收集从所述一或多种非多肽pH可转换试剂洗脱的所述靶蛋白。

在所述方法的一些实施例中，所述pH可转换试剂是类肽。在所述方法的一些实施例中，所述类肽包含N个亚单位。在所述方法的一些实施例中，N个亚单位是1、2、3、4、5个亚单位。在所述方法的一些实施例中，N个亚单位是2个亚单位。在所述方法的一些实施例中，所述类肽在多个多样性点被修饰。在所述方法的一些实施例中，所述多个多样性点是至少1、2、3、4、5、6个多样性点。在所述方法的一些实施例中，所述多个多样性点是4个多样性点。在所述方法的一些实施例中，所述类肽包含三嗪。在所述方法的一些实施例中，所述三嗪被三取代。在所述方法的一些实施例中，所述pH可转换试剂具有主链结构，其包含：

在所述方法的一些实施例中，所述pH可转换试剂包含非对映异构体的混合物。在所述方法的一些实施例中，所述pH可转换试剂包含对映异构体的混合物。在所述方法的一些实施例中，其中所述pH可转换试剂包含基本上纯的非对映异构体，其中所述基本上纯的非对映异构体是指从其它非对映异构体纯化的多于70％的非对映异构体。在所述方法的一些实施例中，所述pH可转换试剂包含基本上纯的对映异构体，其中所述基本上纯的对映异构体是指从其它对映异构体纯化的多于70％的对映异构体。

在所述方法的一些实施例中，所述类肽是不可由蛋白酶降解的。在所述方法的一些实施例中，所述第一pH大于7。在所述方法的一些实施例中，所述第一pH小于7。在所述方法的一些实施例中，所述第二pH大于7。在所述方法的一些实施例中，所述第二pH小于7。

在所述方法的一些实施例中，所述pH可转换试剂结合到底物。在所述方法的一些实施例中，所述底物是选自包含以下的群组的珠子：琼脂糖、琼脂糖凝胶、聚苯乙烯、苯乙烯、氧化铁、磁性的或顺磁性的。在所述方法的一些实施例中，所述底物涂布有选自包含以下的群组的涂层：二氧化硅、羧基官能团、醛官能团、胺官能团、炔烃官能团、叠氮基官能团或N-羟基丁二酰亚胺官能团。在所述方法的一些实施例中，所述底物涂布有能够结合伯胺和硫醇的官能团。在所述方法的一些实施例中，所述底物是用于色谱法的树脂的组分。在所述方法的一些实施例中，所述树脂用于蛋白质纯化色谱法。在所述方法的一些实施例中，所述树脂用于亲和蛋白质纯化色谱法。

在一些实施例中，核酮糖二磷酸羧化酶加氧酶在pH 9下结合并且在pH 6下释放。在一些实施例中，核酮糖二磷酸羧化酶加氧酶在pH 6下结合并且在pH 9下释放。在一些实施例中，豆血红蛋白在pH 9下结合并且在pH 6下释放。在一些实施例中，豆血红蛋白在pH 6下结合并且在pH 9下释放。

以引用的方式并入

本说明书中提及的所有公开、专利和专利申请都以引用的方式并入本文中，其引用的程度如每个单独的公开、专利或专利申请经特定并且单独地指示以引用的方式并入一般。

具体实施方式

本文公开了用于从粗溶液纯化一或多种靶蛋白或化合物或分子的方法和组合物。本文公开的方法和组合物可以用以纯化大量靶蛋白而不需要产生蛋白质的重组的加标签的形式。所述方法和组合物可以包含可转换亲和试剂。可转换亲和试剂可以是对于靶蛋白、化合物或分子具有可控制或可调节的亲和力的分子。举例来说，可转换亲和试剂可以是在第一组条件下以一种亲和力与靶蛋白、化合物或分子结合并且在第二组条件下不与或以较低亲和力与靶蛋白、化合物或分子结合的试剂。可转换亲和试剂可以是小分子。可转换亲和试剂可以经设计。可转换亲和试剂可以选自候选亲和试剂或小分子的库。可转换亲和试剂可以选自使用DNA可编程组合化学反应产生的候选亲和试剂的库。任选地使用DNA可编程组合化学反应产生的候选亲和试剂的库可能会偏向于很可能具有可能由环境条件改变的官能团或部分的分子。可转换亲和试剂可以固定在固体支撑结构(例如珠子或树脂)上。用以控制或调节可转换亲和试剂的亲和力的条件可以包括pH、温度、盐度或金属离子或其它试剂的浓度的变化。

定义

如本文所用，“约”可以指±10％并且包括±1％和±0.1％。

如本文所用，除了本领域中已知的定义之外，“树脂”可以指具有大表面积的固体支撑物(例如薄膜、精细粉末或凝胶)。

如本文所用，术语“可转换亲和试剂”可以意指在一组条件下与标靶(例如蛋白质)结合但在第二组条件下不与或以较低亲和力与标靶结合的试剂。

可转换亲和试剂

用以纯化一或多种标靶(例如从例如粗溶液纯化蛋白质)的方法可以利用可转换亲和试剂。可转换试剂可以固定在固体或半固体支撑物上。可以用以调节可转换亲和试剂对于靶蛋白的亲和力的条件可以包括pH、温度、盐度或离子强度或金属离子或其它试剂的浓度。在一个实例中，可转换亲和试剂的亲和力可以通过依赖于负责标靶、可转换亲和试剂或两者上的残基或化学部分的pH依赖性变化来控制。受影响的残基或化学部分可以位于亲和试剂与标靶之间的接口处。受影响的残基或化学部分可以是其电荷影响亲和试剂、标靶或两者的构形的残基或化学部分。可转换亲和试剂可以包含小分子化合物。可转换亲和试剂可以任选地包含编码用于合成小分子化合物的程序的核酸序列。可转换亲和试剂可以结合到固体支撑底物，例如珠子。可转换亲和试剂可以结合到半固体支撑底物。

可转换亲和试剂可以包含由较小亚单位、构筑嵌段或试剂、前体、单体或残基(统称为“亚单位”)合成的分子或小分子化合物。可转换亲和试剂的亚单位可以任选地包含常见母体结构。常见母体结构可以是肽或肽模拟物主链(例如L-肽主链、D-肽主链、3-肽主链、类肽主链)。常见母体结构可以是环结构(例如苯环、苯酚环、甲苯、萘、环己基、糖、苯胺、联二苯结构、吡啶、三嗪等)。

常见母体结构可以包含一或多个(例如两个)可以用以将亚单位连接在一起的官能部分。可转换亲和试剂的亚单位可以包含但不限于L-氨基酸或L-肽残基、D-氨基酸或D-肽残基、3-氨基酸或3-肽残基或类肽残基。

亚单位可以包含一或多个侧链或环结构修饰(统称为“R基团”)，其中的每一者都可以呈多种化学形式。亚单位的R基团可以在链长、环大小或数目和/或取代模式方面不同。可转换亲和试剂的亚单位的R基团可以包含天然存在的侧链，例如L-肽、蛋白质或氨基酸中所见的侧链。可转换亲和试剂的亚单位的R基团可以包含生物中不可见的侧链或基团。

可转换亲和试剂可以包含由较小亚单位、构筑嵌段、试剂、前体、单体或残基(统称为“亚单位”)合成的分子或小分子化合物。可转换亲和试剂可以包含约2与约1000个之间的亚单位；举例来说，可转换亲和试剂可以包含约2-1000、2-750、2-500、2-250、2-100、2-75、2-50、2-40、2-30、2-25、2-20、2-15、2-10、2-5、5-1000、5-750、5-500、5-250、5-100、5-75、5-50、5-40、5-30、5-25、5-20、5-15、5-10、10-1000、10-750、10-500、10-250、10-100、10-75、10-50、10-40、10-30、10-25、10-20、10-15、15-1000、15-750、15-500、15-250、15-100、15-75、15-50、15-40、15-30、15-25、15-20、20-1000、20-750、20-500、20-250、20-100、20-75、20-50、20-40、20-30、30-1000、30-750、30-500、30-250、30-100、30-75、30-50、30-40、40-1000、40-750、40-500、40-250、40-100、40-75、40-50、50-1000、50-750、50-500、50-250、50-100、50-75、75-1000、75-750、75-500、75-250、75-100、100-1000、100-750、100-500、100-250、250-1000、250-750、250-500、500-1000、500-750、750-1000、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000个亚单位。在一个实例中，可转换亲和试剂包含约2与约10个之间的亚单位。在另一个实例中，可转换亲和试剂包含约2与约6个之间的亚单位。可转换亲和试剂可以任选地进一步包含编码用于合成小分子化合物的程序的核苷酸序列(例如DNA、RNA)。

可转换亲和试剂的特征可以在于具有约10Da与1000000Da之间的分子量；举例来说，可转换亲和试剂的分子量可以是约10-1000000Da、10-75000Da、10-50000Da、10-25000Da、10-10000Da、10-5000Da、10-2500Da、10-1000Da、10-750Da、10-500Da、10-250Da、10-100Da、100-1000000Da、100-75000Da、100-50000Da、100-25000Da、100-10000Da、100-5000Da、100-2500Da、100-1000Da、100-750Da、100-500Da、100-250Da、250-1000000Da、250-75000Da、250-50000Da、250-25000Da、250-10000Da、250-5000Da、250-2500Da、250-1000Da、250-750Da、250-500Da、500-1000000Da、500-75000Da、500-50000Da、500-25000Da、500-10000Da、500-5000Da、500-2500Da、500-1000Da、500-750Da、750-1000000Da、750-75000Da、750-50000Da、750-25000Da、750-10000Da、750-5000Da、750-2500Da、750-1000Da、1000-1000000Da、1000-75000Da、1000-50000Da、1000-25000Da、1000-10000Da、1000-5000Da、1000-2500Da、2500-1000000Da、2500-75000Da、2500-50000Da、2500-25000Da、2500-10000Da、2500-5000Da、5000-1000000Da、5000-75000Da、5000-50000Da、5000-25000Da、5000-10000Da、10000-1000000Da、10000-75000Da、10000-50000Da、10000-25000Da、25000-1000000Da、25000-75000Da、25000-50000Da、50000-1000000Da、50000-75000Da、75000-1000000Da、10Da、20Da、30Da、40Da、50Da、60Da、70Da、80Da、90Da、100Da、125Da、150Da、175Da、200Da、225Da、250Da、300Da、350Da、400Da、450Da、500Da、550Da、600Da、650Da、700Da、750Da、800Da、850Da、900Da、950Da、1000Da、1100Da、1200Da、1300Da、1400Da、1500Da、1600Da、1700Da、1800Da、1900Da、2000Da、2100Da、2200Da、2300Da、2400Da、2500Da、2750Da、3000Da、3250Da、3500Da、3750Da、4000Da、4250Da、4500Da、4750Da、5000Da、6000Da、7000Da、8000Da、9000Da、10000Da、12500Da、15000Da、17500Da、20000Da、22500Da、25000Da、30000Da、35000Da、40000Da、45000Da、50000Da、55000Da、60000Da、65000Da、70000Da、75000Da、80000Da、85000Da、90000Da、95000Da或100000Da或100000Da以上或任何中间量。在一个实例中，可转换亲和试剂的分子量可以在约100Da与1000Da之间。在另一个实例中，可转换亲和试剂的分子量可以是小于约1000Da。

在另一个实例中，可转换亲和试剂的分子量可以在约600与约900Da之间。

可转换亲和试剂的特征可以为在第一组条件(例如结合条件)下对于靶蛋白、化合物或分子具有第一结合亲和力并且在第二组条件(例如释放条件)下对于靶蛋白具有第二结合亲和力。第一结合亲和力可以比第二结合亲和力更强。举例来说，第一结合亲和力可以比第二结合亲和力强至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、420、440、460、480、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2200、2400、2600、2800、3000、3200、3400、3600、3800、4000、4200、4400、4600、4800、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500或10000倍。

