苯硼酸修饰聚乙烯亚胺杂化磁性纳米粒子及其制备和应用

摘要

本发明属于无机材料和分析技术领域，具体涉及一种苯硼酸修饰聚乙烯亚胺杂化磁性纳米粒子及其制备方法和在尿液中修饰核苷与核糖基化代谢物选择性富集方面的应用。该磁性微球是在Fe3O4纳米粒子表面以反相微乳法包覆一层SiO2材料，然后再通过3-氨丙基三乙氧基硅烷引入氨基以及随后经戊二醛侨联聚乙烯亚胺增大氨基键合量，最后通过还原胺化反应嫁接苯硼酸官能团，形成杂化的磁性纳米粒子。该种磁性材料具有吸附容量大，选择性高，平衡时间短的特点，对尿液中痕量修饰核苷以及核糖基化代谢物选择性富集时处理简单、特异性强。该材料在挖掘新型修饰核苷或核糖基化合物癌症标志物以及其他类1,2-顺二羟基化合物富集方面展现优良前景。

说明书

技术领域：

本发明属于无机材料和分析技术领域，具体涉及一种苯硼酸修饰聚乙 烯亚胺杂化磁性纳米粒子及其制备方法和在尿液中修饰核苷与核糖基化代 谢物选择性富集方面的应用。

背景技术：

核糖核酸在许多生命过程中发挥着非常重要的作用。发生在核糖核酸 核糖上或者碱基上的多样化的修饰通常与其生物功能密切相关。核糖核苷 作为核糖核酸的末端代谢物能够直接反应核糖核酸的代谢速度。由于在细 胞内缺乏特异性的磷酸化酶，修饰核苷不能像正常核苷那样被再次合成重 新利用，因此通常从细胞中分泌出来进入体液中。在癌细胞中，受损的转 录RNA代谢最终导致修饰核苷水平异常。因此修饰核苷被作为癌症潜在标 志物广泛研究。

目前，对修饰核苷的研究主要集中在利用液相或者毛细管电泳与紫外 或质谱联用技术对修饰核苷进行定量分析。但是，检测和发掘未知的修饰 核苷对于发现新的癌症标记物具有十分重要的意义。但是，低丰度和复杂 的基质干扰为探索新型修饰核苷设置了障碍。所以，适宜的预处理手段对 于修饰核苷的提取和检测是十分必要的。

在线SPE（质子型硼酸亲和色谱柱）面临着上样溶剂和流动相难以兼 容的问题。离线模式的SPE诸如商品化的Oasis WCX,Bond Elut Plexa,and  Oasis HLB常常因为较差的选择性和低的绝对回收率限制了它们的应用。像 Affi-Gel 601这种硼酸吸附剂由于在改变pH条件下能可逆的与修饰核苷中 核糖上的1，2顺二羟基形成可逆的5或6元环酯而广泛应用高选择的捕获 修饰核苷。然而该种材料需要繁琐的活化前处理和低的上样量，和较长的 操作时间，大大限制了处理的通量。近年来，硼酸功能化的纳米粒子引起 了广泛关注，尤其是磁性纳米粒子。因磁性纳米粒子具有高的比表面积， 表面易修饰，快速磁场响应的特点，因此整个操作过程简便迅速。但是， 目前的苯硼酸功能化磁性材料吸附容量和选择性还难以满足实际需求。一 般来讲，为了提高吸附容量，人们通常在材料表面经原子转移自由基聚和 法嫁接聚合物或者引入介孔结构。不幸的是，原子转移自由基反应通常要 严格控制反应条件在无水无氧下操作，介孔结构也通常会限制内部物质的 传输不利于非特异性的排除。而人们通常用于减小非特异性吸附的聚乙二 醇链在随后的官能团引入过程中常需要多步的化学改性，提高了合成的难 度。

发明内容：

本发明的目的是提供一种制备简单，吸附容量高，选择性强，可高效 对痕量1，2-顺二羟基代谢物进行特异性捕获的苯硼酸修饰聚乙烯亚胺杂化 磁性纳米粒子及其制备方法和应用。

一种苯硼酸修饰聚乙烯亚胺杂化磁性纳米粒子，由如下方法制备：先 采用溶剂热还原法合成四氧化三铁纳米粒子，然后用正硅酸四乙酯经过反 相微乳法合成具有核壳结构的单分散性Fe₃O₄@SiO₂磁性纳米粒子，通过在 Fe₃O₄@SiO₂表面硅羟基缩合3-氨丙基三乙氧基硅烷引入氨基，为进一步增 大Fe₃O₄@SiO₂表面氨基的量，随后用戊二醛经还原胺化法在Fe₃O₄@SiO₂表面侨联聚乙烯亚胺，最终再次通过还原胺化反应键合4-甲酰基苯硼酸， 即为苯硼酸修饰聚乙烯亚胺杂化磁性纳米粒子。

