一种奶牛泌乳期用硫酸头孢喹肟乳房注入剂及其制备方法

摘要

本发明公开了一种硫酸头孢喹肟乳房注入剂（泌乳期）及其制备方法。所述硫酸头孢喹肟乳房注入剂由下述原辅料制成：硫酸头孢喹肟0.05-0.15g（以头孢喹肟计）、单硬脂酸甘油酯0.008-0.08g、助悬剂0.008-0.08g、植物油加至8.0g。制备工艺如下：取适量经预处理的植物油，加入单硬脂酸甘油酯加热熔化，然后加入助悬剂、硫酸头孢喹肟，再加植物油至全量，研磨均匀，即得。该乳房注入剂具有如下优点：药物释放缓速，生物利用度高，对局部组织刺激小；每头牛每个乳区单独用药，避免了交叉感染；通过乳房注入，使用方便，避免了注射给药引起的动物应激反应，为临床用药提供便利；疗效显著，具有极高的推广价值。

说明书

技术领域

本发明涉及一种硫酸头孢喹肟乳房注入剂（泌乳期）及其制备方法。

背景技术

近年来随着养殖结构的不断调整，我国的奶牛养殖业在规模上得到了长足发展，然而奶牛乳房炎在生产中的发病率很高，它是由金黄色葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌等为主要病原菌引起的一种多发病和顽固性疾病，临床中见病牛精神沉郁、体温升高、食欲废绝；泌乳减少、乳汁稀薄、触摸乳房有发热和红肿感，乳汁内含絮状物或乳凝块等,导致产奶量和乳品质降低，严重影响了奶牛业的健康发展，此病不仅给养殖业造成极大的经济损失，而且也严重危害人类的健康。因此，对奶牛乳房炎的防治显得尤为重要。

头孢喹肟(Cefquinome)，又称为头孢喹咪或头孢喹诺，是动物专用的第四代头孢菌素类抗生素。头孢喹肟通过抑制细胞壁的合成达到杀菌效果，其抗菌谱广、抗菌活性强，对大多数G+菌和G-菌均显示出良好的抗菌活性，尤其对金黄色葡萄球菌、链球菌、绿脓杆菌和大肠杆菌属的成员都有较低的抑菌浓度，另外对耐青霉素的葡萄球菌和肠球菌也有活性。头孢喹肟对β-内酰胺酶高度稳定。头孢喹肟已在我国注册，主要用于治疗多杀性巴氏杆菌或胸膜肺炎放线杆菌引起的猪呼吸道疾病。

现有的硫酸头孢喹肟注射剂、粉针剂主要通过肌肉注射给药，很难达到乳房内部，不如乳房局部用药效果好。因此，开发一种适用于奶牛泌乳期使用的头孢喹肟制剂具有重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种硫酸头孢喹肟乳房注入剂（泌乳期）及其制备方法。

本发明所提供的硫酸头孢喹肟乳房注入剂（泌乳期），由下述原辅料制成：硫酸头孢喹肟（原料药）0.05-0.15g（以头孢喹肟计）、单硬脂酸甘油酯0.008-0.08g、助悬剂0.008-0.08g、植物油加至8.0g。

所述硫酸头孢喹肟乳房注入剂（泌乳期）可进一步由下述原辅料制成：硫酸头孢喹肟（原料药）0.075-0.15g（以头孢喹肟计）、单硬脂酸甘油酯0.008-0.08g、助悬剂0.008-0.08g、植物油加至8.0g。

其中，所述植物油具体可选自下述至少一种：大豆油、茶油、玉米油、花生油和棉籽油。所述植物油进一步可为大豆油。

所述助悬剂具体可选自下述至少一种：吐温80、司盘80和大豆磷脂。所述助悬剂进一步可为司盘80。

所述硫酸头孢喹肟原料药的粒径可为5-10μm。

本发明所述硫酸头孢喹肟乳房注入剂的性状为类白色至淡黄色油状混悬液。

上述硫酸头孢喹肟乳房注入剂的制备方法，由植物油、单硬脂酸甘油酯和助悬剂制成高分子化合物溶剂体系，再将硫酸头孢喹肟的无菌微粉加入，持续搅拌研磨制成硫酸头孢喹肟乳房注入剂。