可转换亲和试剂的特征可以为在第一组条件(例如结合条件)下对于靶蛋白、化合物或分子具有第一结合亲和力并且在第二组条件(例如释放条件)下对于靶蛋白具有第二结合亲和力，其中第一结合亲和力和第二结合亲和力表示为离解常数(K_d)。离解常数可以具有摩尔单位，并且较低离解常数可以意指可转换亲和试剂与靶蛋白以较高亲和力结合。类似地，较高离解常数可以与可转换亲和试剂与靶蛋白之间的较低结合亲和力相关。可转换亲和试剂与靶蛋白之间的第一结合亲和力可以是小于约2mM的K_d；举例来说，第一结合亲和力可以是小于约2mM、1000uM、900uM、800uM、700uM、600uM、500uM、400uM、300uM、200uM、100uM、75uM、50uM、25uM、20uM、15uM、10uM、9uM、8uM、7uM、6uM、5uM、4uM、3uM、2uM、1uM、900nM、800nM、700nM、600nM、500nM、400nM、300nM、200nM、100nM、75nM、50nM、25nM、20nM、15nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM或1nM以下的K_d。第二结合亲和力可以是比第一结合亲和力高至少约2倍的Kd；举例来说，第二结合亲和力可以是比第一结合亲和力高至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、420、440、460、480、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2200、2400、2600、2800、3000、3200、3400、3600、3800、4000、4200、4400、4600、4800、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500或10000倍的Kd。

pH敏感性可转换亲和试剂

可转换亲和试剂可以是pH敏感性可转换试剂，其中试剂在结合pH下结合靶蛋白并且在释放pH下不结合靶蛋白。结合pH可以是约1与14之间的pH；例如是约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或任何包括的小数。释放pH可以是约1与14之间的pH；例如是约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或任何包括的小数。结合与释放pH可以间隔约1与约13个之间的pH单位；举例来说，结合与释放pH可以间隔约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个pH单位。在一些情况下，靶蛋白的结合在酸性条件中进行并且靶蛋白的释放在碱性条件中进行。在一些情况下，靶蛋白的结合在碱性条件中进行并且靶蛋白的释放在酸性条件中进行。在一个实例中，结合pH可以在约5与11之间(例如约5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11或任何包括的小数)，并且释放pH可以在约6与约11之间(例如6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11或任何包括的小数)。在另一个实例中，结合pH可以在约4与约8之间(例如约4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8或任何包括的小数)，并且释放pH可以在约7与约11之间(例如7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11或任何包括的小数)。在另一个实例中，结合pH是约6并且释放pH是约9。在另一个实例中，结合pH是约9并且释放pH是约6。

pH敏感性可转换亲和试剂的特征可以在于具有约1与14之间的pKa；例如约1-14、1-13、1-12、1-11、1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2、2-14、2-13、2-12、2-11、2-10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4、2-3、3-14、3-13、3-12、3-11、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5、3-4、4-14、4-13、4-12、4-11、4-10、4-9、4-8、4-7、4-6、4-5、5-14、5-13、5-12、5-11、5-10、5-9、5-8、5-7、5-6、6-14、6-13、6-12、6-11、6-10、6-9、6-8、6-7、7-14、7-13、7-12、7-11、7-10、7-9、7-8、8-14、8-13、8-12、8-11、8-10、8-9、9-14、9-13、9-12、9-11、9-10、10-14、10-13、10-12、10-11、11-14、11-13、11-12、12-14、12-13、13-14、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10、10.1、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6、10.7、10.8、10.9、11、11.1、11.2、11.3、11.4、11.5、11.6、11.7、11.8、11.9、12、12.1、12.2、12.3、12.4、12.5、12.6、12.7、12.8、12.9、13、13.1、13.2、13.3、13.4、13.5、13.6、13.7、13.8、13.9、14的pKa。在一个实例中，pH敏感性可转换亲和试剂具有约7的pKa，并且在约9的pH下不带电并且在约5的pH下带正电。

类肽可转换试剂

在一些情况下，亚单位包含类肽主链。类肽主链包含N个类肽亚单位(有时称为寡聚N被取代的甘氨酸)，其中类肽主链亚单位可以包含：

类肽主链亚单位包含类肽亚单体。类肽亚单体可以指伯胺-R基团结合物(NH₂-R)，其与前述主链亚单位的羰基反应形成新的肽主链亚单位。在一些情况下，类肽亚单体可以称为合成子。

在一些情况下，N个亚单位是至少1、2、3、4、5个或5个以上。在一些情况下，N个亚单位是2个。

芳香族或非芳香族环结构结合到N个类肽亚单位，其中位置A始终是碳，但位置B-F可以是碳或氮。芳香族环可以包含：

在一些情况下，芳香族环可以是1，3，5-三嗪环，其中B、D和F位置是氮。在一些情况下，三嗪环在C和E位置处被二取代。

在一些情况下，可转换亲和试剂具有包含以下的主链结构：

在一些实施例中，可转换试剂包含具有如表5中所述的R基团的主链结构。表5中的R1-R4基团对应于式I、III或IV中的R1-R4基团，其中表中的化合物的N-H键中的一或多者在式中转化为C-N键。因此，在各个实施例中，可转换试剂是式I、III或IV中所述的化合物，其中R基团的身份如表5中所述。

类肽可转换试剂可以用以从混合物纯化靶蛋白。在一些情况下，混合物来源于细胞溶解物。在一些情况下，蛋白质的混合物来源于非动物来源。非动物来源的非限制性实例包括植物、真菌、细菌、酵母、藻、古细菌、经遗传修饰的生物体(例如经遗传修饰的细菌或酵母)，化学或体外合成。在特定实施例中，一或多种靶蛋白来源于植物来源。任何适合的植物都可以用作一或多种靶蛋白的来源以便使用一或多种可转换亲和试剂进行纯化。可以是靶蛋白的来源的植物的非限制性实例包括蕉麻(马尼拉麻(Manila hemp))；苜蓿；杏仁；茴香籽；苹果；杏；槟榔(槟榔果)；秘鲁胡萝卜(arracha)；竹芋；朝鲜蓟；芦笋；鳄梨；御谷(珍珠粟)；班巴拉花生；香焦；大麦；豆；红甜菜；糖甜菜；香柠檬；槟榔果；黑胡椒；黑荆树；各个物种的黑莓；蓝莓；巴西坚果；面包果；蚕豆；椰菜；帚用粟；帚用高粱；球芽甘蓝；荞麦；甘蓝菜(红球甘蓝、白球甘蓝、皱叶甘蓝)；大白菜；可可(cacao/cocoa)；哈密瓜；葛缕子籽；小豆蔻；刺菜蓟；角豆；胡萝卜；腰果；木薯(树薯)；蓖麻子；花椰菜；根芹菜；芹菜；佛手瓜；樱桃(所有变种)；栗子；鸡豆(鹰嘴豆)；菊苣；辣椒；肉桂；香橼；香茅；克莱门氏小柑橘；丁香；三叶草(所有变种)；可可；椰子；芋头(cocoyam)；咖啡；可乐果(所有变种)；菜籽(油菜籽)；玉米(玉蜀黍)；玉米(甜)；棉(所有变种)；棉籽(所有变种)；豇豆；蔓越橘；水芹；黄瓜；醋栗(所有变种)；南美番荔枝；芋头(dasheen)；枣子；鼓槌树；蜀黍(高粱)；硬粒小麦；地豆；芋头(edo/eddoe)；茄子；苦苣；茴香；胡芦巴；无花果；榛子(filbert/hazelnut)；菲奎叶纤维；亚麻；亚麻籽油(亚麻籽)；新西兰麻(新西兰亚麻(New Zealand flax))；大蒜；老鹳草；姜；鹅莓(所有变种)；葫芦；鹰嘴豆(鸡豆)；葡萄；葡萄柚；细茎针茅；果园草；苏丹草；花生(落花生)；番石榴；几内亚玉米(高粱)；榛子；麻；大麻籽；黑纳金树；指甲花；啤酒花；马豆；辣根；杂交玉米；靛蓝；茉莉；洋姜；蜀黍(高粱)；黄麻；羽衣甘蓝；木棉；洋麻；球茎甘蓝；薰衣草；韭菜；柠檬；柠檬草；兵豆；胡枝子(所有变种)；莴苣；酸橙；甜橙；亚麻籽；甘草；荔枝；枇杷；羽扇豆(所有变种)；夏威夷果(昆士兰坚果(Queensland nut))；肉豆蔻衣；龙舌兰；玉蜀黍；柑橘；饲料甜菜(mangel/fodder beet)；芒果；树薯(木薯)；混植麦(混合谷物)；枸杞；甜瓜；帚用粟；珍珠粟；芦苇粟；鸡爪粟；狐尾粟；日本粟；珍珠粟(御谷、芦苇)；黍；薄荷(所有变种)；桑椹(所有变种)；蘑菇；芥；油桃；新西兰亚麻(新西兰麻)；黑芝麻；肉豆蔻；燕麦；油棕；秋葵；橄榄；绿葱；鸦片；橙子；观赏植物；扇叶树头榈；棕榈仁油；棕榈油；西米棕榈；番木瓜(木瓜)；欧洲防风草；豌豆；桃；落花生(花生)；梨；山核桃；黑胡椒；柿子；木豆；菠萝；开心果；车前草；李；石榴；柚子；罂粟籽；马铃薯；甘薯；李干；南瓜；除虫菊；白坚木；昆士兰坚果；榅桲；奎宁；奎奴亚藜；萝卜；苎麻(ramie)；油菜籽(菜籽)；覆盆子(所有变种)；红甜菜；小糠草；苎麻(rhea)；大黄；稻米；玫瑰；橡胶；芜菁甘蓝(瑞典芜菁)；黑麦；黑麦草籽；红花；红豆草；婆罗门参；人心果；无核小蜜橘(柑橘/红橘)；鸦葱-黑婆罗门参；芝麻；牛油树油(坚果)；剑麻；高粱；帚用高粱；都拉高粱；几内亚玉米高粱；蜀黍高粱；甜高粱；大豆；大豆草；斯卑尔脱小麦；菠菜；南瓜；草莓；糖用甜菜；甘蔗；向日葵；柽麻；瑞典芜菁；甜玉米；甜橙；甜椒；甘薯；甜高粱；红橘；箭叶黄体竽；木薯；芋头；茶；画眉草；梯牧草；烟草；番茄；车轴草；饲料黑小麦；油桐；树(所有类型)芜菁；蚤缀(刚果黄麻(Congo jute))；香草；谷物野豌豆；胡桃；西瓜；小麦；甘薯；巴拉圭茶；玉米、玉蜀黍、燕麦、稻米、小麦、大麦、黑麦、黑小麦、画眉草、油籽(包括棉籽、向日葵籽、红花籽)、海甘蓝、亚麻荠、芥、油菜籽、绿叶菜(例如莴苣、菠菜、羽衣甘蓝、绿甘蓝、青萝卜、君达菜、芥菜、蒲公英嫩叶、椰菜、甘蓝菜)、通常不由人类实用的绿色物质(包括生物质作物，包括柳枝稷、芒草、芦竹、能源甘蔗、高粱、其它禾草、苜蓿、玉米秆、海带、其它海藻)、通常从收集的植物丢弃的绿色物质、甘蔗叶、树叶、根块作物(例如木薯、甘薯、马铃薯、胡萝卜、甜菜、芜箐)、来自豆科植物家族的植物(例如三叶草、豌豆，例如豇豆、甜豌豆、黄豌豆、绿豌豆)、豆(例如大豆、蚕豆、利马豆、四季豆、鹰嘴豆、绿豆、黑白斑豆、小扁豆、羽扇豆、牧豆、角豆、大豆)和花生、椰子、野豌豆(野豌豆属)、笔花豆(笔花豆属)、花生属、木蓝属、金合欢属、银合欢属、瓜儿豆属和田菁属。本领域的技术人员应理解，植物界中的任何生物体都可以用于本发明中。

在一些情况下，类肽可转换试剂用以纯化核酮糖二磷酸羧化酶加氧酶。核酮糖二磷酸羧化酶加氧酶(核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶加氧酶)是参与碳固定过程的酶并且是植物中最丰富的蛋白质之一。核酮糖二磷酸羧化酶加氧酶可以从例如苜蓿、胡萝卜头、玉米秆、甘蔗叶、大豆叶、柳枝稷、芒草、能源甘蔗、芦竹、海藻、海带、藻或芥菜中分离。

类肽pH可转换试剂可以在碱中结合核酮糖二磷酸羧化酶加氧酶并且在酸中释放核酮糖二磷酸羧化酶加氧酶。在一些实施例中，可转换试剂包含具有如表1中所述的R基团的主链结构。表1中的R1-R4基团对应于式I、III或IV中的R1-R4基团，其中表中的化合物的N-H键中的一或多者在式中转化为C-N键。因此，在各个实施例中，可转换试剂是式I、III或IV中所述的化合物，其中R基团的身份如表1中所述。

表1.在碱中结合核酮糖二磷酸羧化酶加氧酶并且在酸中释放核酮糖二磷酸羧化酶加氧酶的类肽pH可转换试剂包含具有包含以下的R基团的主链结构：

类肽pH可转换试剂可以在酸中结合核酮糖二磷酸羧化酶加氧酶并且在碱中释放核酮糖二磷酸羧化酶加氧酶。在一些实施例中，可转换试剂包含具有如表2中所述的R基团的主链结构。表2中的R1-R4基团对应于式I、III或IV中的R1-R4基团，其中表中的化合物的N-H键中的一或多者在式中转化为C-N键。因此，在各个实施例中，可转换试剂是式I、III或IV中所述的化合物，其中R基团的身份如表2中所述。

