一种β-葡聚糖修饰的脑膜炎多糖结合疫苗及其制备方法

摘要

本发明描述了一种基于β-葡聚糖修饰的脑膜炎多糖结合疫苗及其制备方法。该疫苗的制备方法由以下步骤组成：(1)溴化氰活化脑膜炎球菌多糖，然后用己二酰肼进行衍化；(2)衍化的脑膜炎球菌多糖衍生物与载体蛋白进行结合；(3)对β-葡聚糖进行活化；(4)活化的β-葡聚糖对多糖-蛋白结合物进行修饰。通过上述步骤，可制备出新型、高效的脑膜炎多糖结合疫苗，用于预防流行性脑脊髓膜炎奈瑟氏球菌引起的感染。

说明书

技术领域

本发明公开了一种基于β-葡聚糖修饰而制得的新型脑膜炎多糖结合疫苗，该疫苗可用于预防流行性脑膜炎等疾病，属于生物医药领域。

背景技术

流行性脑膜炎是由脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)引起脑膜发炎的急性呼吸道传染病，流行地域极广，遍及全球各地。流行性脑膜炎的发病周期大约为3-5年，每8-10年爆发一次大流行。流行性脑膜炎的病情复杂多变，轻重不一，有3种临床表现，即普通型、暴发型、慢性败血症型。潜伏期1-7天，一般为2-3天。脑膜炎奈瑟菌隐藏于患者或带菌者的鼻、咽分泌物中，主要通过咳嗽、打喷嚏、说话等由飞沫直接从空气传播，通过进入呼吸道引起感染，传染性很强。通常以7岁以下儿童的发病率最高，学校、工地和商场等人群集中的地区为易发地。

抗生素虽然可有效抑制流行性脑膜炎的发生，但经常会产生一些后遗症及并发症。随着抗生素的过度使用，细菌耐药菌株数量和种类迅速增长，使得流行性脑膜炎的治愈更加困难。因此，人们需要对流行性脑膜炎进行积极地预防。化学预防可在密切接触人群中防止继发病例的发生。由于继发病例仅占全部脑膜炎奈瑟菌病例的1-2％，化学预防对于控制大多数地方性和流行性疾病的价值甚小。因此，使用安全有效的疫苗进行免疫接种是控制流行性脑膜炎唯一的合理方法。脑膜炎奈瑟菌荚膜多糖是引起流行性脑膜炎的主要致病因子，脑膜炎奈瑟菌按其荚膜多糖的特异性可分为A、B、C、D、29E、H、I、K、L、W₁₃₅、X、Y、Z共13个血清型致病菌。其中，A、C、W₁₃₅和Y血清型菌株的毒力最强，占总病例数的95％以上，是引起脑膜炎流行最常见的菌株。

由于脑膜炎奈瑟菌荚膜多糖属T细胞非依赖性抗原，且两岁以下儿童的免疫系统尚未成熟，对大多数荚膜多糖的免疫应答较弱，不能够达到保护人体所需的抗体水平；同时由于荚膜多糖并不能在体内诱导免疫记忆，抗体在体内的存留时间较短。因此，脑膜炎奈瑟菌荚膜多糖仅适用于5岁以上的儿童，不能用于2岁以下儿童的常规接种。将脑膜炎奈瑟菌荚膜多糖与载体蛋白结合，可使荚膜多糖转化为T细胞依赖性抗原，从而刺激婴幼儿的T细胞依赖性抗体的合成，并可产生加强应答，同时还能提高免疫球蛋白(IgG)的抗体比例和抗体亲和力的成熟。这种多糖结合疫苗不仅适用于成人，而且适用于婴幼儿。

自上世纪八十年代至今已陆续有脑膜炎A、C、Y、W135菌群荚膜多糖与变异白喉毒素等载体蛋白的单价至四价结合疫苗的问世，均显示出了良好的安全性、免疫原性和诱导免疫记忆的功能以及较低成本的优势。然而，目前这些结合疫苗均存在接种剂量较大、免疫效率不高等缺点，亟待研发效率更高和免疫原性更强的新型多糖结合疫苗。近年来，已经从优化多糖蛋白比，合适的载体蛋白，创新的连接工艺以及在多糖蛋白中间加入连接桥方面提高结合疫苗的免疫原性。例如，在多糖蛋白中间加入连接桥聚乙二醇(PEG)使多糖特异性IgG抗体滴度增加三倍相比于未使用PEG作为连接桥的结合疫苗。