具体制备方法包括如下步骤：

1）将适量植物油和单硬脂酸甘油酯混合后，加热熔化，得到混合体系（即高分子化合物溶剂体系）；

2）向所述混合体系中加入助悬剂、硫酸头孢喹肟，再加植物油至全量，研磨均匀，即得所述硫酸头孢喹肟乳房注入剂（泌乳期）。

其中，步骤1）中所述加热的条件为：60～80℃加温15～30分钟。通常情况下步骤1）中所使用的植物油的用量为植物油总量的40%-60%。

步骤2）中所述研磨可在胶体磨中进行。

所述植物油在使用前还需经过过滤以及加热灭菌的预处理。所述加热灭菌的条件为：150-160℃灭菌2-3小时。

本发明所提供的硫酸头孢喹肟乳房注入剂对奶牛泌乳期乳房炎具有显著疗效。硫酸头孢喹肟乳房注入剂(泌乳期)临床用于治疗奶牛乳房炎的用量为：1支(8g:75mg)/乳区·次，间隔12小时/次，连用3次。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

（1）给药方便快捷，减少了大量的人力物力；

（2）动物应激反应小，减少动物体的损伤；

（3）生产工艺简单，得到的制剂均匀、分散性、稳定性好，易于扩大化生产；

（4）每头牛每个乳区单独用药，即独立使用医疗器械（制剂），避免了交叉感染；

（5）本制剂相对于注射液而言，药物释放缓速，生物利用度高，对局部组织刺激性低，临床疗效显著，具有极高的推广价值。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明并不局限于此。

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。

本发明提供的硫酸头孢喹肟乳房注入剂是一种分布均匀的制剂，具体制备方法包括以下步骤：

A.将植物油（如中性大豆油）经过滤和加热灭菌之后放冷；

B取适量经预处理的植物油，加入0008-008g的单硬脂酸甘油酯；

C.60～80℃加温15～30分钟，待硬脂酸甘油酯融化，搅拌均匀后，冷却至40℃左右，加入0.008-0.08g的助悬剂（如司盘80）、0.05-0.15g（以头孢喹肟计）的硫酸头孢喹肟（粒径5-10μm），再补加植物油至总量为8.0g；

D.研磨均匀，制得硫酸头孢喹肟乳房注入剂；

F.将药装入推注管中，密封，灭菌，灯检，包装。

下述实施例中对乳房注入剂的沉降粒度的检测方法：用具塞量筒取供试品50ml，密塞，用力振摇1分钟，记下混悬液的开始高度H0，静置3小时，记下混悬物的最终高度H，按下式计算，结果如下：沉降比体积F＝H/H0，不低于0.90即合格。

无菌检验的方法：

取本品11支，加入到400ml含6%吐温-80的蛋白胨缓冲灭菌溶液（0.1%）中，充分混匀，加入青霉素酶（不少于6600万单位），混合均匀，置37℃保温4小时；取供试品溶液，依法检查（附录137页，直接接种法），应符合规定。

实施例1、硫酸头孢喹肟乳房注入剂的处方筛选

1、组方中单硬脂酸甘油酯含量的筛选（注：表中单硬脂酸甘油酯简称甘油酯）

表1

制备方法如下：

1）将硫酸头孢喹肟无菌粉经超微粉碎得到硫酸头孢喹肟无菌微粉（粒径5-10μm）；

2）将大豆油经过滤和加热灭菌（150℃灭菌3小时）后，置于室温下备用；

3）取适量经预处理的大豆油，加入硬脂酸甘油酯以及助悬剂司盘80；加热并搅拌（80℃加温15分钟），待硬脂酸甘油酯融化之后，加入硫酸头孢喹肟；

5）在无菌胶体磨中研磨均匀，制得硫酸头孢喹肟乳房注入剂。

由表1结果可知，当单硬脂酸甘油酯的含量为0.05%(w/w)时，产品的沉降指标达不到质量标准的要求；当单硬脂酸甘油酯的含量为0.1～1.0%(w/w)时，产品的各项指标达完全符合质量标准的要求，因此确定处方中单硬脂酸甘油酯的含量为0.1～1%(w/w)。