所述四氧化三铁磁性微球的粒径为6-10nm，中间层氧化硅层的厚度 为28-35nm，外层键入苯硼酸官能团的聚乙烯亚胺层厚度为2-5nm。

具体步骤：

第一步 先采用溶剂热还原法合成四氧化三铁纳米粒子：以0.5-0.6g 乙酰丙酮铁为原料，用30-45ml正辛醇作溶剂，加入8-12ml正辛胺，反应 温度为220-260℃，反应时间为1-3小时，得到Fe₃O₄磁性纳米粒子；

第二步 采用反相微乳法合成具有核壳结构的Fe₃O₄@SiO₂磁性纳米 粒子：首先对第一步制得的Fe₃O₄磁性纳米粒子用环己烷清洗以除去表层吸 附杂质，然后直接超声分散到环己烷溶液中形成0.5mg/mL的Fe₃O₄/环己 烷溶液备用；

将13-17g表面活性剂（Igepal CO-520）溶解于280-350mL环己烷随 后再加入25-32mL Fe₃O₄/环己烷溶液，经过2-6小时充分搅拌，加入2.5-3.2 mL质量浓度28-30%浓氨水反应1-3小时，最后在室温搅拌条件下逐滴加 入1.8-2.4mL正硅酸四乙酯，反应20-26小时，经过水和异丙醇清洗之后得 到Fe₃O₄@SiO₂磁性纳米粒子；

第三步 在Fe₃O₄@SiO₂表面引入氨基：将第二步得到的Fe₃O₄@SiO₂磁性纳米粒子分散到异丙醇溶液中，其浓度比例为在1g/500mL-1g/800mL 之内，超声分散后，将8-11mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷逐滴滴入溶液中，在 氩气保护条件下，常温反应20-28小时；

第四步 合成聚乙烯亚胺修饰的磁性纳米粒子：第三步得到的产物用水 以及甲醇先后分别清洗后，分散于250-350mL冰醋酸/甲醇混合溶液中，随 后加入2-4mL戊二醛于30-50度水浴反应8-15小时，产物经冰醋酸/甲醇 溶液洗2-3次后再次分散于250-350mL冰醋酸/甲醇溶液中，加入0.05-0.2g 聚乙烯亚胺（重均分子量10000-75000）以及100-400mg硼氢化钠还原反 应8-15小时；其中，冰醋酸/甲醇体积比为1:100-1:150.

第五步 苯硼酸修饰：向第四步得到的产物加入4-甲酰基苯硼酸以及 200-500mg硼氢化钠30-50度反应8-15小时，其中，4-甲酰基苯硼酸的加 入量为第四步得到的产物重量的20-100%。

直接将上述磁性纳米粒子加入含有修饰核苷和核糖基代谢物在内的 1,2-顺二羟基化合物复杂基质溶液中，进行痕量1,2-顺二羟基化合物的分离 富集。

由于上述技术方案的采用，与现有技术相比，本发明具有如下优点： 本发明提出的磁性纳米粒子，可作为一种亲和探针对复杂生物样品中痕量 1，2-顺二羟基化合物实现高选择性富集，并结合LC/MS和中性丢失查找软 件对富集到的1，2-顺二羟基化合物进行分析和鉴定。该材料合成方法简单， 中间的磁核能提供足够的磁场响应，由于聚乙烯亚胺的引入大大提高了材 料的吸附容量和选择性。该材料在1,2-顺二羟基代谢物富集过程中展现了很 高的选择性，富集能力强和快速平衡的特点，在代谢组学领域具有良好的 实用前景和应用价值。

附图说明：

图1是制备过程中不同阶段的透射电镜图以及材料的磁滞回线。(a) 溶剂热法合成的四氧化三铁纳米粒子.(b)Fe₃O₄@SiO₂核壳结构纳米粒子. (c)在Fe₃O₄@SiO₂表面修饰了聚乙烯亚胺以及4-甲酰基苯硼酸.(d)苯硼酸 修饰聚乙烯亚胺杂化磁性纳米粒子磁滞回线。从图中可以观测到材料具有 典型核壳结构，较好的分散性和均一的包覆性，和较强的磁性。

图2是4-甲酰基苯硼酸键合前后红外光谱图。(a)苯硼酸修饰聚乙烯 亚胺杂化磁性纳米粒子。(b)嫁接了聚乙烯亚胺的Fe₃O₄@SiO₂纳米粒子. 由图可知，4-甲酰基苯硼酸已经成功键合到材料表面。

图3是用苯硼酸修饰聚乙烯亚胺杂化磁性纳米粒子处理非顺二羟基混 合物（a,b,c）以及1,3-顺二羟基混合物(d,e)与1,2顺二羟基混合物按照摩尔 比1:1，10:1；100:1；100:1；1000:1的前后对比图。比较处理前的（i）图 和处理后的（ii）图可知该材料具有很强的选择性和稳定的回收率。