目前，越来越多的免疫调节剂受到了关注。研究发现多种天然多糖具有良好的免疫促进作用，通过与疫苗混合，可增强疫苗的免疫效果，促进机体产生细胞免疫应答与体液免疫应答。然而将免疫调节剂与多糖结合疫苗进行化学修饰或物理混合的研究，目前还没有相关的文献报道和相关的专利申请。β-葡聚糖(β-glucan)具有天然、低毒、无药物残留以及安全性等优点，可修饰到脑膜炎球菌荚膜多糖蛋白结合疫苗上进一步提高免疫原性和抗体持久性。研究表明，β-葡聚糖可影响巨噬细胞的形态、激活巨噬细胞、诱导巨噬细胞分泌较高水平的IL-1和NO，刺激T细胞向辅助性Th1细胞亚群分化，提高宿主抵抗病原微生物和肿瘤的能力，葡聚糖还可以通过与补体因子结合由旁路途径激活补体系统，促进吞噬细胞的吞噬活性。因此，基于β-葡聚糖免疫佐剂和优化多糖结合疫苗连接桥；从而实现上述免疫佐剂、荚膜多糖、载体蛋白通过新型连接桥共价连接，从而研发得到新型、高效具有强免疫原性的结合疫苗。

发明内容

本发明提供了一种制备基于β-葡聚糖修饰的脑膜炎多糖结合疫苗的方法，并依据该方法，制备出了一种新型的脑膜炎多糖结合疫苗。

本发明的脑膜炎多糖结合疫苗，其中的脑膜炎奈瑟菌多糖为血清型为A、C、W₁₃₅和Y群的脑膜炎奈瑟菌荚膜多糖。

本发明所涉及的基于β-葡聚糖修饰的脑膜炎多糖结合疫苗，其所用的载体蛋白为破伤风类毒素。

本发明所涉及的脑膜炎球菌多糖结合疫苗，其制备方法由如下步骤组成：(1)脑膜炎球菌荚膜多糖的活化反应与衍化反应；(2)脑膜炎球菌荚膜多糖与载体蛋白的偶联和纯化；(3)β-葡聚糖的活化；(4)β-葡聚糖偶联到脑膜炎多糖蛋白复合物上。

本发明所涉及的脑膜炎多糖结合疫苗，可用于免疫2个月以上各年龄段的儿童，预防儿童患A、C、W₁₃₅和Y群流行性球菌引起的感染性疾病。其特点是能显著增强脑膜炎奈瑟菌多糖抗原的免疫原性。本发明以β-葡聚糖修饰多糖-载体蛋白结合物，用于进一步提高脑膜炎多 糖结合疫苗的免疫原性，减少婴幼儿接种疫苗的次数、减轻婴幼儿的痛苦及家长的精神负担、降低免疫接种成本，并提高免疫覆盖率。

附图说明：

图1脑膜炎多糖结合疫苗的制备反应示意图。

图2凝胶过滤法分析脑膜炎多糖结合疫苗。用分析型凝胶过滤柱Superose 6(1cm×30cm)检测脑膜炎多糖结合疫苗。分析条件：流动相为20mM磷酸缓冲液(pH 7.4),流速0.5毫升/分钟，检测波长为280纳米。曲线1为破伤风类毒素(TT)，曲线2为PS-TT，曲线3为PS-TT-G。

图3脑膜炎多糖结合疫苗的分析。图a为¹H>

图4PS-TT及PS-TT-G脑膜炎多糖结合疫苗产生的多糖与蛋白特异性抗体滴度。图a为脑膜炎多糖特异性的IgG抗体滴度；图b为脑膜炎多糖特异性的IgG1和IgG2a抗体滴度；图c为脑膜炎多糖特异性的IgM抗体滴度；图d为蛋白特异性的IgG、IgG1和IgG2a抗体滴度。脑膜炎多糖与蛋白特异性抗体滴度由ELISA方法测定。

图5PS-TT/G1及PS-TT/G2脑膜炎多糖结合疫苗产生的脑膜炎多糖与蛋白特异性抗体滴度。图a为脑膜炎多糖特异性的IgG抗体滴度，图b为蛋白特异性的IgG抗体。