2、组方中司盘-80含量的筛选

表2

制备方法同上。

由表2结果可知，当司盘-80的含量为0.05%(w/w)时，产品的沉降指标达不到质量标准的要求；当司盘-80的质量含量为0.1～1%(w/w)时，产品的各项指标达完全符合质量标准的要求，因此确定处方中司盘-80含量为0.1～1%(w/w)。

实施例2、制备硫酸头孢喹肟乳房注入剂（泌乳期）

制备方法如下：

1）将硫酸头孢喹肟无菌粉经超微粉碎得到粒径5-10μm硫酸头孢喹肟无菌微粉；

2）将大豆油经过滤和加热灭菌（150℃灭菌3小时）后，置于室温下备用；

3）取适量经预处理的大豆油（为大豆油总用量的40%-60%），加入单硬脂酸甘油酯；加热并搅拌（80℃加温15分钟），待单硬脂酸甘油酯融化，搅拌均匀后，冷却至40℃，加入司盘80、硫酸头孢喹肟，再加大豆油至全量；

4）在无菌胶体磨中研磨均匀，制得硫酸头孢喹肟乳房注入剂。

所得硫酸头孢喹肟乳房注入剂（泌乳期）的性状为类白色至淡黄色油状混悬液。

对上述产品进行沉降粒度及无菌检测，其均符合乳房注入剂的质量标准。

实施例3、制备硫酸头孢喹肟乳房注入剂（泌乳期）

制备方法如下：

1）将硫酸头孢喹肟无菌粉经超微粉碎得到粒径5-10μm硫酸头孢喹肟无菌微粉；

2）将大豆油经过滤和加热灭菌（150℃灭菌3小时）后，置于室温下备用；

3）取适量经预处理的大豆油（为大豆油总用量的40%-60%），加入单硬脂酸甘油酯；加热并搅拌（80℃加温15分钟），待单硬脂酸甘油酯融化，搅拌均匀后，冷却至40℃，加入司盘80、硫酸头孢喹肟，再加大豆油至全量；

4）在无菌胶体磨中研磨均匀，制得硫酸头孢喹肟乳房注入剂。

所得硫酸头孢喹肟乳房注入剂的性状为类白色至淡黄色油状混悬液。

对上述产品进行沉降粒度及无菌检测，其均符合乳房注入剂的质量标准。

实施例4、制备硫酸头孢喹肟乳房注入剂（泌乳期）

制备方法如下：

1）将硫酸头孢喹肟无菌粉经超微粉碎得到粒径5-10μm硫酸头孢喹肟无菌微粉；

2）将茶油经过滤和加热灭菌（160℃灭菌2小时）后，置于室温下备用；

3）取适量经预处理的茶油（为茶油总用量的40%-60%），加入单硬脂酸甘油酯；加热并搅拌（60℃加温30分钟），待单硬脂酸甘油酯融化，搅拌均匀后，冷却至40℃，加入司盘80、硫酸头孢喹肟，再加大豆油至全量；

4）在无菌胶体磨中研磨均匀，制得硫酸头孢喹肟乳房注入剂。

所得硫酸头孢喹肟乳房注入剂的性状为类白色至淡黄色油状混悬液。

对上述产品进行沉降粒度及无菌检测，其均符合乳房注入剂的质量标准。

实施例5、制备硫酸头孢喹肟乳房注入剂（泌乳期）

制备方法如下：

1）将硫酸头孢喹肟无菌粉经超微粉碎得到粒径5-10μm硫酸头孢喹肟无菌微粉；

2）将玉米油经过滤和加热灭菌（150℃灭菌2小时）后，置于室温下备用；

3）取适量经预处理的玉米油（为玉米油总用量的40%-60%），加入单硬脂酸甘油酯；加热并搅拌（80℃加温30分钟），待单硬脂酸甘油酯融化，搅拌均匀后，冷却至40℃，加入吐温-80、硫酸头孢喹肟，再加大豆油至全量；