表2.在酸中结合核酮糖二磷酸羧化酶加氧酶并且在碱中释放核酮糖二磷酸羧化酶加氧酶的类肽pH可转换试剂包含具有包含以下的R基团的主链结构：

在一些情况下，类肽可转换试剂用以纯化豆血红蛋白。豆血红蛋白是氮或氧载体并且响应于植物根被固氮细菌感染而产生。豆血红蛋白可容易以商品豆科植物作物(例如大豆、豌豆)的未用的副产物形式获得。在美国，这些作物的根中的豆血红蛋白超过美国所消费的全部红肉的肌红蛋白含量。

豆血红蛋白可以从多种植物获得。各种豆科植物物种和其变种，例如大豆、蚕豆、利马豆、豇豆、甜豌豆、黄豌豆、羽扇豆、菜豆、鹰嘴豆、落花生、苜蓿、野豌豆草、三叶草、胡枝子和黑白斑豆，含有豆血红蛋白在控制氧浓度中具有关键作用的固氮根瘤(例如来自豌豆植物的根瘤)。

类肽pH可转换试剂可以在碱中结合豆血红蛋白并且在酸中释放豆血红蛋白。在一些实施例中，可转换试剂包含具有如表3中所述的R基团的主链结构。表3中的R1-R4基团对应于式I、III或IV中的R1-R4基团，其中表中的化合物的N-H键中的一或多者在式中转化为C-N键。因此，在各个实施例中，可转换试剂是式I、III或IV中所述的化合物，其中R基团的身份如表3中所述。

表3.在碱中结合豆血红蛋白并且在酸中释放豆血红蛋白的类肽pH可转换试剂包含具有包含以下的R基团的主链结构：

类肽pH可转换试剂可以在酸中结合豆血红蛋白并且在碱中释放豆血红蛋白。在一些实施例中，可转换试剂包含具有如表4中所述的R基团的主链结构。表4中的R1-R4基团对应于式I、III或IV中的R1-R4基团，其中表中的化合物的N-H键中的一或多者在式中转化为C-N键。因此，在各个实施例中，可转换试剂是式I、III或IV中所述的化合物，其中R基团的身份如表4中所述。

表4.在酸中结合豆血红蛋白并且在碱中释放豆血红蛋白的类肽pH可转换试剂包含具有包含以下的R基团的主链结构：

DNA程序化组合化学反应(DPCC)

可转换亲和试剂的库可以使用被称为DNA程序化组合化学反应的工艺来产生；例如，如雷恩(Wrenn)等人美国化学会志(J Am Chem Soc).2007年10月31日；129(43)：13137-13143或美国专利第7479472号中所公开，其中的每一者特此以全文引用的方式并入。DNA程序化组合化学反应可以使得能够从小分子组合库中选择对于靶蛋白的天然特征具有高并且选择性的亲和力的亲和试剂。

DNA程序化组合化学反应(DPCC)可以用以合成亲和试剂的多样组合库，其中亲和试剂包含连接到编码多核苷酸序列的小分子化合物，所述编码多核苷酸序列编码用于由大量前体合成小分子化合物的程序。术语“组合库”可以指含有大量(例如约10³与10¹²之间)不同化合物的分子库。化合物的特征可以在于亚单位或前体的不同序列或侧链的不同序列与键联的组合。术语“小分子”可以指可以具有常见母体结构(例如环结构、三嗪、类肽、肽等)和多个不同R基团取代基或环结构修饰(其中的每一者呈多种形式，例如不同R基团)的小有机分子。在一个实施例中，小分子化合物是非寡聚的(即，不由重复类似亚单位的序列组成)。在一个实例中，小分子化合物可以在基本结构和官能团方面类似，但在例如链长、环大小或数目或取代模式等方面不同。在一个实施例中，前体是氨基酸。在另一个实施例中，前体是类肽。在另一个实施例中，前体是L-肽。在另一个实施例中，前体是D-肽。

合成组合库的策略

编码的组合化学库可以包含多个种类的候选亲和试剂。亲和试剂可以是包含小分子化合物和编码多核苷酸序列的双官能分子，其中编码多核苷酸序列界定并且引导相应小分子化合物的合成。

编码多核苷酸序列

在一个实施例中，亲和试剂包含小分子化合物和编码多核苷酸序列，所述编码多核苷酸序列编码用于合成小分子化合物的程序。编码多核苷酸序列可以包含一或多个同源序列。每个同源序列可以规定特定前体分子的添加。同源序列的特征可以在于以下性质：(i)同源序列可以在规定溶液条件下在规定解链温度(例如约5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、100℃或任何包括的整数或分数)下与其相应互补核苷酸序列(下文“互补序列”)结合；和(ii)同源序列在规定解链温度和规定溶液条件下并不与1536个序列中的另一者或与其它1536个序列中任一者的补体高效交叉杂交。

编码多核苷酸序列中同源序列的数目可以基于小分子化合物的所要长度来选择。编码多核苷酸序列中同源序列的数目可以在约1与约50之间；例如约1-50、1-40、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、5-50、5-40、5-30、5-25、5-20、5-15、5-10、10-50、10-40、10-30、10-25、10-20、10-15、15-50、15-40、15-30、15-25、15-20、20-50、20-40、20-30、20-25、25-50、25-40、25-30、30-50、30-40、40-50、3-6、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个同源序列。在一个实例中，编码多核苷酸序列包含约5个同源序列。在另一个实例中，编码多核苷酸包含约10个同源序列。在另一个实例中，编码多核苷酸包含约15个同源序列。编码多核苷酸序列可以包含约3与约6个之间的同源序列；例如约3、4、5或6个同源序列。

在一个实施例中，同源序列可以包含约1与约50个之间的核苷酸；例如约1-50、1-40、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、5-50、5-40、5-30、5-25、5-20、5-15、5-10、10-50、10-40、10-30、10-25、10-20、10-15、15-50、15-40、15-30、15-25、15-20、20-50、20-40、20-30、20-25、25-50、25-40、25-30、30-50、30-40、40-50、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸。在一个实施例中，同源序列包含约10个核苷酸。在另一个实施例中，同源序列包含约20个核苷酸。在一个实施例中，编码多核苷酸序列中的每个同源序列包含独特序列。在另一个实施例中，编码肽中的两个或两个以上同源序列可以包含相同序列。

编码多核苷酸序列可以进一步包含一或多个间隔序列。间隔序列的可以根据同源序列的数目而不同。在一个实施例中，每个同源序列由间隔序列间隔开。间隔序列可以包含1与50个之间的核酸；例如约1-50、1-40、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、5-50、5-40、5-30、5-25、5-20、5-15、5-10、10-50、10-40、10-30、10-25、10-20、10-15、15-50、15-40、15-30、15-25、15-20、20-50、20-40、20-30、20-25、25-50、25-40、25-30、30-50、30-40、40-50、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸。在一个实施例中，间隔序列包含约5个核酸。在另一个实施例中，间隔序列包含约10个核酸。在另一个实施例中，间隔序列包含约15个核酸。在一个实施例中，每个间隔序列包含相同核苷酸序列。在另一个实施例中，使用两个或两个以上独特间隔序列。

编码多核苷酸序列可以进一步包含化学反应位点。在一个实施例中，化学反应位点位于编码多核苷酸序列的末端，例如5′末端。在另一个实施例中，化学反应位点位于多核苷酸序列的末端，例如3′末端。在一个实施例中，核酸标签的5′碱基的5′醇经市售试剂修饰，所述试剂引入系栓到直链间隔基(例如12-碳的)并且经伯胺基封端的磷酸酯基(例如格伦研究(Glen Research)目录号10-1912-xx或可用于将硫醇或其它化学反应位点引入到合成DNA中的众多其它试剂)。在这个实施例中，伯胺表示合成小分子化合物的化学反应位点。许多不同类型的化学反应位点(除了伯胺之外)可以引入编码多核苷酸序列的5′端。例示性化学反应位点包括但不限于能够形成酰胺、酯、脲、氨基甲酸酯、碳-羰基键、碳-氮键、碳-碳单键、烯烃键、硫醚键和二硫键的化学组分。在酶促合成的情况下，可以如有效催化所需供应辅因子；例如适用于聚酮化合物合成的磷酸泛酰巯基乙胺基。

合成小分子化合物

包含两个或两个以上合成步骤的分离与重组策略可以用于合成组合库。已经描述了用于合成组合库的传统分离与重组策略。陈(Chen)等人，酶学方法(Methods inEnzymology)267：211-9(1996)；埃尔曼(Ellman)和盖洛普(Gallop)，化学生物学新见(CurrOpin Chem Biol)2：317-319(1998)。举例来说，在由i个步骤组成的组合合成中，其中在每个步骤进行j个不同化学偶合反应，jⁱ种化合物将存在于最后的库中。传统分离与重组策略使用以下步骤进行；(i)在i个步骤中的每一者开始时，将固体标签池随机分成j个子集，(ii)使固体标签的j个子集中的每一者进行不同化学偶合步骤，和(iii)在化学偶合步骤之后，将子集重组成单个池。在库合成中的下一个步骤开始时，将这个重组的池再次随机分成j个子集(具体来说，如在以上(i)中般)。在合成肽库时，例如，偶合步骤是氨基酸活性酯与固体标签上的游离胺基的加成。j个子集中的每一者偶合到不同氨基酸(例如丙氨酸偶合到1号子集，精氨酸偶合到2号子集，半胱氨酸偶合到3号子集，等)。举例来说，具有10个合成步骤、每个步骤具有10个偶合反应的分离与重组合成将产生10¹⁰的最后库大小。

化合物库可以在分离与重组组合合成的每个步骤通过包含与固体支撑物(例如聚苯乙烯珠子)结合的互补序列的一或多个同源序列的编码多核苷酸序列的差示杂交分成子集。可以合成编码多核苷酸序列的每个同源序列的互补序列。在一个实施例中，每个互补序列的5′碱基的5′醇经市售试剂修饰，所述试剂引入系栓到直链间隔基(例如具有六个碳的直链间隔基)并且经硫醇基封端的磷酸酯基(格伦研究目录号10-1926-xx))。带有硫醇的互补序列中的每一者可以例如通过硫醚键联固定到带有亲电子溴乙酰胺基的大孔树脂(例如聚苯乙烯，MPS；生物孔(Biopore)目录号NH-2CM，L-970317)。因此，得到多个亲和树脂，每者带有独特互补序列。亲和树脂中的每一者可以装入其自身的柱中。柱可以在任一末端包含鲁尔锁(luer-lock)配件。柱可以按线性序列连接。

第一次分离可以通过使编码多核苷酸序列的库与先前描述的亲和树脂接触来进行。在一个实施例中，接触可以包含在高度严格条件下(参看例如邵瑟E M(Southern，EM)等人，核酸研究(Nucl Acids Res).22(8)1368-1373(1994))、使用蠕动泵并且持续一段时间将含有编码多核苷酸序列的整个库的高盐的水溶液循环地泵送经过线性序列的亲和柱，以足以使所有编码多核苷酸序列与结合到柱的互补序列杂交。分离可以通过使亲和柱之间的鲁尔锁键联断裂来完成。这时，不同编码多核苷酸序列已经基于编码多核苷酸序列所含有的同源序列分成物理分开的子集。

通过如上文所述的杂交形成的编码多核苷酸序列的每个子集随后可以进行不同合成偶合反应。合成偶合反应中所用的方法可以根据所要小分子化合物而不同。举例来说，可以添加并且移除的氨基端阻断基团(例如芴基甲氧羰基(FMOC))可以用于合成包含肽亚单位的小分子化合物。

用以合成包含肽或氨基酸亚单位或前体的小分子化合物的例示性程序如下：可以将与亲和柱结合的编码多核苷酸序列用10mM NaOH和0.005％曲拉通(Triton)X-100从亲和柱洗脱掉。将多核苷酸序列转移到化学反应柱(例如羟基磷灰石树脂柱(伯乐(Bio-Rad)Macro-Prep陶瓷羟基磷灰石II型目录号1588200))上，在pH 5.0下与0.005％曲拉通在300mM CaCl₂或DEAE琼脂糖凝胶速流(法玛西亚(Pharmacia)17-0709-01)中结合，在10mM乙酸酯中结合。编码多核苷酸序列在众多有机溶剂(例如DMF、乙腈、乙醇和那些溶剂与水的混合物)中可以保持与羟基磷灰石或琼脂糖凝胶树脂非共价结合。因此，有机试剂可以流动经过柱，并且以进行常规固相化学合成的相同方式与编码核苷酸序列上的化学反应位点反应。因此，DMF中的经四氟硼酸N[(1H-苯并三唑-1-基)(二甲基氨基)亚甲基]-N-甲基甲铵(TBTU)或以N-羟基丁二酰亚胺酯形式预活化的不同经Fmoc保护的氨基酸可以流动经过每个羟基磷灰石或琼脂糖凝胶柱，导致羟基磷灰石或琼脂糖凝胶柱中的每一者上的化学反应位点的伯胺与经Fmoc保护的氨基酸酰化[阿尔贝里西欧F.(Albericio，F.)和卡尔皮诺L A(Carpino L A)，酶学方法(Methods inEnymology)289：104-26(1997)]。酰化之后，可以通过使哌啶/DMF溶液流动经过羟基磷灰石或琼脂糖凝胶柱将Fmoc基团从新添加的氨基酸移除，因此呈现准备好用于下一个偶合步骤的新伯胺。

