一种系统水平生态危害综合评估与表征方法

摘要

本发明涉及一种系统水平生态危害综合评估与表征方法，包括以下步骤：构建模拟自然环境的生态微宇宙系统；设置一系列浓度并将化学品均匀暴露于微宇宙系统的某一相或多相基质中启动微宇宙危害测试；定期测定化学品对系统结构、功能和内环境变化指标；确定特定暴露时间引起处理组各个指标显著偏离对照组的最低化学品浓度（NOEC

说明书

技术领域

本发明属于化学品生态危害测试与评估领域，具体涉及一种系统水平生态危害综合评估与表征方法。

背景技术

作为生态风险评估的首要步骤，化学品生态危害评估可分为初、中、高三级评估。初级危害评估仅依据少数敏感物种的毒性数据，采用基于经验的评估因子法进行判断；中级危害评估则考虑生态系统的多个物种的毒性，采用科学的统计分析或模型拟合方法进行判断；而高级危害评估是基于构建模拟生态系统进行试验测试而进行判断的。因此高级危害评估综合考虑了生态系统的多个生物组分和非生物组分的变化，是一种基于系统水平的生态危害评估方法。当化学品在初级或中级危害评估时被确定为具有显著危害效应和较高暴露风险时，须开展高级危害评估进行危害确认。

生态微宇宙(aquatic microcosm)即是一种人工构建的模拟生态系统，基于生态微宇宙毒性测试的危害评估方法即是基于系统水平的高级生态危害评估方法。与单一物种的生态危害测试结果相比，生态微宇宙毒性测试兼顾了种群之间的相互关系以及生态系统固有的反馈调节功能，因此更接近实际环境。目前欧美等发达国家和地区均已将微宇宙测试作为高级别化学物质生态危害评估的重要工具，用以确认化学物质的生态危害、降低单一生物毒性测试数据的不确定性。我国目前的化学品生态危害评估主要仍采用基于评估因子的初级危害评估方法，尚未建立系统水平的生态危害综合评估方法。目前虽有为数不多的科学研究涉及生态微宇宙危害测试，但其测试过程仍集中于系统生物组分的变化，缺少反映系统功能或内环境变化的指标。再者，已有研究的危害表征仅以单纯的无显著危害效应浓度(NOEC， no observed effect concentration)表示，极大地忽略了微宇宙测试中有关种间关系及系统反馈调节等关键信息，仍无法全面反映化学品对生态系统的危害特征。

发明内容

本发明的目的是解决目前微宇宙测试技术在危害评估指标和危害表征方法方面无法全面、系统反映化学品对生态系统危害性的问题，提供一种系统水平生态危害综合评估与表征方法。该方法可为化学品高级生态危害评估提供技术借鉴。

本发明的上述目的通过以下技术方案实现：

一种系统水平生态危害综合评估与表征方法，包括以下步骤：

步骤1：构建模拟自然环境的生态微宇宙系统，包括生物组分和非生物组分。其中生物组分至少包括3个营养级生物，且在系统内部至少须形成一条明确的食物链；非生物组分包括光源、营养元素(如碳、氮等)、基质(如水、沉积物、土壤、空气等)等生物生存所需的基本物质；

步骤2：设置至少3个浓度并将化学品均匀暴露于微宇宙系统的某一相或多相基质中，同时设置不添加化学品的对照组。对照组和处理组须设置至少4个平行。维持一定的温度、光照等环境条件的前提下启动微宇宙危害测试；

步骤3：以各生物组分的生物丰度为系统结构变化指标，以净初级生产量(P)、呼吸作用量(R)及群落代谢水平(P/R)为系统功能变化指标，以化学品在某相或多相基质中的浓度、溶解氧浓度(DO)、pH值、营养元素浓度、电导率、氧化还原电位等为系统内环境变化指标，定期测定化学品对系统结构、功能和内环境的影响；

步骤4：通过对比处理组与对照组指标变化情况，确定特定暴露时间引起处理组各个指标显著偏离对照组的最低化学品浓度(NOEC_指标i)，并以其中最敏感指标的NOEC值作为引起整个微宇宙系统变化 的最低化学品浓度(NOEC_系统)；