4）在无菌胶体磨中研磨均匀，制得硫酸头孢喹肟乳房注入剂。

所得硫酸头孢喹肟乳房注入剂的性状为类白色至淡黄色油状混悬液。

对上述产品进行沉降粒度及无菌检测，其均符合乳房注入剂的质量标准。

实施例6、制备硫酸头孢喹肟乳房注入剂（泌乳期）

制备方法如下：

1）将硫酸头孢喹肟无菌粉经超微粉碎得到粒径5-10μm硫酸头孢喹肟无菌微粉；

2）将棉籽油经过滤和加热灭菌（150℃灭菌2小时）后，置于室温下备用；

3）取适量经预处理的棉籽油（为棉籽油总用量的40%-60%），加入单硬脂酸甘油酯；加热并搅拌（80℃加温15分钟），待单硬脂酸甘油酯融化，搅拌均匀后，冷却至40℃，加入大豆磷脂、硫酸头孢喹肟，再加大豆油至全量；

5）在无菌胶体磨中研磨均匀，制得硫酸头孢喹肟乳房注入剂。

所得硫酸头孢喹肟乳房注入剂的性状为类白色至淡黄色油状混悬液。

对上述产品进行沉降粒度及无菌检测，其均符合乳房注入剂的质量标准。

实施例7、硫酸头孢喹肟乳房注入剂（泌乳期）的体内效果试验

1）硫酸头孢喹肟乳房注入剂（泌乳期）对奶牛的安全性试验

试验随机选取12头健康泌乳奶牛（6头初产，6头经产），四个乳区分别注入实施例3制备的硫酸头孢喹肟乳房注入剂（泌乳期）一支（规格75mg：8g），间隔12小时给药一次，连续给药3次。

在给药前24h和给药前0h；第1次给药后和第3次给药后；停药后第2天和停药后第3天；停药后第6天和停药后第7天采集奶样，每头牛四个乳区分别单独采集，挤掉前三把奶后采集约30mL奶样于50mL灭菌聚丙烯离心管中，进行SCC检测和细菌分离鉴定。采样时，观察记录用药奶牛的乳房局部症状、泌乳能力及乳汁性状、精神食欲状态等临床症状变化，统计奶牛日产奶量。比较给药前后以上指标的差异显著性，综合评价该制剂对泌乳期奶牛的安全性。

结果表明，受试药物硫酸头孢喹肟乳房注入剂（泌乳期）在给药中与停药后与给药前奶牛的临床表现评分、日产奶量、奶中体细胞数以及细菌的分离鉴定结果上都无显著性差异。说明泌乳期奶牛按推荐剂量给与硫酸头孢喹肟乳房注入剂（泌乳期）对泌乳期奶牛是安全的。

2）硫酸头孢喹肟乳房注入剂（泌乳期）在牛乳的药动学试验

选取6头健康泌乳奶牛，早上挤完奶后，每头牛四个乳区随机选一个，单次注入实施例3制备硫酸头孢喹肟乳房注入剂（泌乳期）一支（规格75mg：8g）。在给药前采空白奶样，在给药后的0.25h、0.5h、0.75h、1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h、36h、48h、60h、72h给药乳区采集奶样40-50ml；非给药乳区分别在给药乳区给药后的第2h、6h、12h、24h采集奶样40-50ml（注意前三把奶均不能舍弃），置于聚丙烯专用塑料瓶中，密封，-20℃冷冻保存待测。各头试验奶牛分别于0h，给药后2h、6h、12h、24h，颈静脉采血10-15ml，注入EDTAK2真空抗凝采血管中。离心，分离血浆，于-20℃冷冻保存待测。

采用已建立的牛乳中硫酸头孢喹肟及血浆中硫酸头孢喹肟的UPLC-MS/MS检测方法分别检测所采集牛乳样品及血浆样品中的药物含量。具体检测方法为：称取牛奶样品1g，置于15ml聚丙烯离心管中。加入乙腈3ml涡旋1min，8000rpm离心10min，移取上清液至10ml玻璃试管中，剩余残渣加入2ml乙腈进行第二次提取，涡旋1min，8000rpm离心10min，合并两次提取液，40℃水浴下氮吹浓缩至干。残留物用3ml水复溶，复溶液过HLB固相萃取小柱（HLB预先经3mL甲醇活化，3mL水平衡），再用3mL5%甲醇水洗涤HLB固相萃取小柱，最后用1.5mL甲醇洗脱，收集洗脱液于10mL玻璃试管中。洗脱液在40℃水浴下氮吹浓缩至干，残渣用流动相1mL乙腈-0.1%甲酸水溶液（5:95，V/V）复溶，涡动1min，使离心管壁上残余物全部溶解后，过0.2μm滤膜于进样小瓶中，使用液质联用仪器检测。