图4是苯硼酸修饰聚乙烯亚胺杂化磁性纳米粒子处理实际尿液前后提 取离子流色谱图。处理前(a)后(b)的对比可以得知该材料具有优良的富集能 力。

图5是本发明反应过程图（TEOS:正硅酸四乙酯;APTES:3-氨丙基三 乙氧基硅烷；PEI:聚乙烯亚胺；4-FPBA:4-甲酰基苯硼酸）

具体实施方式：

苯硼酸修饰聚乙烯亚胺杂化磁性纳米粒子的具体合成方法是：先采用 溶剂热还原法合成四氧化三铁纳米粒子，然后用正硅酸四乙酯经过反相微 乳法合成具有核壳结构的单分散性Fe₃O₄@SiO₂磁性纳米粒子，再通过材料 表面硅羟基缩合3-氨丙基三乙氧基硅烷引入氨基，为进一步增大材料表面 氨基的量，随后用戊二醛经还原胺化法侨联在材料表面引入聚乙烯亚胺， 最终再次通过还原胺化反应键合4-甲酰基苯硼酸：其中，四氧化三铁磁性 微球的粒径为6-10nm，中间层氧化硅层的厚度为28-35nm，外层键入苯硼 酸官能团的聚乙烯亚胺层厚度为2-3nm。：

通过具体实例对本发明苯硼酸修饰聚乙烯亚胺杂化磁性纳米粒子材料用 于尿液中1，2-顺二羟基化合物选择性富集过程进行细致阐述.

实施实例1.苯硼酸修饰聚乙烯亚胺杂化磁性纳米粒子合成。整个合成 反应分成五步：

第一步先采用溶剂热还原法合成四氧化三铁纳米粒子：以0.5297g 乙酰丙酮铁为原料，用36mL正辛醇作反应溶剂，加入12mL正辛胺，反 应温度为240℃，反应时间为2小时，得到Fe₃O₄磁性纳米粒子。

第二步采用反相微乳法合成具有核壳结构的Fe₃O₄@SiO₂磁性纳米 粒子：首先对第一步制得的Fe₃O₄磁性纳米粒子用环己烷清洗以除去表层吸 附杂质，然后超声直接分散到环己烷溶液中形成0.5mg/mL Fe₃O₄/环己烷 溶液备用。16.56g Igepal CO-520溶解于324mL环己烷随后再加入28.8 mL Fe₃O₄/环己烷溶液。经过2-6小时充分搅拌，加入2.88mL 28-30%浓 氨水持续搅拌2小时形成均匀微乳。最后在室温搅拌条件下逐滴加入2.16 mL正硅酸四乙酯，反应24小时。分别经过水和异丙醇清洗之后得到Fe₃O₄@ SiO₂磁性纳米粒子。

第三步在Fe₃O₄@SiO₂表面引入氨基。第二步得到的Fe₃O₄@SiO₂磁 性纳米粒子分散异丙醇溶液中，其浓度比例在1g/600mL之内。材料经过超 声分散后，将10mL3-氨丙基三乙氧基硅烷逐滴滴入溶液中，在Ar气保护 条件下，常温反应24小时。

第四步合成聚乙烯亚胺修饰的磁性纳米粒子：第三步得到产物用水以 及甲醇清洗后，分散于300mL冰醋酸/甲醇溶液中，二者比例为1：125.随 后加入3mL戊二醛于40度水浴反应10小时，产物经冰醋酸/甲醇溶液洗 两次后再次分散于300mL冰醋酸/甲醇溶液中,加入0.2g聚乙烯亚胺（重均 分子量10000-75000）以及300mg硼氢化钠于40度还原反应10小时。

第五步苯硼酸修饰：第四步得到的产物经过冰醋酸/甲醇溶液反复清 洗后再次分散于300mL比例为1:125冰醋酸/甲醇溶液中，按重量比例20% 加入4-甲酰基苯硼酸以及300mg硼氢化钠40度反应10小时。

实施实例2.选择性富集尿液中的修饰核苷和LC/MS分析。

(1)尿液预处理。尿液（-80度保存正常人尿液）经过解冻，15000 rpm/min离心15min后，加入氨水（质量浓度0.01%）调节尿液pH至9， 在1mL碱性的尿液中加苯硼酸修饰聚乙烯亚胺杂化磁性纳米粒子150mg, 超声分散1分钟后涡旋振荡2分钟。经磁场分离磁性纳米粒子后去掉上清， 材料用pH9氨水洗材料三次后用5-200mM甲酸水溶液洗脱，超声1min 涡旋振荡两分钟。洗脱液冻干，质谱进样前40微升2%乙腈水溶液复溶。

（2）修饰核苷的分析。尿液中修饰核苷提取液经过LC/MS分析，三次 技术重复结果经过色谱峰匹配和提取后导出峰表。导入自主研发的中性丢 失查找软件进行分析，中性丢失的质/荷比范围为132.0423±0.0026，保留时 间差异小于3秒。得到的离子对中母离子进行数据库检索定性。鉴定结果 见表1。

表1.尿液中用苯硼酸修饰聚乙烯亚胺杂化磁性纳米粒子富集到的修饰核苷 和核糖基化代谢物(含有核糖基团的内源性小分子代谢物)

Bold:Manually extracted ion pairs for different neutral loss type

*:Verificated by nucleosides standards

Underline:reported for the first time

t_R:色谱保留时间；Precursor ion：母离子精确分子量；Name：所鉴定 化合物名称；Error：获得母离子精确分子量与理论分子量偏差。