步骤5：将各指标与化学品处理浓度进行相关性分析，并对比各个指标之间的变化规律，结合试验观测分析引起各指标变化的主要因素。以示意图的形式描述化学品对系统内部生物组分与非生物组分的直接和间接作用规律以及生物组分与非生物组分之间的相互作用规律，以此揭示化学品对整个系统结构、功能和内环境的综合危害路径。依据现有数据或知识暂时无法确认的某些作用环节可以以虚框的方式留空。

进一步地，所述的系统水平生态危害综合评估方法包括构建生态微宇宙系统和开展微宇宙危害测试；所述的系统水平生态危害综合表征方法包括引起整个微宇宙系统变化的最低化学品浓度(NOEC_系统)和化学品对整个系统结构、功能和内环境的综合危害路径。

进一步地，步骤3所涉及的生物丰度以单位体积基质中生物个体数量、质量或特征生物质的量(如藻类所含的叶绿素a)来表示。净初级生产量(P)＝DO₂-DO₁，呼吸作用量(R)＝DO₂-DO₃，群落代谢水平(P/R)是净初级生产量(P)与呼吸作用量(R)的比值；其中均来自微宇宙危害测试试验，DO₁是早上光周期开始前测定的系统溶解氧浓度，DO₂是下午光周期结束前测定的系统溶解氧浓度，DO₃是次日光周期开始前测定的系统溶解氧浓度。

进一步地，步骤4所涉及的特定暴露时间引起处理组各个指标显著偏离对照组的最低化学品浓度(NOEC)采用T检验、蒙特卡罗置换检验等分析方法得到。

进一步地，步骤5所涉及的化学品对整个系统结构、功能和内环境的综合危害路径示意图包括化学品名称、各生物种群及其结构变化的主导因素、各生物种群之间的关系、系统功能及内环境的主导影响因素及其对生物种群的影响。

本发明的原理如下：

特定的物种结构且具有物质流动、能量循环功能是一个平衡生态系统的固有特征。本发明以模拟自然生态系统的微宇宙为载体，以各生物丰度为系统结构变化指标，以净初级生产率(P)、呼吸作用量(R)及群落代谢水平(P/R)为系统功能变化指标，以化学品在某相或多相基质中的浓度、溶解氧浓度(DO)、pH值、营养元素浓度、电导率、氧化还原电位等为系统内环境变化指标，全面地评估了化学品对系统结构、功能和内环境的影响。在此基础上，以引起整个微宇宙系统变化的最低化学品浓度(NOEC_系统)和化学品对整个系统结构、功能和内环境的综合危害路径图综合表征系统水平的生态危害性，从危害结果和危害机制两个方面深入阐释了化学品对整个生态系统的危害性。

本发明与现有技术相比，具有以下优点：

1、危害评估指标更加完善和系统：引入净初级生产量(P)、呼吸作用量(R)及群落代谢水平(P/R)作为系统功能变化指标，引入化学品在某相或多相基质中的浓度、溶解氧浓度(DO)、pH值、营养元素浓度、电导率、氧化还原电位等作为系统内环境变化指标，克服了传统评估方法仅强调生物因素危害、忽视非生物因素危害的缺陷；

2、引入化学品系统综合危害路径图，表征化学品对系统结构、功能和内环境影响以及系统的反馈调节，实现了生态系统内部复杂种间关系、系统反馈调节的有效表征；

3、引入危害响应主导因素识别过程：通过统计分析的方法建立系统结构、功能及内环境响应指标与化学品暴露浓度或各指标之间的相关关系，从而识别影响各个指标变化的主导因素，为揭示化学品系统综合危害路径奠定基础。

4、危害表征方法更加全面和清晰：将危害评估数值结果(NOEC_系统)的可对比性与综合危害路径图可揭示生态系统复杂内部过程的高 内涵性结合起来，从危害结果和危害机制两个方面深入阐释了化学品对整个生态系统的危害性。克服了传统方法仅以单一数值结果表征危害的不完整性。