结果显示，药物仅在给药乳区有检出，非给药乳区无药物成份检出，血浆中也仅检出痕量药物成分，且在给药后第24小时血浆中药物浓度已低于方法检出限。说明药物几乎无法透过血乳屏障进入血液循环系统，仅在给药乳区发挥抗菌作用。采用药动学处理软件WinNonLin6.1非房室模型处理并计算有关药代动力学参数。结果显示药物在乳中消除迅速，消除半衰期T1/2为5.91±0.83h，曲线下面积AUC为309997.54±34553.82h·ng/mL，消除速率常数Cl为0.61±0.07ml/h/kg。结合已报道的MIC数据，当12h时的药物浓度能够全部高于硫酸头孢喹肟对乳房炎主要致病菌的MIC数值，24h时只是部分高于硫酸头孢喹肟对乳房炎主要致病菌的MIC数值，因此，建议给药间隔为12小时给药一次。

3）硫酸头孢喹肟乳房注入剂（泌乳期）在牛乳的残留试验

随机选取18头健康泌乳奶牛（高、中、低产各6头），挤完奶后，每头牛四个乳区，分别注入实施例3制备硫酸头孢喹肟乳房注入剂（泌乳期）一支（规格75mg：8g），间隔12h给药一次，连续给药3次。

在给药前采空白奶样，在给药结束后的12h、18h、24h、36h、42h、48h、60h、66h、72h、84h、90h、96h、108h、114h、120h采集奶样。各时间点每头牛四个乳区，采集混合奶样40-50ml（注意挤奶时前三把奶不能舍弃），置于聚丙烯专用塑料瓶中，-20℃保存。奶样经两次乙腈提取后氮气吹干，复溶后过HLB固相萃取小柱净化，采用UPLC-MS/MS法检测牛乳中药物浓度。结果显示给药后牛乳中头孢喹肟消除迅速，给药后60小时乳中药物浓度已低于EMEA所规定乳中最高残留限量（MRL）20ug/kg，经休药期计算软件WT1.4处理后，本制剂在牛乳中的休药期为93.41小时。

4）硫酸头孢喹肟乳房注入剂（泌乳期）对奶牛乳房炎的药效学试验

本实验动物选择只有一个乳区患乳房炎的奶牛，共计80个病例（80个患病乳区），随机分为4个组，每组20个患病乳区。3个受试药物组（I、II、III)，分别为硫酸头孢喹肟乳房注入剂高剂量（组I，2支/乳区）组、中剂量（组II，1支/乳区）组；低剂量（组III，1/2支/乳区）组；1个对照药物组（IV组），为氨苄西林钠、氯唑西林钠乳房注入剂(泌乳期)（组IV，1支/乳区）组。上述硫酸头孢喹肟乳房注入剂为实施例3制备的样品，规格为75mg：8g。

受试药物高剂量组向各感染乳区注入2支硫酸头孢喹肟乳房注入剂；中剂量组向各感染乳区注入1支硫酸头孢喹肟乳房注入剂；低剂量组向各感染乳区注入1/2支硫酸头孢喹肟乳房注入剂；对照药物组向各感染乳区注入1支氨苄西林钠、氯唑西林钠乳房注入剂(泌乳期)。所有试验组动物均每日给药2次（间隔12小时），连用3次。在给药前及最后一次给药后第7日，分别采集各试验组给药乳区的奶样20mL进行细菌学检查和牛奶体细胞测定。考察奶牛用药前后的精神食欲状态、乳房局部临床症状、泌乳能力与乳汁性状，综合评价硫酸头孢喹肟乳房注入剂对奶牛乳房炎的疗效。