图6脑膜炎多糖结合疫苗产生的多糖特异性抗体的特异性。其中，(■)为A群脑膜炎多糖结合疫苗；(●)为β-葡聚糖修饰的A群脑膜炎多糖结合疫苗。

具体实施方式：

以下通过实施例进一步说明本发明。

实施例一：β-葡聚糖修饰的脑膜炎多糖蛋白结合疫苗的制备和分离纯化

(1)脑膜炎多糖-载体蛋白结合疫苗(PS-TT)的制备

将5毫克脑膜炎球菌荚膜Y群多糖(PS)溶于1.25毫升生理盐水中，用浓度为0.5摩尔/升的氢氧化钠将溶液的pH值调整为10.8，加入10微升50％(w/v)的溴化氰，反应30分钟。在活化的过程中随着pH的不断降低，用0.5摩尔/升的氢氧化钠维持溶液的pH值为10.8。活化结束后，用0.5摩尔/升的盐酸将溶液的pH值调整为8.5，随后加入0.15毫升浓度为100毫克/毫升的己二酰肼溶液，于室温下反应过夜(图1)。随后，用截留分子量为10kDa的透析袋在20mM磷酸缓冲液(pH 7.4)中透析12小时，透析三次。透析后的多糖与溶于20mM的MES缓冲液(pH 6.0)的5毫克破伤风类毒素(TT)和10毫克1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙 基碳二亚胺盐酸盐(EDC)混合，于4℃下反应过夜(图1)。随后，用截留分子量为10kDa的透析袋在20mM磷酸缓冲液(pH 7.4)中透析12小时，透析三次，得到多糖-载体蛋白结合物(PS-TT)。

(2)β-葡聚糖的活化

将45毫克的高碘酸钠放入用锡箔纸包裹的试管中，溶于2.1毫升的20mM醋酸-醋酸钠缓冲液(pH 5.8)中，配成终浓度为100mM的高碘酸钠溶液。将15毫克β-葡聚糖溶于5.7毫升的20mM的20mM醋酸-醋酸钠缓冲液(pH 5.8)中，包上锡箔纸，加入0.3毫升100mM的高碘酸钠溶液。反应45分钟后(图1)，去掉锡箔纸，加入20乙二醇微升终止反应。随后，用截留分子量为10kDa的透析袋在20mM磷酸缓冲液(pH 7.4)中透析12小时，透析三次。

(3)β-葡聚糖共价修饰PS-TT

将透析后的β-葡聚糖与透析后的PS-TT混合，随后加入0.5毫升浓度为10毫克/毫升的NaCNBH₃，于4℃下反应过夜(图1)，得到β-葡聚糖修饰的多糖-载体蛋白结合物(PS-TT-G)。

(4)PS-TT和PS-TT-G的分离纯化

用Sephacryl S-300凝胶过滤柱(2.6cm×70cm)，对含有PS-TT和PS-TT-G的反应物进行分离纯化。洗脱液为20mM的磷酸缓冲液(pH 7.4)，流速为3毫升/分钟，分别收集对应于PS-TT和PS-TT-G的洗脱峰。

实施例2：β-葡聚糖修饰的多糖结合疫苗的表征

以Superose 6凝胶过滤柱(1.0cm×30cm)对纯化产品进行鉴定，洗脱液为20mM的磷酸缓冲液(pH 7.4)，流速为0.5毫升/分钟。如图2所示，与载体蛋白TT相比，PS-TT、PS-TT-G的出峰时间明显提前。这表明载体蛋白与脑膜炎荚膜多糖结合后，分子量显著增加。

用¹H-NMR对多糖结合疫苗进行检测。Y群多糖由→4-O-α-D-葡萄糖p-(1→6)-β-D-唾液酸-2→重复单元组成，如图3a所示，在化学位移3.3-4.2处出现了清晰的葡聚糖末端碳质子峰以及唾液酸H3eq/ax共振峰，水峰出现在4.7ppm处。在这些位置上PS-TT和PS-TT-G也出现了与PS同样的峰，同时，在1.8-0.5ppm处，与PS相比，PS-TT与PS-TT-G处出现了TT蛋白上脂肪氨基上的质子峰。