用以合成包含类肽亚单位或前体的小分子化合物的例示性程序如下：将与亲和柱结合的编码多核苷酸序列转移到化学反应柱(例如DEAE-琼脂糖凝胶柱)上。可以将化学反应柱用DEAE结合缓冲液(10mM乙酸、0.005％曲拉通-X100)、水、甲醇或其组合洗涤。随后可以将化学反应柱与蒸馏甲醇中的150mM DMT-MM(氯化4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓)和100mM氯乙酸钠一起孵育一或多次(例如2次)持续约20分钟的时间段。随后可以将化学反应柱用甲醇洗涤，并且与含有所要类肽亚单位的溶液一起孵育。可以在类肽孵育期间微波处理柱约20秒一或多次；例如1、2、3、4、5、6次或6次以上。随后可以将化学反应柱用例如DMSO(二甲亚砜)、DEAE结合缓冲液或其组合洗涤。

可以通过执行交替回合的库分离与编码核苷酸序列的每个子集的化学和/或生物化学偶合来合成整个亲和试剂库。

用以产生可转换亲和试剂的修饰

所述的产生亲和试剂库的方法可以经修饰以便产生可转换亲和试剂，其中可转换亲和试剂包含小分子化合物和编码多核苷酸序列。可以如上文所述由亚单位或前体合成小分子化合物。在一个实施例中，前体可以经选择以使合成偏向于pKa约是7的分子的家族，以使得其在约pH 9下可以不带电并且在约pH 5下带正电。可以将亲和试剂与非特异性蛋白的粗混合物(例如来自大肠杆菌(Escherichia coli)的细胞溶解物)一起孵育，这可以消除对于蛋白质具有非特异性亲和力的分子。随后可以将剩余库在结合pH(例如约pH 9)下与连接到固体支撑物的靶蛋白一起孵育。可以洗掉未能与靶蛋白结合的亲和试剂。随后，可以将缓冲液pH调节到释放pH(例如约pH 5)，并且可以收集所洗脱的的结合亲和试剂。应理解，所陈述的pH值仅作为实例提供并且预期多种结合与释放pH的组合。

可以重复做这个选择以获得在选择中性能最佳的亲和试剂(例如在约pH 9下结合并且在约pH 5下洗脱)的逐渐更大增浓。可以将所选择的亲和试剂池通过定序连接的DNA分子来加以鉴别，再合成，并且进一步表征其对于靶蛋白的特异性和在实际纯化条件下的性能。可以采用任何数目的重复来选择亲和试剂；例如可以进行1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20次或20次以上重复。

注意，亲和试剂的特定性质，包括控制对于靶蛋白的亲和力的方式(通过pH或其它条件变化)，可以不同于上文，发现其并且使用其纯化靶蛋白的方法可能无关于亲和转换的特性。

靶蛋白、化合物或分子

靶蛋白、化合物或分子可以是具有工业价值、临床效果或环境效果的任何蛋白质、化合物或分子。靶蛋白、化合物或分子可以用作食品成分。靶蛋白可以是酶(例如工业酶)。靶蛋白、化合物或分子可以用作治疗剂；举例来说，靶蛋白可以包括可以用以治疗疾病或病症(例如癌症)的抗体或其它蛋白质。靶蛋白、化合物或分子可以包括用于诊断测试或其它临床用途的分析物。

靶蛋白、化合物或分子还可以是其于混合物中的存在是不合需要的蛋白质、化合物或分子。举例来说，靶蛋白、化合物或分子可以是毒素或过敏原；举例来说，靶蛋白可能是发酵大麦饮料中的大麦醇溶蛋白，其移除将致使啤酒“无麸质”。靶蛋白、化合物或分子可以促成产品(例如食品产品)中的不合需要的味道、气味或视觉外观。靶蛋白、化合物或分子可以是其活性降低所要物质的稳定性的靶蛋白、化合物或分子(例如酶)；举例来说，靶蛋白可能是其中RNA是所要物质的细胞提取物中的RNA酶。可转换亲和试剂可以用以从包含所要物质的混合物移除不合需要的靶蛋白、化合物或分子。

靶蛋白或分子可以用以生产消费品；例如肉类替代食品产品。消费品可以用于人类食用。消费品可以由适合的管理当局批准。消费品可以在杂货店中出售或在餐馆中制备，类似于已经存在的人类食品。消费品可以用于动物食用。消费品可以是家畜的食品；所述家畜例如农场动物(例如母牛、绵羊、猪、山羊、马、鸡、火鸡等)或宠物(例如猫、狗、雪貂、兔、仓鼠、天竺鼠、小鼠、鱼、鸟等)。消费品可以是野生动物(例如狐狸、狼、熊、大猫、灵长类动物、啮齿动物、鳄鱼、短吻鳄、鬣蜥蜴、蜥蜴、蛇、陆龟、海龟、青蛙、鱼等)的食品。

靶蛋白可以包含动物蛋白。蛋白质的动物来源的非限制性实例包括人类、猴、农场动物、哺乳动物、鸟、爬行动物和昆虫。

靶蛋白可以包含来源于非动物来源的蛋白质。非动物来源的非限制性实例包括植物、真菌、细菌、酵母、藻、古细菌、经遗传修饰的生物体(例如经遗传修饰的细菌或酵母)，化学或体外合成。

靶蛋白可以包含植物蛋白。靶蛋白可以从来源于植物物质的粗溶液纯化。植物蛋白的非限制性实例包括核酮糖二磷酸羧化酶加氧酶(核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶加氧酶)、豆血红蛋白、非共生血红蛋白、核糖体、细胞质肌动蛋白和种子贮藏蛋白。在一个实例中，靶蛋白包含核酮糖二磷酸羧化酶加氧酶(RuBisCO，或者“Rubisco”或“rubisco”)。在另一个实例中，靶蛋白包含豆血红蛋白。在另一个实例中，靶蛋白包含非共生血红蛋白。在一个实例中，靶蛋白包含核糖体蛋白。在另一个实例中，靶蛋白包含细胞质肌动蛋白。在另一个实例中，靶蛋白包含种子贮藏蛋白；例如白蛋白、伴白蛋白、麦谷蛋白、麦胶蛋白、谷蛋白、麸质、大麦醇溶蛋白、醇溶谷蛋白、菜豆蛋白、黑麦醇溶蛋白、小麦麸质或玉米蛋白。在另一个实例中，靶蛋白选自由以下组成的群组：豆血红蛋白、非共生血红蛋白、血红蛋白、肌红蛋白、血绿蛋白、无脊椎动物血红蛋白、神经球蛋白、细胞球蛋白、原球蛋白、截短2/2球蛋白、HbN、蓝藻球蛋白、HbO、Glb3和细胞色素、地狱之门球蛋白I、细菌血红蛋白、纤毛肌红蛋白、黄素血红蛋白、核糖体蛋白、肌动蛋白、己糖激酶、乳酸脱氢酶、果糖二磷酸醛缩酶、磷酸果糖激酶、丙糖磷酸异构酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸变位酶、烯醇酶、丙酮酸激酶、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、糖蛋白、凝集素、粘蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、丙酮酸脱羧酶、肌动蛋白、翻译延长因子、组蛋白、核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶加氧酶(核酮糖二磷酸羧化酶加氧酶)、核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶加氧酶活化酶(核酮糖二磷酸羧化酶加氧酶活化酶)、白蛋白、大豆球蛋白、伴大豆球蛋白、球蛋白、豌豆球蛋白、伴白蛋白、麦胶蛋白、谷蛋白、麸质、麦谷蛋白、大麦醇溶蛋白、醇溶谷蛋白、菜豆蛋白(蛋白质)、蛋白质体、黑麦醇溶蛋白、伸展蛋白、小麦麸质、胶原蛋白、玉米蛋白、高梁醇溶蛋白、燕麦蛋白、脱水蛋白、亲水素、胚胎发生晚期丰富蛋白、天然未折叠蛋白、任何种子贮藏蛋白、油质蛋白、油体钙蛋白、油体固醇蛋白或其它油体蛋白、营养贮藏蛋白A、营养贮藏蛋白B、蒙恩种子贮藏8S球蛋白、豌豆球蛋白、豌豆白蛋白或其组合。

在另一个实例中，靶蛋白选自由以下组成的群组：豆血红蛋白、非共生血红蛋白、血红蛋白、肌红蛋白、血绿蛋白、无脊椎动物血红蛋白、神经球蛋白、细胞球蛋白、原球蛋白、截短2/2球蛋白、HbN、蓝藻球蛋白、HbO、Glb3和细胞色素、地狱之门球蛋白I、细菌血红蛋白、纤毛肌红蛋白、黄素血红蛋白、核糖体蛋白、肌动蛋白、己糖激酶、乳酸脱氢酶、果糖二磷酸醛缩酶、磷酸果糖激酶、丙糖磷酸异构酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸变位酶、烯醇酶、丙酮酸激酶、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、糖蛋白、凝集素、粘蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、丙酮酸脱羧酶、肌动蛋白、翻译延长因子、组蛋白、核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶加氧酶(核酮糖二磷酸羧化酶加氧酶)、核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶加氧酶活化酶(核酮糖二磷酸羧化酶加氧酶活化酶)、白蛋白、大豆球蛋白、伴大豆球蛋白、球蛋白、豌豆球蛋白、伴白蛋白、麦胶蛋白、谷蛋白、麸质、麦谷蛋白、大麦醇溶蛋白、醇溶谷蛋白、菜豆蛋白(蛋白质)、蛋白质体、黑麦醇溶蛋白、伸展蛋白、小麦麸质、胶原蛋白、玉米蛋白、高梁醇溶蛋白、燕麦蛋白、脱水蛋白、亲水素、胚胎发生晚期丰富蛋白、天然未折叠蛋白、任何种子贮藏蛋白、油质蛋白、油体钙蛋白、油体固醇蛋白或其它油体蛋白、营养贮藏蛋白A、营养贮藏蛋白B、蒙恩种子贮藏8S球蛋白、豌豆球蛋白、豌豆白蛋白或其组合。