试验后经统计分析，可得以下结论：

（1）病原菌检测结果表明（见表1），乳房炎奶牛的感染乳区灌注硫酸头孢喹肟乳房注入剂(泌乳期)，每天早、晚各1次，连续用药3次后，高（2倍推荐剂量）、中（推荐剂量）剂量硫酸头孢喹肟乳房注入剂(泌乳期)组牛乳中细菌分别从给药前的23株和26株降低到给药后的3株和6株；低（1/2推荐剂量）剂量硫酸头孢喹肟乳房注入剂(泌乳期)组和对照药物氨苄西林钠、氯唑西林钠乳房注入剂(泌乳期)组牛乳中细菌分别从给药前的25株和25株降低到给药后的15株和18株。说明硫酸头孢喹肟乳房注入剂(泌乳期)高剂量组和中剂量组对奶牛乳房炎主要致病菌有良好的清除作用，优于硫酸头孢喹肟乳房注入剂(泌乳期)低剂量组和对照药物氨苄西林钠、氯唑西林钠乳房注入剂(泌乳期)组对奶牛乳房炎主要致病菌的清除作用。

表1、各试验组奶牛乳区用药前后主要病原菌的分离鉴定结果统计

（2）硫酸头孢喹肟乳房注入剂(泌乳期)和对照药物氨苄西林钠、氯唑西林钠乳房注入剂(泌乳期)对牛奶体细胞数（见表2）的降低有明显治疗效果，各组体细胞数显著减少（P＜0.05)，各组之间无差异显著性（P＞0.05）。各试验组临床症状评分数值给药后显著优于给药前（P＜0.05），中高剂量组显著优于低剂量组和对照组（P＜0.05）。高（2倍推荐剂量）、中（推荐剂量）剂量硫酸头孢喹肟乳房注入剂(泌乳期)治疗后奶牛的精神食欲、乳房局部症状及乳汁性状等乳房炎临床症状都得到了显著改善（见表3），效果显著优于氨苄西林钠、氯唑西林钠乳房注入剂(泌乳期)组和低剂量硫酸头孢喹肟乳房注入剂(泌乳期)组（P＜0.05）。高、中、低剂量对奶牛乳房炎的有效率分别达到90%、80%、65%，治愈率分别达到80%、75%、35%（见表4），氨苄西林钠、氯唑西林钠乳房注入剂(泌乳期)（IV组）对奶牛乳房炎的有效率为55%，治愈率为50%。其中低剂量（1/2倍推荐剂量）对奶牛乳房炎的有效率和治愈率与氨苄西林钠、氯唑西林钠乳房注入剂(泌乳期)无显著差异（P＞0.05），高、中剂量对奶牛乳房炎的有效率和治愈率与对照组氨苄西林钠、氯唑西林钠乳房注入剂(泌乳期)相比差异显著（P＜0.05），且高、中剂量的疗效无显著差异（P＞0.05）。

表2各治疗乳区奶样给药前后体细胞计数(SCC)统计

表3奶牛乳房炎给药乳区症状评分结果

注：表内各数据均为组内各乳区的平均数

*表示各组用药前与用药后评分相比较差异显著（P＜0.05）

a、b：相同字母间表示差异不显著（P＞0.05），不同字母间表示差异显著（P＜0.05）

表4受试药物和对照药物对奶牛乳房炎的治愈率和有效率

注：a、b、c：有相同字母表示差异不显著（P＞0.05），没有相同字母表示差异显著（P＜0.05）。

（3）考虑到高（2倍推荐剂量）、中（推荐剂量）剂量硫酸头孢喹肟乳房注入剂(泌乳期)对奶牛乳房炎的疗效（病原菌清除效果、临床症状恢复情况）差异不显著，均优于低剂量（1/2倍推荐剂量）组，因此推荐硫酸头孢喹肟乳房注入剂(泌乳期)临床用于防治奶牛乳房炎的用药方案为：1支(8g:75mg)/乳区·次，间隔12小时/次,连用3次。

按照实施例7的体内效果试验的方法对实施例2、4、5、6的产品进行相同的测试，其结果与实施例3的效果相当。表明本发明提供的硫酸头孢喹肟乳房注入剂（泌乳期）安全有效、生物利用度高、对局部组织刺激小、疗效显著，具有极高的推广价值。