用FT-IR对多糖结合疫苗进行检测。如图3b所示，Y群多糖在3300cm^-1出现了O-H的伸缩振动，1020cm^-1出现了O-H的弯曲振动，2950-2930cm^-1处出现了C-H的伸缩振动。与PS相比，PS-TT在3300cm^-1处的O-H的伸缩振动峰和1020cm^-1的O-H的弯曲振动峰强度要低，这表明Y群多糖上的OH被溴化氰活化，与此同时，在1580cm^-1处出现了己二酰肼上对应的C＝O伸缩振动峰。与PS-TT相比，PS-TT-P对应的3300cm^-1处的O-H的伸缩振动峰，1020cm^-1的O-H的 弯曲振动峰强度以及2950-2930cm^-1处的C-H伸缩振动峰强度都明显增强，这表明β-葡聚糖已成功通过共价键-CH₂-NH-的形成偶联到PS-TT上。

实施例3：β-葡聚糖修饰多糖结合疫苗的免疫原性测定

取PS-TT，其中PS的浓度为10微克/毫升，总体积均为3毫升，分别与30微克和90微克β-葡聚糖物理混合。混合溶液分别设为PS-TT/G1组和PS-TT/G2组。选取30只8周龄的雌性Blab/C小鼠，体重为15-22克。随机分为5组，即PS组、PS-TT组、PS-TT-G组、PS-TT/G1组和PS-TT/G2组，每组6只小鼠。腹腔注射，每只每次注射含有5微克多糖，每周注射1次，共注射3次。21天后眼眶取血。用ELISA法检测小鼠血浆中抗脑膜炎多糖的IgG、IgG1和IgG2a和IgM。

(1)PS-TT-G的免疫原性测定

如图4a所示，PS组第一剂产生的IgG抗体滴度很弱。第二剂和第三剂免疫抗体滴度仍然很低，没有显著提高PS的抗体滴度，这表明PS在体内不能引起相应的免疫记忆。PS-TT组注射第一剂后，产生的IgG抗体滴度很弱，但注射第二剂后产生的IgG抗体滴度大幅度增加，第三剂增加更多，这表明PS-TT可以诱导免疫记忆。相比于PS组在第三剂产生的IgG抗体滴度，PS-TT的IgG抗体滴度增加了13.3倍。与PS-TT组相比，PS-TT-G组的IgG抗体滴度增加了8.2倍。

如图4b所示，PS-TT与PS-TT-G产生明显的Th2型的IgG1抗体滴度。PS-TT产生的Th1型的IgG2a低于PS-TT-G产生的抗体滴度，PS-TT与PS-TT-G的IgG2a/IgG1比率差异很小。

如图4c所示，PS-TT产生的IgM抗体滴度显著高于PS，但低于PS-TT-G。这表明β-葡聚糖修饰可以显著增加PS-TT产生的IgM抗体滴度。

如图4d所示，与PS-TT相比，PS-TT-G产生的TT特异性IgG，IgG1和IgM抗体滴度分别增加了4.0倍，5.8倍，3.8倍。这表明，将β-葡聚糖修饰可以显著增加PS-TT的TT特异性抗体滴度。

(2)β-葡聚糖与PS-TT混合物的免疫原性测定

如图5a和图5b所示，PS-TT/G1产生的脑膜炎多糖特异性的IgG滴度以及载体蛋白特异性的IgG滴度，均低于PS-TT但高于PS-TT/G2。这表明PS-TT与β-葡聚糖经物理混合后，PS-TT的脑膜炎多糖特异性抗体滴度和载体蛋白特异性抗体滴度均有所下降。其中，β-葡聚糖含量越高，抗体滴度下降越明显。

实施例4：多糖特异性抗体的特异性测定

向200倍稀释的PS-TT组、PS-TT-G组小鼠血浆中加入不同量的脑膜炎荚膜多糖，用ELISA方法检测小鼠血浆中抗荚膜多糖的抗体水平。如图6所示，随着多糖加入量的增加，多糖特异性抗体结合96孔板中多糖的能力逐渐降低。当加入的多糖达到15微克时，抗体结合多糖的能力丧失。这表明小鼠产生的抗荚膜多糖抗体能够特异性地结合荚膜多糖。除此之外，PS-TT-G抗体结合能力的下降率低于PS-TT。