蛋白质的任何混合物都可以用作一或多种靶蛋白的来源以便使用一或多种可转换亲和试剂进行纯化。在一些情况下，混合物来源于细胞溶解物。在一些情况下，蛋白质的混合物来源于非动物来源。非动物来源的非限制性实例包括植物、真菌、细菌、酵母、藻、古细菌、经遗传修饰的生物体(例如经遗传修饰的细菌或酵母)，化学或体外合成。在特定实施例中，一或多种靶蛋白来源于植物来源。任何适合的植物都可以用作一或多种靶蛋白的来源以便使用一或多种可转换亲和试剂进行纯化。可以是靶蛋白的来源的植物的非限制性实例包括蕉麻(马尼拉麻)；苜蓿；杏仁；茴香籽；苹果；杏；槟榔(槟榔果)；秘鲁胡萝卜；竹芋；朝鲜蓟；芦竹；芦笋；鳄梨；御谷(珍珠粟)；班巴拉花生；香焦；大麦；豆；红甜菜；糖甜菜；香柠檬；槟榔果；黑胡椒；黑荆树；各个物种的黑莓；蓝莓；巴西坚果；面包果；蚕豆；椰菜；帚用粟；帚用高粱；球芽甘蓝；荞麦；甘蓝菜(红球甘蓝、白球甘蓝、皱叶甘蓝)；大白菜；可可；哈密瓜；葛缕子籽；小豆蔻；刺菜蓟；角豆；胡萝卜；腰果；木薯(树薯)；蓖麻子；花椰菜；根芹菜；芹菜；佛手瓜；樱桃(所有变种)；栗子；鸡豆(鹰嘴豆)；菊苣；辣椒；肉桂；香橼；香茅；克莱门氏小柑橘；丁香；三叶草(所有变种)；可可；椰子；芋头；咖啡；可乐果(所有变种)；菜籽(油菜籽)；玉米(玉蜀黍)；玉米(甜)；棉(所有变种)；棉籽(所有变种)；豇豆；蔓越橘；水芹；黄瓜；醋栗(所有变种)；南美番荔枝；芋头；枣子；鼓槌树；蜀黍(高粱)；硬粒小麦；地豆；芋头；茄子；苦苣；茴香；胡芦巴；无花果；榛子；菲奎叶纤维；亚麻；亚麻籽油(亚麻籽)；新西兰麻(新西兰亚麻)；大蒜；老鹳草；姜；鹅莓(所有变种)；葫芦；鹰嘴豆(鸡豆)；葡萄；葡萄柚；细茎针茅；果园草；苏丹草；花生(落花生)；番石榴；几内亚玉米(高粱)；榛子；麻；大麻籽；黑纳金树；指甲花；啤酒花；马豆；辣根；杂交玉米；靛蓝；茉莉；洋姜；蜀黍(高粱)；黄麻；羽衣甘蓝；木棉；洋麻；球茎甘蓝；薰衣草；韭菜；柠檬；柠檬草；兵豆；胡枝子(所有变种)；莴苣；酸橙；甜橙；亚麻籽；甘草；荔枝；枇杷；羽扇豆(所有变种)；夏威夷果(昆士兰坚果)；肉豆蔻衣；龙舌兰；玉蜀黍；柑橘；饲料甜菜；芒果；树薯(木薯)；混植麦(昆合谷物)；枸杞；甜瓜；帚用粟；珍珠粟；芦苇粟；鸡爪粟；狐尾粟；日本粟；珍珠粟(御谷、芦苇)；黍；薄荷(所有变种)；芒草；桑椹(所有变种)；蘑菇；芥；油桃；新西兰亚麻(新西兰麻)；黑芝麻；肉豆蔻；燕麦；油棕；秋葵；橄榄；绿葱；鸦片；橙子；观赏植物；扇叶树头榈；棕榈仁油；棕榈油；西米棕榈；番木瓜(木瓜)；欧洲防风草；豌豆；桃；落花生(花生)；梨；山核桃；黑胡椒；柿子；木豆；菠萝；开心果；车前草；李；石榴；柚子；罂粟籽；马铃薯；甘薯；李干；南瓜；除虫菊；白坚木；昆士兰坚果；榅桲；奎宁；奎奴亚藜；萝卜；苎麻；油菜籽(菜籽)；覆盆子(所有变种)；红甜菜；小糠草；苎麻；大黄；稻米；玫瑰；橡胶；芜菁甘蓝(瑞典芜菁)；黑麦；黑麦草籽；红花；红豆草；婆罗门参；人心果；无核小蜜橘(柑橘/红橘)；鸦葱-黑婆罗门参；芝麻；牛油树油(坚果)；剑麻；高粱；帚用高粱；都拉高粱；几内亚玉米高粱；蜀黍高粱；甜高粱；大豆；大豆草；斯卑尔脱小麦；菠菜；南瓜；草莓；糖用甜菜；甘蔗；向日葵；柽麻；瑞典芜菁；甜玉米；甜橙；甜椒；甘薯；甜高粱；红橘；箭叶黄体竽；木薯；芋头；茶；画眉草；梯牧草；烟草；番茄；车轴草；饲料黑小麦；油桐；树(所有类型)芜菁；蚤缀(刚果黄麻)；香草；谷物野豌豆；胡桃；西瓜；小麦；甘薯；巴拉圭茶；玉米、玉蜀黍、燕麦、稻米、小麦、大麦、黑麦、黑小麦、画眉草、油籽(包括棉籽、向日葵籽、红花籽)、海甘蓝、亚麻荠、芥、油菜籽、绿叶菜(例如莴苣、菠菜、羽衣甘蓝、绿甘蓝、青萝卜、君达菜、芥菜、蒲公英嫩叶、椰菜、甘蓝菜)、通常不由人类实用的绿色物质(包括生物质作物，包括柳枝稷、芒草、芦竹、能源甘蔗、高粱、其它禾草、苜蓿、玉米秆、海带、其它海藻)、通常从收集的植物丢弃的绿色物质、甘蔗叶、树叶、根块作物(例如木薯、甘薯、马铃薯、胡萝卜、甜菜、芜箐)、来自豆科植物家族的植物(例如三叶草、豌豆，例如豇豆、甜豌豆、黄豌豆、绿豌豆)、豆(例如大豆、蚕豆、利马豆、四季豆、鹰嘴豆、绿豆、黑白斑豆、小扁豆、羽扇豆、牧豆、角豆、大豆)和花生、椰子、野豌豆(野豌豆属)、笔花豆(笔花豆属)、花生属、木蓝属、金合欢属、银合欢属、瓜儿豆属和田菁属。本领域的技术人员应理解，植物界中的任何生物体都可以用于本发明中。

用于纯化靶蛋白、化合物或分子的方法

本发明提供了众多使用一或多种可转换亲和试剂纯化一或多种靶蛋白、化合物或分子的方法。所述方法可以包含以下步骤：(a)在结合pH下将包含一或多种靶蛋白、化合物或分子的组合物施用到包含一或多种可转换亲和试剂的底物，以使得靶蛋白、化合物或分子与可转换亲和试剂结合；和(b)在释放pH下将溶液施用到包含一或多种可转换亲和试剂的底物，以使得一或多种靶蛋白、化合物或分子从一或多种可转换亲和试剂释放。所述方法可以进一步包含洗涤步骤，其中将洗涤溶液施用到包含与一或多种靶蛋白结合的一或多种可转换亲和试剂的底物，其中洗涤溶液在结合pH下或接近结合pH。洗涤步骤可以用以移除一或多种不合需要的组分(例如不合需要的蛋白质、污染物等)。本文公开的方法可以用以获得一或多种靶蛋白的纯的浓溶液。

pH可转换试剂在底物上的固定

可转换亲和试剂可以固定在底物上(例如在珠子、固体支撑物或半固体支撑物上)。可转换亲和试剂可以填充到柱或其它适合容器中。pH可转换试剂可以结合到底物，例如珠子。底物(例如珠子)可以由苯乙烯、聚苯乙烯、氧化铁、琼脂糖或琼脂糖凝胶制成。底物(例如珠子)可以是磁性的或顺磁性的。底物(例如珠子)可以涂布有二氧化硅或高密度官能团，例如羧基、醛基或N-羟基丁二酰亚胺-酯(NHS)基。结合底物(例如珠子)于浆料中的集合可以形成树脂。

pH可转换试剂可以结合到底物，例如珠子。pH可转换试剂可以使用以下结合到底物：化学品，例如N-乙基顺丁烯二酰亚胺(NEM)、N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和其它亚氨基酯；其它化学交联剂，例如1-乙基-3-(-3-二甲基氨基丙基)(EDC，EDAC)碳化二亚胺盐酸盐和N′，N′-二环己基碳化二亚胺(DCC)；碘乙酸酯和α-卤基羰基化合物；或与伯胺或硫醇反应的任何化学品。

树脂可以包含交联珠状琼脂糖、交联双丙烯酰胺和吖内酯或聚乙二醇。树脂可以是微孔或大孔的。树脂的结合能力可以根据毫克量的结合蛋白/毫升量的树脂进行测量。树脂可以填充到柱中用于从细胞溶解物大规模亲和色谱纯化靶蛋白。

在一个实例中，可以进行柱纯化，其中使包含靶蛋白、化合物或分子的粗溶液运行通过包括包含一或多种可转换亲和试剂的珠子或树脂的柱。粗溶液可以在结合pH(例如约7与约11之间，例如约9)下。在这个实例中，粗溶液的其它组分可以通过柱并且可以对其加以收集和/或处置。可以使粗溶液运行经过柱一或多次。使粗溶液运行经过柱两次或两次以上可以增加从粗溶液纯化的靶蛋白、化合物或分子的量。在另一个实例中，可以进行分批纯化，其中可以将包含一或多种可转换亲和试剂的珠子添加到包含一或多种靶蛋白、化合物或分子的粗溶液。粗溶液可以在结合pH(例如约7与约11之间，例如约9)下。在任选的混合下的孵育时间段之后，可以将珠子连同与可转换亲和试剂的结合的任何靶蛋白一起从粗溶液收集并且移除。柱和分批纯化方法两者都可以包含一或多个洗涤步骤，其中用在结合pH(例如约7与约11之间，例如约9)下或接近结合pH的溶液进行洗涤步骤。在柱和分批纯化两者中，可以在释放pH(例如约3与约7之间，例如约5)下使用溶液将一或多种靶蛋白、化合物或分子从可转换亲和试剂释放。柱和分批纯化方法两者都可以用以产生靶蛋白、化合物或分子的纯的浓溶液。

源于植物的靶蛋白使用pH可转换试剂的纯化被设计成以非常大的规模进行。高果糖玉米糖浆、抗生素或工业蛋白的分离可以在直径＞4m的柱中进行。这些柱通常用于工艺开发和制造。用于使用pH可转换试剂纯化植物靶蛋白的柱的大小可以是当前最大柱的多达1、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。所回收的靶蛋白的量可以是至少0.1、0.5、1、5、10、20、50、100、200、500、1000、5000、10000、50000、100000克或100000克以上。所回收的靶蛋白的浓度可以是至少0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、20mg/mL、50mg/mL、100mg/mL、200mg/mL、500mg/mL。

标靶样品的纯度将用标准蛋白质纯度检测技术进行评估，所述技术例如SDSpage、质谱法、光谱法和本领域的技术人员熟知的其它分子生物学技术。

在一些情况下，pH可转换试剂将从柱沥滤掉并且携载到靶蛋白样品中，所述样品在下游工艺中用以生产消费食品产品，表明消费食品产品可能含有微量的pH可转换试剂。在一些情况下，沥滤的pH可转换试剂和/或pH可转换试剂树脂的量将是至多1、100、500、1000、2000、5000百万分率靶蛋白。在一些情况下，沥滤的pH可转换试剂和/或pH可转换试剂树脂的量将代表至多10^-9、10^-8、10^-7、10^-6、10^-5、10^-4、10^-3、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10％重量/体积的经纯化靶蛋白组合物。在一些情况下，沥滤的pH可转换试剂和/或pH可转换试剂树脂的量将代表至多0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、20、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、1000十亿分率(ppb)。在一些情况下，纯化的靶蛋白将代表超过10、20、30、40、50、60、70、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、98.5、99、99.5、99.9、99.95％重量/体积的经纯化靶蛋白组合物。在一些情况下，纯化的靶蛋白相对于源物质(从其分离规定蛋白质)增加2或2以上、3或3以上、5或5以上、10或10以上、20或20以上、50或50以上、100或100以上或1000或1000以上的因子。

纯靶蛋白可以实质上不含纤维素和复杂多糖。纤维素是负责植物细胞壁的结构完整性的多糖。纤维素仅部分可由人类消化并且在消费产品中可能是不合乎需要的。纤维素可以包含木质素、半纤维素和纤维素。复杂多糖也可以见于植物细胞壁中。复杂多糖在消费产品中可能是不合乎需要的。复杂多糖可以包含阿拉伯糖、木糖、阿拉伯糖基木聚糖、纤维素、木质素、半纤维素、甲壳素、果胶、直链淀粉或支链淀粉。

纯靶蛋白可以实质上不含着色剂和/或气味剂，或含有痕量的着色剂和/或气味剂。着色剂可以包括阴离子、阳离子、盐、金属、碱金属、类金属或过渡元素。着色剂可以具有与叶绿素相关的类型，例如二氢卟吩、叶绿素a、叶绿素b、叶绿素c1、叶绿素c2、叶绿素d和叶绿素f。在一些情况下，着色剂和/或气味剂的量将是至多1、100、500、1000、2000、5000、10000、100000百万分率靶蛋白。在一些情况下，着色剂和/或气味剂的量将代表至多0.05、0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10％重量/体积的经纯化靶蛋白组合物。在一些情况下，经纯化靶蛋白将代表超过90、91、92、93、94、95、96、97、98、98.5、99、99.5、99.9、99.95％重量/体积的经纯化靶蛋白组合物。

用于从混合物移除污染物或危险物的方法

本发明还提供了众多使用可转换亲和试剂从混合物移除一或多种不合需要的组分(例如污染物、毒素、危险物等)的方法，其中可转换亲和试剂在第一组条件(例如结合pH)下与不合需要的组分特异性结合并且在第二组条件下不结合或不太强地结合。可转换亲和试剂可以结合到固体支撑物或底物，例如珠子或树脂。包含一或多种可转换亲和试剂的珠子或树脂可以用于柱或分批纯化。在一个实例中，将包含一或多种不合需要的组分的混合物施用到柱，其中柱填充有包含一或多种可转换亲和试剂的珠子或树脂，其中可转换亲和试剂在第一组条件(例如结合pH)下与一或多种不合需要的组分特异性结合并且在第二组条件(例如释放pH)下不结合或不太强地结合。在使混合物在柱上运行之前，可以将其调节到第一组条件(例如结合pH)并且随后通过柱的混合物将使所有、实质上所有或一部分的非所要组分移除。可以使混合物通过柱额外一或多次以便进一步耗乏混合物中的不合需要的组分。可以使第二溶液在第二组条件(例如释放pH)下通过柱以便通过从可转换亲和试剂释放不合需要的组分再生珠子或树脂。此类方法可以例如用于从环境中移除毒素。此类方法还可以用于从混合物移除过敏原或其它不合需要的组分。

虽然已经在本文中展示和描述了本发明的优选实施例，但本领域的技术人员应清楚，此类实施例仅是作为举例而提供的。本领域的技术人员现在将在不脱离本发明的情况下想到众多变型、变化和取代。应理解，本文所述的本发明的实施例的各个替代方案都可以用于实践本发明。预期，随附权利要求书界定本发明的范围，并且因此涵盖这些权利要求书和其等效物的范围内的方法和结构。

实例

实例1：DNA库的制备

为了获得DNA库，使用标准亚磷酰胺化学反应合成3072个40聚体寡核苷酸。每个寡核苷酸的5′20个碱基由非编码区序列组成，而3′20个碱基由密码子序列组成。寡核苷酸中有1536个是“正向”读取，寡核苷酸中有1536个是“反义”。将寡核苷酸从A型密码子(A001-A384正向，和A001’-A384’反义)、B型密码子(B1-B384正向，和B001’-B384’反义)等等到E型密码子所专有的5个组中的每一者分成8个子池。将寡核苷酸在1×T4多核苷酸激酶(PNK)缓冲液(法门塔斯(Fermentas))中稀释到4.5μM浓度。将寡核苷酸加热到95℃持续5分钟以使其变性，并且随后经一小时冷却到室温以杂交。将8个来自5组中的每一者的子池汇集以产生5个池。所得构筑体包含2个寡核苷酸，其已经沿着其3′末端的前20个碱基退火但在其5′20个碱基处未退火。将构筑体用T4PNK(法门塔斯)用3.2μM寡核苷酸、1mM ATP、1×PNK缓冲液、0.11个单位/μl PNK于750μl体积中磷酸化，在37℃下反应8小时。通过正丁醇萃取将反应物浓缩到250ul，并且用MgCl₂使十乙醇沉淀到10mM和1.25ml乙醇。将沉淀物再悬浮于200ul TAE中并且通过琼脂糖凝胶电泳纯化。将来自每个编码区的等摩尔量合并用于连接。在37C下用5％PEG4000、1×T4连接酶缓冲液、0.1个单位的DNA连接酶/ul于500ul中对15ug经纯化构筑体进行连接反应过夜。对反应物进行苯酚/氯仿萃取，通过正丁醇萃取浓缩到300ul并且通过异丙醇沉淀。将沉淀物溶解于30ul H2O中并且添加30ul甲酰胺负载染料。在5％TBE甲酰胺(40％)-脲(7M)变性凝胶上纯化组装库的连接反应物。在凝胶纯化之后，使库PCR扩增。

实例2：杂交阵列的构筑和寡核苷酸的连接

使用迭尔林(Delrin)聚合物构筑杂交阵列。使用Epilog36ext激光切割器将孔切成阵列。阵列含有叠氮基-琼脂糖凝胶，其允许寡核苷酸点击到阵列上。为了使寡核苷酸与阵列连接，将阵列放置到化学机器人(chembot)(阵列与384孔板接头)中，以促进在阵列上以特征特异性方式进行反应。通过点击化学反应试剂溶液实现寡核苷酸与阵列的连接，将所述溶液快速添加到寡核苷酸中并且随后将点击试剂与寡核苷酸的混合物快速添加到化学机器人上的适当孔中。使反应在室温下运行15分钟，接着使反应溶液旋转通过阵列，从化学机器人中出来进入接收板中。将反应混合物再添加到化学机器人孔中，并且再反应15分钟。在那个15分钟反应期间，添加第二等分试样的抗坏血酸盐到接收板的每个孔中。使反应混合物旋转通过阵列，从化学机器人中出来并且进入接收板中，在所述接收板中其与新鲜抗坏血酸盐混合。再进行两个15分钟的反应，在其之间进行旋转出和再装。在反应完成之后，通过将“淬灭”缓冲液倾注到化学机器人顶上的浅储槽中并且使缓冲液在真空歧管上牵拉通过6或7次来洗涤阵列。“淬灭”缓冲液是100mM Tris pH 8、10mM EDTA pH 8、0.005％曲拉通x-100、0.02％SDS。将阵列贮藏于阵列贮藏缓冲液中：10mM Tris、1mM EDTA、150mM NaCl、0.01％叠氮化物、0.005％曲拉通x-100。

实例3：dsDNA向杂交准备的DNA(hrDNA)的转化

将PCR用以扩增dsDNA库。使用T7RNA聚合酶来体外转录PCR产物。使用氯化锂沉淀来纯化RNA。反转录库RNA。使用乙酸钠沉淀来纯化cDNA。将库与Zip寡核苷酸一起孵育，所述寡核苷酸与DNA的保守区互补。RNA的水解留下ssDNA，并且Zip寡核苷酸的退火产生构筑体，所述构筑体间歇地是单链和双链的，并且准备好通过在阵列上杂交进行分选。使用离心浓缩器来回收hrDNA。

实例4：库hrDNA与杂交阵列的结合

通过在37℃下在2×SSC、+15mM Tris pH 7.4+0.005％曲拉通X100、0.02％SDS、0.05％叠氮化钠中杂交60小时来在阵列上分选hrDNA的库。通过在40ml杂交缓冲液中洗涤20-30分钟来将非杂交DNA从阵列洗脱掉。在37℃下将12.5％杂交缓冲液于40ml dH2O中的第二洗涤缓冲液+0.005％曲拉通+0.02％SDS与阵列一起孵育20-30分钟。将DNA洗脱到384孔板中，将阵列放置在化学机器人中，添加30ul 10mMNaOH+0.005％曲拉通X100+0.02％SDS到化学机器人的每个孔中，孵育8-10分钟，并且从化学机器人中旋转出来进入384孔板中。对于每个孔用9ul 1M HOAc和9ul 1M Tris pH 7.4中和洗脱缓冲液。

实例5：类肽偶合化学反应

经由类肽偶合步骤化学翻译结合阵列的hrDNA库。将20-30ul的沉降DEAE树脂添加到过滤板的每个孔中，并且用与水1∶1混合的10mM乙酸、0.005％曲拉通X-100的结合缓冲液洗涤。将洗脱的hrDNA添加到板，随后将所述板用1×80ul结合缓冲液、2×80ul dH2O和3×80ul无水MeOH洗涤。在使用之前如下即刻制备乙酰化试剂(确切量将取决于用以捕捉DNA的沉降DEAE树脂的量而不同。使用沉降树脂的至少125％多的反应溶液体积。以下数量得到＞40ul乙酰化反应混合物/孔并且对于少于约35ul的任何树脂量足够。)：氯乙酸钠，10ml 200mM储备溶液(233mg)；DMT-MM-Cl(氯化4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓)，10ml 300mM储备溶液(830mg)。将相等体积的2种储备溶液快速合并，涡旋，并且敏捷地等分到孔中，30ul/孔，反应15分钟，并且在真空歧管上排出。将样品用1×80ul无水MeOH洗涤两次并且用3×80ul无水MeOH、1×80ul dH2O、3×80ul DMSO洗涤一次。

实例6：三嗪偶合化学反应

添加5ul饱和K₂B₄O₇(pH 9.2)到384孔板中。在37℃下在杂交缓冲液中洗涤阵列3×20分钟。将DNA用3×30ul洗脱缓冲液洗脱到库洗脱板中。添加6ul约250mM三聚氯化氰到单独的384孔板中。通过将DNA从库洗脱板转移到含有三聚氯化氰的板来起始反应，并且在4℃下反应1小时。使三嗪加合物与胺合成子反应。将过滤板用25ul DEAE树脂装载并且用4×80ul DEAE结合缓冲液洗涤。添加11ul来自表5的R1或R2部分的合成子到单独的合成子混合物板中。将56ul三聚氯化氰反应物添加到过滤板的每个孔中，混合，孵育5分钟，并且排出。重复这个直到三聚氯化氰反应板的所有物质都转移到过滤板。将过滤板中的DEAE树脂立即用2×80ul ACN、2×80ul dH2O洗涤。将过滤板塞住并且添加45ul 75mM K₂B₄O₇pH 9.5到其中。将来自合成子混合物板的合成子混合物添加到过滤板并且在4℃下反应16小时。将DEAE树脂用3×80ulACN、2×80ul dH2O洗涤。通过添加6ul 1M Tris pH 7.4和4×33ul DEAE洗脱缓冲液(含有50mM NaOH)到新板(标记为DEAE洗脱板)的每个孔中来洗脱DNA，在各洗脱之间进行4分钟孵育。在离心浓缩器中浓缩洗脱液。随后如上所述通过杂交再分选hrDNA。通过添加9ul饱和硼酸盐、洗脱的hrDNA和30ul合成子混合物(例如从表5的R3部分得到的合成子)到接收板的每个孔中来进行第二合成步骤。使板在80℃下反应6小时。将具有较低溶解度的合成子用45ul dH2O经由混合60秒来沉淀，并且在569×g下离心30分钟。将上清液从板移出并且合并。将DNA用33ul洗脱缓冲液(1.5M NaCl+0.05M NaOH+0.005％曲拉通)从接收板洗脱三次。

实例7：hrDNA向双链DNA的转化

将洗脱的hrDNA通过醇沉淀来脱盐并且在单循环PCR反应中变成双链。循环条件包括在95℃下7分钟的初始变性，在57℃下1分钟的退火步骤，和在72℃下10分钟的延伸。通过醇沉淀来纯化PCR产物。

实例8：可转换亲和试剂的选择

制造10mM Bis-Tris-丙烷缓冲液。向每个pH的缓冲液中，添加吐温(Tween)(到0.5％)(和0.05％曲拉通)、tRNA(60ng/ul)和BSA(0.2mg/ml)。添加50ul抗生蛋白链菌素珠子到500ul生物素化大肠杆菌溶菌液中。单独地，添加12ul抗生蛋白链菌素珠子到生物素化核酮糖二磷酸羧化酶加氧酶和豆血红蛋白中。使溶菌液通过柱，用4mL适当pH缓冲液洗涤，并且用60ul适当pH缓冲液洗脱。通过添加BTP达到20mM和KCl达到100mM调节库的pH。将库添加到溶菌液珠子中，孵育15分钟，并且倾注在柱上。收集溢流。添加3mM EDTA和蛋白酶抑制剂到380ul溶菌液混合物(66uM，约250倍于库)中。随后将库添加并且孵育5分钟。适当时用200mM BTP、添加KCl达到100mM对混合物进行pH调节。单独地，将标靶-珠子混合物倾注通过柱并且用1ml适当pH缓冲液洗涤。将结合珠子的标靶用100ul适当缓冲液(5个柱体积)洗脱，并且添加到库与大肠杆菌溶菌液的混合物中，并且孵育20分钟。将混合物倾注通过柱，用6000ul适当缓冲液洗涤，并且以1200ul等分试样收集。用60ul进行最后洗涤并且单独地收集。用1×60ul等分试样、1×40ul等分试样和1×60ul等分试样进行洗脱。将珠子用60ul pH 7.5缓冲液从柱冲压掉。

实例9：可转换试剂的身份

针对与以下两种蛋白质的结合来筛选库：豆血红蛋白和核酮糖二磷酸羧化酶加氧酶。配体经选择以便在低pH下结合并且在高pH下释放，以及进行高pH结合和低pH释放。在筛选之后，使多种分子增浓，并且选择以下配体结构以便进一步测试。

实例10：经受住选择的库成员的定序和选择产物的分析

通过深度定序来分析经受住选择的那些库成员。通过PCR使所选择的库扩增。所需的PCR回合的数目随选择严格度而变化，越严格选择的库需要越多循环。通过DNA定序服务的商业提供商使用伊路米那(Illumina)MiSeq仪器进行定序。根据个别提供商的说明书制备库。定序产生约1500万个DNA序列/实验。

统计上分析DNA序列以确定选择中的哪些库成员能够以pH依赖性方式结合靶蛋白。如果库成员符合以下准则，那么其被视为所选：编码库成员的序列的相对丰度在选择之后必须增浓，编码库成员的不同基因的数目必须大于1，库成员必须是也增浓的具有类似化学结构的库成员家族的一部分，库成员在不存在所要标靶下进行的阴性对照选择中必须也不增浓，库成员在对于其它标靶的选择中必须也不增浓，库成员在对于相同标靶在其它条件下的选择中必须不增浓(例如，如果针对于在酸中结合核酮糖二磷酸羧化酶加氧酶并且在碱中洗脱的选择中增浓的库成员来说，还见到其于在碱中结合核酮糖二磷酸羧化酶加氧酶并且在酸中洗脱的选择中增浓，那么不考虑其)。例示性结果概述于以上表1-4中。

预示性实例11：产生用于纯化靶蛋白的可转换试剂

所选择的分子将结合到一组珠子并且将混合以产生四种不同树脂。树脂将填充到四个大柱中，所述柱的柱横截面直径可能大于4米。这些柱通常用于工艺开发和制造。

预示性实例12：纯化核酮糖二磷酸羧化酶加氧酶和豆血红蛋白

将实例11中所述的树脂用以通过柱纯化方法纯化靶蛋白。将含有与靶蛋白核酮糖二磷酸羧化酶加氧酶结合的pH可转换试剂的柱用以纯化核酮糖二磷酸羧化酶加氧酶。类似地，将含有与靶蛋白豆血红蛋白结合的pH可转换试剂的柱用以纯化豆血红蛋白。将蛋白质的混合物在第一pH下在缓冲液中流动到柱上，所述pH有助于核酮糖二磷酸羧化酶加氧酶或豆血红蛋白与树脂结合。将柱在类似缓冲液中洗涤以移除非特异性结合蛋白。为了将蛋白质从柱洗脱，将柱在第二pH下在缓冲液中洗涤，所述pH有助于靶蛋白从树脂释放。使所收集的蛋白质进行下游的其他工艺以便生产消费食品产品。

表5.合成子表

R₁的化学多样性要素

2-苯基丙胺、4-甲基苯甲胺、2-苯基乙胺、苯甲胺、3-苯基丙胺、4-(2-氨基甲基)苯磺酰胺、2-甲基丁胺、异戊胺、异丁胺、丁胺、炔丙胺、哌嗪、乙胺、1-氨基-3，3-二乙氧基丙烷、4-氨基-2-甲基-1-丁醇、5-氨基-1-戊醇、乙酰胺、2-氨基-N-环丙基-1-氨基-2-丁醇、N，N-双(2-氨基乙基)乙-1，2-二胺、N，N，2，2-四甲基-1，3-丙二胺、N，N-二乙基-1，3-丙二胺、N1-(2-氨基乙基)-N1-甲基乙-1，2-二胺、N，N-二甲基-1，3-丙二胺、4-(二氟甲氧基)苯甲胺、2-N-丙氧基乙胺、2-甲氧基乙胺、N-叔丁氧羰基-3-氨基丙胺、3-异丙氧基丙胺、3-(甲基硫基)丙胺、2-氨基乙基异丙醚、4-溴-2-氟苯甲胺、4-碘苯甲胺、4-溴苯甲胺、2-(4-硝基-苯基)-乙胺、3-氟-5-(三氟甲基)苯甲胺、4-硝基-苯甲胺、3-溴苯甲胺、3-氯-2，6-二氟苯甲胺、3，4-二氯苯甲胺、4-(三氟甲基)苯甲胺、2-(3-氯苯基)乙胺、2-(4-氯苯基)乙胺、3-氯苯甲胺、2-氯苯甲胺、3-氟苯乙胺、4-氟苯乙胺、3-氟苯甲胺、四氢糠胺、4-(2-氨基乙基)-1-苯甲基哌啶、(2，2-二甲基-[1，3]-二氧戊环-4-基)-甲胺、N-(3-氨基丙基)吗啉、4-(2-氨基乙基)吗啉、2-(2-氨基乙基)-1-甲基吡咯烷、4-(氨基甲基)哌啶、2-(氨基甲基)-1-乙基吡咯烷、4-吡咯烷丁胺、1-(3-氨基丙基)吡咯烷、1-(3-氨基丙基)-4-甲基哌嗪、N-(3′-氨基丙基)-2-吡咯烷酮、4-氨基-1-哌啶甲酸乙酯、乙酮、2-氨基-1-(4-吗啉基)-3-氨基丙-1，2-二醇、3-氨基丙腈、3-氨基-1-丙醇、2-(2-氨基乙氧基)乙醇、2-(1H-吲哚-3-基)乙胺(色胺)、3-(2-氨基乙基)吡啶、1H-吲哚-2-甲胺、乙酰胺、2-氨基-N-(1-甲基乙基)-、2-(2-甲氧基苯基)乙胺、2-(氨基甲基)吡啶、4-(2-氨基乙基)吡啶、2-噻吩甲胺、4-(氨基甲基)吡啶、3-(氨基甲基)吡啶、3-溴-4-甲氧基苯乙胺、3-呋喃甲胺、2-喹啉甲胺、高哌嗪、丙酰胺、3-氨基-N-甲基-、2-(2-呋喃基甲基硫基)乙胺、4-(2-氨基乙基)苯磺酰胺、5-氨基甲基-2-氯吡啶、5-甲氧基色胺、N-乙酰基乙二胺、溴化S-(2-氨基乙基)异硫尿鎓、高牛磺酸、(R)-1-(3-甲氧基苯基)乙胺、2-(3，4-二甲氧基苯基)乙胺、3-甲氧基苯乙胺、2-(4-甲氧基苯基)乙胺、4-甲氧基苯甲胺、2-苯氧基乙胺、2-甲氧基苯甲胺、3-甲氧基苯甲胺

R₂的化学多样性要素

2-苯基丙胺、4-甲基苯甲胺、2-苯基乙胺、苯甲胺、3-苯基丙胺、4-(2-氨基甲基)苯磺酰胺、2-甲基丁胺、异戊胺、异丁胺、丁胺、炔丙胺、哌嗪、乙胺、1-氨基-3，3-二乙氧基丙烷、4-氨基-2-甲基-1-丁醇、5-氨基-1-戊醇、乙酰胺、2-氨基-N-环丙基-、1-氨基-2-丁醇、N，N-双(2-氨基乙基)乙-1，2-二胺、N，N，2，2-四甲基-1，3-丙二胺、N，N-二乙基-1，3-丙二胺、N1-(2-氨基乙基)-N1-甲基乙-1，2-二胺、N，N-二甲基-1，3-丙二胺、4-(二氟甲氧基)苯甲胺、2-N-丙氧基乙胺、2-甲氧基乙胺、N-叔丁氧羰基-3-氨基丙胺、3-异丙氧基丙胺、3-(甲基硫基)丙胺、2-氨基乙基异丙醚、4-溴-2-氟苯甲胺、4-碘苯甲胺、4-溴苯甲胺、2-(4-硝基-苯基)-乙胺、3-氟-5-(三氟甲基)苯甲胺、4-硝基-苯甲胺、3-溴苯甲胺、3-氯-2，6-二氟苯甲胺、3，4-二氯苯甲胺、4-(三氟甲基)苯甲胺、2-(3-氯苯基)乙胺、2-(4-氯苯基)乙胺、3-氯苯甲胺、2-氯苯甲胺、3-氟苯乙胺、4-氟苯乙胺、3-氟苯甲胺、四氢糠胺、4-(2-氨基乙基)-1-苯甲基哌啶、(2，2-二甲基-[1，3]-二氧戊环-4-基)-甲胺、N-(3-氨基丙基)吗啉、4-(2-氨基乙基)吗啉、2-(2-氨基乙基)-1-甲基吡咯烷、4-(氨基甲基)哌啶、2-(氨基甲基)-1-乙基吡咯烷、4-吡咯烷丁胺、1-(3-氨基丙基)吡咯烷、1-(3-氨基丙基)-4-甲基哌嗪、N-(3′-氨基丙基)-2-吡咯烷酮、4-氨基-1-哌啶甲酸乙酯、乙酮、2-氨基-1-(4-吗啉基)-、3-氨基丙-1，2-二醇、3-氨基丙腈、3-氨基-1-丙醇、2-(2-氨基乙氧基)乙醇、2-(1H-吲哚-3-基)乙胺(色胺)、3-(2-氨基乙基)吡啶、1H-吲哚-2-甲胺、乙酰胺、2-氨基-N-(1-甲基乙基)-、2-(2-甲氧基苯基)乙胺、2-(氨基甲基)吡啶、4-(2-氨基乙基)吡啶、2-噻吩甲胺、4-(氨基甲基)吡啶、3-(氨基甲基)吡啶、3-溴-4-甲氧基苯乙胺、3-呋喃甲胺、2-喹啉甲胺、高哌嗪、丙酰胺、3-氨基-N-甲基-、2-(2-呋喃基甲基硫基)乙胺、4-(2-氨基乙基)苯磺酰胺、5-氨基甲基-2-氯吡啶、5-甲氧基色胺、N-乙酰基乙二胺、溴化S-(2-氨基乙基)异硫尿鎓、高牛磺酸、(R)-1-(3-甲氧基苯基)乙胺、2-(3，4-二甲氧基苯基)乙胺、3-甲氧基苯乙胺、2-(4-甲氧基苯基)乙胺、4-甲氧基苯甲胺、2-苯氧基乙胺、2-甲氧基苯甲胺、3-甲氧基苯甲胺、(Z)-4-氯-2-丁烯-1-胺、2-(1-环己烯基)乙胺、3-甲氧基丙胺、3-乙氧基丙胺、3-N-丙氧基丙胺、2-乙氧基乙胺、3-碘苯甲胺、3-(三氟甲基)苯甲胺、4-(4-氟苯氧基)苯甲胺、3，4-亚甲二氧基苯甲胺、8-喹啉甲胺、4-吡啶甲胺、2-(二甲基氨基)-、硫酸氢2-氨基乙酯、氨基甲磺酸、3，4，5-三甲氧基苯甲胺、DL-1-(1-萘基)乙胺、(S)-(-)-1-(4-甲基苯基)乙胺、(S)-(-)-β-甲基苯乙胺、(R)-(-)-1-氨基茚满、(S)-(-)-1-苯基乙胺、(R)-(+)-1-苯基乙胺、1-苯基丁-3-胺、D-苯基丙氨醇、(1R，2S)-1-氨基-2-茚满醇、2-氨基-3，3-二甲基丁烷、1，3-二甲基丁胺、仲丁胺、异丙胺、2-氨基-1-甲氧基丁烷、(S)-2-氨基-1-苯基乙醇、(S)-(+)-2-氨基-1-戊醇、(R)-(-)-2-氨基-1-丁醇、L-白氨酰胺、环戊胺、环丙胺、反-4-氨基环己醇、(1S，2S)-(+)-2-苯甲氧基环己胺、(1R，2R)-(-)-2-苯甲氧基环戊胺、2-(2-氯苯基)乙胺、2-氟苯乙胺、(1R，2R)-(-)-2-氨基-1-(4-硝基苯基)-1，3-丙二醇、4-氨基四氢吡喃、DL-高半胱氨酸硫代内酯、DL-α-氨基-ε-己内酰胺、茚满-5-基胺、4-氨基吡啶、N-(3-氨基丙基)-N-甲基苯胺、2-氟乙胺、α-苯基氨基乙腈、(1R，2R)-(-)-2-氨基-1-苯基-1，3-丙二醇、β丙氨酸萘酰胺、L-白氨酸-4-硝基苯胺、2-氨基-3-甲基-3-硫基丁酸、(S)-(-)-1-(3-甲氧基苯基)乙胺、(S)-(-)-1-(4-甲氧基苯基)乙胺、反-2，5-二甲基哌嗪、9-氨基芴、2，4，6-三甲基苯胺、2，4-二甲基苯胺、3，5-二甲基苯胺、2，5-二甲基苯胺、2-甲基苯胺、2，6-二乙基苯胺、3-异丙基苯胺、4-异丙基苯胺、间氨基苯甲酰胺、4-氨基苯甲酰胺、3-硝基苯胺、2，6-二氟苯胺、3′，4′-二氟苯胺、3-氯苯胺、2-氯苯胺、2-氟-苯胺、4-氟苯胺、3，4-亚甲二氧基-1-氨基苯、2-氨基吡嗪、3-氨基吡啶、2-氨基吡啶、4-甲基-1，3-噻唑-2-胺、2-氨基嘧啶、5-氨基-1H-四唑、4-乙氧基苯胺、2-(甲基巯基)苯胺、2-乙氧基苯胺、邻甲氧苯胺、4-氨基-1-丁醇

R₃的化学多样性要素

2-苯基丙胺、4-甲基苯甲胺、2-苯基乙胺、苯甲胺、3-苯基丙胺、4-(2-氨基甲基)苯磺酰胺、2-甲基丁胺、异戊胺、异丁胺、丁胺、炔丙胺、哌嗪、乙胺、4-氨基-2-甲基-1-丁醇、5-氨基-1-戊醇、乙酰胺、2-氨基-N-环丙基-、1-氨基-2-丁醇、N，N-双(2-氨基乙基)乙-1，2-二胺、N，N，2，2-四甲基-1，3-丙二胺、N，N-二乙基-1，3-丙二胺、N1-(2-氨基乙基)-N1-甲基乙-1，2-二胺、N，N-二甲基-1，3-丙二胺、4-(二氟甲氧基)苯甲胺、3-(甲基硫基)丙胺、4-溴-2-氟苯甲胺、4-溴苯甲胺、2-(4-硝基-苯基)-乙胺、3-氟-5-(三氟甲基)苯甲胺、4-硝基-苯甲胺、3-溴苯甲胺、3-氯-2，6-二氟苯甲胺、3，4-二氯苯甲胺、4-(三氟甲基)苯甲胺、2-(3-氯苯基)乙胺、3-氯苯甲胺、2-氯苯甲胺、3-氟苯乙胺、4-氟苯乙胺、四氢糠胺、4-(2-氨基乙基)-1-苯甲基哌啶、(2，2-二甲基-[1，3]-二氧戊环-4-基)-甲胺、N-(3-氨基丙基)吗啉、4-(2-氨基乙基)吗啉、2-(2-氨基乙基)-1-甲基吡咯烷、4-(氨基甲基)哌啶、2-(氨基甲基)-1-乙基吡咯烷、4-吡咯烷丁胺、1-(3-氨基丙基)-4-甲基哌嗪、N-(3′-氨基丙基)-2-吡咯烷酮、4-氨基-1-哌啶甲酸乙酯、乙酮、2-氨基-1-(4-吗啉基)-、3-氨基丙-1，2-二醇、3-氨基丙腈、3-氨基-1-丙醇、2-(2-氨基乙氧基)乙醇、2-(1H-吲哚-3-基)乙胺(色胺)、3-(2-氨基乙基)吡啶、1H-吲哚-2-甲胺、乙酰胺、2-氨基-N-(1-甲基乙基)-、2-(2-甲氧基苯基)乙胺、2-(氨基甲基)吡啶、4-(2-氨基乙基)吡啶、4-(氨基甲基)吡啶、3-(氨基甲基)吡啶、3-溴-4-甲氧基苯乙胺、3-呋喃甲胺、2-喹啉甲胺、高哌嗪、丙酰胺、3-氨基-N-甲基-、2-(2-呋喃基甲基硫基)乙胺、4-(2-氨基乙基)苯磺酰胺、5-甲氧基色胺、N-乙酰基乙二胺、(R)-1-(3-甲氧基苯基)乙胺、2-(3，4-二甲氧基苯基)乙胺、2-(4-甲氧基苯基)乙胺、4-甲氧基苯甲胺、2-苯氧基乙胺、2-甲氧基苯甲胺、3-甲氧基苯甲胺、(Z)-4-氯-2-丁烯-1-胺、2-(1-环己烯基)乙胺、3-甲氧基丙胺、3-乙氧基丙胺、3-N-丙氧基丙胺、2-乙氧基乙胺、3-碘苯甲胺、3-(三氟甲基)苯甲胺、4-(4-氟苯氧基)苯甲胺、3，4-亚甲二氧基苯甲胺、8-喹啉甲胺、4-吡啶甲胺、2-(二甲基氨基)-、硫酸氢2-氨基乙酯、氨基甲磺酸、3，4，5-三甲氧基苯甲胺、DL-1-(1-萘基)乙胺、(S)-(-)-1-(4-甲基苯基)乙胺、1-苯基丁-3-胺、D-苯基丙氨醇、(1R，2S)-1-氨基-2-茚满醇、2-氨基-3，3-二甲基丁烷、1，3-二甲基丁胺、2-氨基-1-甲氧基丁烷、(S)-2-氨基-1-苯基乙醇、(S)-(+)-2-氨基-1-戊醇、L-白氨酰胺、环戊胺、环丙胺、反-4-氨基环己醇、(1S，2S)-(+)-2-苯甲氧基环己胺、(1R，2R)-(-)-2-苯甲氧基环戊胺、2-(2-氯苯基)乙胺、2-氟苯乙胺、(1R，2R)-(-)-2-氨基-1-(4-硝基苯基)-1，3-丙二醇、4-氨基四氢吡喃、DL-高半胱氨酸硫代内酯、DL-α-氨基-ε-己内酰胺、茚满-5-基胺、4-氨基吡啶、2-(氨基甲基)哌啶、1-(3-氨基丙基)-2-哌可啉、苯丙酸、β-(氨基甲基)-、苯乙酸、A-(氨基甲基)-、苯甲酸、2-(氨基甲基)-、6-氨基己酸、戊酸、5-氨基-、环己烷甲酸、4-(氨基甲基)-、(2S)-4-氨基-2-羟基-丁酸、N-(3-氨基丙基)-N-甲基苯胺、酪胺、苯酚、3-(氨基甲基)-、3-甲氧基酪胺、2-氟乙胺、3-氨基吡咯烷、4-氨基哌啶、苯基丙氨酸、3，5-二甲基-、谷氨酸、D-苯基丙氨酸、3-氟-、苯乙酸、A-氨基-4-氟-、酪氨酸、3-氟-、4-吡啶丙酸、A-氨基-、(αR)-、天冬酰胺、α-苯基氨基乙腈、(1R，2R)-(-)-2-氨基-1-苯基-1，3-丙二醇、β丙氨酸萘酰胺、L-白氨酸-4-硝基苯胺、2-氨基-3-甲基-3-硫基丁酸、1，2，3，4-四氢-1-萘胺、(S)-(-)-1-(3-甲氧基苯基)乙胺、(S)-(-)-1-(4-甲氧基苯基)乙胺、反-2，5-二甲基哌嗪、顺-2，6二甲基哌嗪、3-吡咯烷甲酸、1H-咪唑、1-(3-吡咯烷基)-、吡咯烷、3-(甲磺酰基)-、3-吡咯烷甲酰胺、9-氨基芴、2，6-二乙基苯胺、间氨基苯甲酰胺、3-硝基苯胺、3，4-亚甲二氧基-1-氨基苯、2-氨基吡嗪、4-乙氧基苯胺、1H-吲哚-5-醇、3-(2-氨基乙基)-、D-苯基丙氨酸、谷氨酰胺、苯丙酸、B-氨基-3，4-DI羟基-、丁酸、2-氨基-4，4，4-三氟-、丁酸、2-氨基-3-羟基-、3-噻吩丙酸、α-氨基-、3-噻吩乙酸、α-氨基-、2-吗啉乙酸、苯甲酸、4-氨基-3-羟基-、1H-吡唑-3-甲酸、5-氨基-、4-氨基-1-丁醇、4-二甲基氨基苯甲胺

R₄的化学多样性要素

2-苯基丙胺、4-甲基苯甲胺、2-苯基乙胺、苯甲胺、3-苯基丙胺、4-(2-氨基甲基)苯磺酰胺、2-甲基丁胺、异戊胺、异丁胺、丁胺、炔丙胺、(Z)-4-氯-2-丁烯-1-胺、2-(1-环己烯基)乙胺、3-甲氧基丙胺、3-乙氧基丙胺、3-N-丙氧基丙胺、2-乙氧基乙胺、3-碘苯甲胺、3-(三氟甲基)苯甲胺、4-(4-氟苯氧基)苯甲胺、3，4-亚甲二氧基苯甲胺、8-喹啉甲胺、4-吡啶甲胺、2-(二甲基氨基)-、哌嗪、乙胺、1-氨基-3，3-二乙氧基丙烷、4-氨基-2-甲基-1-丁醇、5-氨基-1-戊醇、乙酰胺、2-氨基-N-环丙基-、1-氨基-2-丁醇、N，N-双(2-氨基乙基)乙-1，2-二胺、N，N，2，2-四甲基-1，3-丙二胺、N，N-二乙基-1，3-丙二胺、N1-(2-氨基乙基)-N1-甲基乙-1，2-二胺、N，N-二甲基-1，3-丙二胺、3，4，5-三甲氧基苯甲胺、DL-1-(1-萘基)乙胺、(S)-(-)-1-(4-甲基苯基)乙胺、(S)-(-)-β-甲基苯乙胺、(R)-(-)-1-氨基茚满、(S)-(-)-1-苯基乙胺、(R)-(+)-1-苯基乙胺、1-苯基丁-3-胺、D-苯基丙氨醇、(1R，2S)-1-氨基-2-茚满醇、2-氨基-3，3-二甲基丁烷、1，3-二甲基丁胺、4-(二氟甲氧基)苯甲胺、2-N-丙氧基乙胺、2-甲氧基乙胺、N-叔丁氧羰基-3-氨基丙胺、3-异丙氧基丙胺、3-(甲基硫基)丙胺、2-氨基乙基异丙醚、4-溴-2-氟苯甲胺、4-碘苯甲胺、4-溴苯甲胺、2-(4-硝基-苯基)-乙胺、3-氟-5-(三氟甲基)苯甲胺、仲丁胺、异丙胺、2-氨基-1-甲氧基丁烷、(S)-2-氨基-1-苯基乙醇、(S)-(+)-2-氨基-1-戊醇、(R)-(-)-2-氨基-1-丁醇、L-白氨酰胺、环戊胺、环丙胺、反-4-氨基环己醇、(1S，2S)-(+)-2-苯甲氧基环己胺、(1R，2R)-(-)-2-苯甲氧基环戊胺、4-硝基-苯甲胺、3-溴苯甲胺、3-氯-2，6-二氟苯甲胺、3，4-二氯苯甲胺、4-(三氟甲基)苯甲胺、2-(3-氯苯基)乙胺、2-(4-氯苯基)乙胺、3-氯苯甲胺、2-氯苯甲胺、3-氟苯乙胺、4-氟苯乙胺、3-氟苯甲胺、2-(2-氯苯基)乙胺、2-氟苯乙胺、(1R，2R)-(-)-2-氨基-1-(4-硝基苯基)-1，3-丙二醇、4-氨基四氢吡喃、DL-高半胱氨酸硫代内酯、DL-α-氨基-ε-己内酰胺、茚满-5-基胺、4-氨基吡啶、2-(氨基甲基)哌啶、1-(3-氨基丙基)-2-哌可啉、苯丙酸、β-(氨基甲基)-、苯乙酸、α-(氨基甲基)-、四氢糠胺、4-(2-氨基乙基)-1-苯甲基哌啶、(2，2-二甲基-[1，3]-二氧戊环-4-基)-甲胺、N-(3-氨基丙基)吗啉、4-(2-氨基乙基)吗啉、2-(2-氨基乙基)-1-甲基吡咯烷、4-(氨基甲基)哌啶、2-(氨基甲基)-1-乙基吡咯烷、4-吡咯烷丁胺、1-(3-氨基丙基)吡咯烷、1-(3-氨基丙基)-4-甲基哌嗪、N-(3′-氨基丙基)-2-吡咯烷酮、苯甲酸、2-(氨基甲基)-、6-氨基己酸、戊酸、5-氨基-、环己烷甲酸、4-(氨基甲基)-、(2S)-4-氨基-2-羟基-丁酸、酪胺、苯酚、2-(氨基甲基)-、苯酚、4-(氨基甲基)-、3-甲氧基酪胺、2-氟乙胺、3-氨基吡咯烷、4-氨基哌啶、4-氨基-1-哌啶甲酸乙酯、乙酮、2-氨基-1-(4-吗啉基)-、3-氨基丙-1，2-二醇、3-氨基丙腈、3-氨基-1-丙醇、2-(2-氨基乙氧基)乙醇、2-(1H-吲哚-3-基)乙胺(色胺)、3-(2-氨基乙基)吡啶、1H-吲哚-2-甲胺、乙酰胺、2-氨基-N-(1-甲基乙基)-、2-(2-甲氧基苯基)乙胺、2-(氨基甲基)吡啶、苯基丙氨酸、3，5-二甲基-、谷氨酸、丁酸、2-氨基-、D-苯基丙氨酸、3-氟-、苯乙酸、α-氨基-4-氟-、酪氨酸、3-氟-、4-吡啶丙酸、A-氨基-、(αR)-、天冬酰胺、β丙氨酸萘酰胺、L-白氨酸-4-硝基苯胺、2-氨基-3-甲基-3-硫基丁酸、1，2，3，4-四氢-1-萘胺、4-(2-氨基乙基)吡啶、2-噻吩甲胺、4-(氨基甲基)吡啶、3-(氨基甲基)吡啶、3-溴-4-甲氧基苯乙胺、3-呋喃甲胺、2-喹啉甲胺、高哌嗪、丙酰胺、3-氨基-N-甲基-、2-(2-呋喃基甲基硫基)乙胺、4-(2-氨基乙基)苯磺酰胺、5-氨基甲基-2-氯吡啶、(S)-(-)-1-(3-甲氧基苯基)乙胺、(S)-(-)-1-(4-甲氧基苯基)乙胺、顺-2，6二甲基哌嗪、3-吡咯烷甲酸、3-哌啶甲酸、1H-咪唑、1-(3-吡咯烷基)-、5H-吡咯并[3，4-B]吡啶、6，7-二氢-、吡啶、2-(3-吡咯烷基)-、吡咯烷、3-(甲磺酰基)-、3-吡咯烷甲酰胺、苯基丙氨酸、4-乙基-、5-甲氧基色胺、N-乙酰基乙二胺、溴化S-(2-氨基乙基)异硫尿鎓、高牛磺酸、(R)-1-(3-甲氧基苯基)乙胺、2-(3，4-二甲氧基苯基)乙胺、3-甲氧基苯乙胺、2-(4-甲氧基苯基)乙胺、4-甲氧基苯甲胺、2-苯氧基乙胺、2-甲氧基苯甲胺、3-甲氧基苯甲胺、苯基丙氨酸、4-乙基-、苯乙酸、α-氨基-、谷氨酰胺、苯乙酸、A-氨基-4-羟基-、(αR)-、丁酸、2-氨基-3-羟基-、3-噻吩乙酸、A-氨基-、苯甲酸、2-氨基-5-羟基-、4-氨基-1-丁醇、4-二甲基氨基苯甲胺