附图说明

图1：本发明的系统水平生态危害综合评估与表征方法示意图；

图2：本发明的化学品系统综合危害路径图基本框架；

图3：微宇宙中铜离子实测浓度变化趋势；

图4：试验期间大型溞和轮虫丰度的变化；

图5：藻类丰度变化；

图6：总藻丰度和叶绿素a的变化；

图7：微宇宙理化指标的变化；

图8：硫酸铜系统综合危害路径图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的技术方案做进一步详细说明。

本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

实施例1：硫酸铜对微宇宙系统生态危害综合评估与表征

图1和图2分别为系统水平生态危害综合评估与表征方法示意图和化学品系统综合危害路径图基本框架。在本实施例中，设计的微宇宙包括4种藻类(小球藻、四尾栅藻、斜生栅藻、羊角月牙藻)、轮虫、大型溞三个营养级生物组分，三者从低到高形成食物链。其中大型溞除捕食轮虫外，还可直接捕食藻类。

(1)微宇宙的构建和驯化：准备30个5L的烧杯，每个烧杯中中装入200g石英砂、0.5g纤维素、0.5g几丁质和3L T82MV培养基以构建标准化微宇宙系统。实验室温度维持在20～22℃，光照约为 3000lux，光周期为12h(明)：12h(暗)。第0天接种入4种藻类，使其初始细胞浓度为10⁴cells/mL，第4天加入大型溞(16只/微宇宙)和萼花臂尾轮虫(0.03/mL)。第7天根据溶解氧变化、pH值、大型溞数量、羊角月牙藻数量以及微宇宙早期占优势藻种等指标剔除差异较大的6个微宇宙。

(2)微宇宙危害测试：在剩余的系统中加入受试物，并随机分配不同处理组的位置。设置3个浓度：500、1000和2000μg·L^-1(以铜离子计)，并设置空白对照组，每个浓度6个平行。试验周期为63天，pH、溶解氧浓度(DO)、叶绿素a含量和物种丰度等每周测定两次。溶氧浓度分别在三个时间点测定：早上光周期开始前(DO₁)、下午光周期结束前(DO₂)以及第二日的光周期开始前(DO₃)。净初级生产量P＝DO₂-DO₁，呼吸作用量R＝DO₂-DO₃。pH值在取样测定物种丰度当天的光周期开始前进行测定。

叶绿素a和物种丰度在同一天取样测定。叶绿素取样和测定方法参考标准SL88-2012“水质叶绿素的测定-分光光度法”(松辽流域水环境监测中心。SL88-2012水质叶绿素的测定-分光光度法。北京:中国水利水电出版社，2012)。在水体较清澈且大型溞数量较少的情况下可以对大型溞进行肉眼计数，在数量较多时，用取样圆筒取一定体积的水样再计数，最后进行换算(个/100mL)。取1-2mL搅拌均匀的微宇宙水样并用鲁哥氏液固定，在倒置显微镜下用1mL的浮游生物计数板对轮虫进行计数(只/mL)。藻类的计数同样将水样用鲁哥氏液固定，再采用视野计数法用0.1mL的计数板进行计数(cells/mL)。每周最后一次取水样后向每个烧杯中加轮虫培养液一滴(约0.05mL)、4种藻的混合液(每种藻的接种浓度为10⁴个/mL)1mL以补充取样的损失，并加入大型溞使其数量为每烧杯至少3只。试验期间不再加入培养基。由于本试验早期固着藻类的采样和镜检结果证实难以获取组间可比的鉴定结果，所以放弃该指标的显微镜计数，其数量 没有体现在总藻丰度中，故总藻丰度为小球藻、羊角月牙藻、斜生栅藻和四尾栅藻丰度的总和。但是叶绿素a的浓度同时涵盖固着藻类和其它藻类。

(3)微宇宙危害评估指标测试结果及主导影响因素分析：本实施例以小球藻、四尾栅藻、斜生栅藻、羊角月牙藻、大型溞和轮虫等物种丰度及叶绿素a作为微宇宙系统结构变化指标，净初级生产量P、呼吸作用量R及群落代谢水平P/R作为微宇宙系统功能变化指标，以铜离子实测浓度、pH、DO为系统内环境变化指标。

①铜离子浓度变化

图3展示了在为期63天的试验中各受试组水中铜离子的实测浓度。由实测浓度计算得到添加浓度为500，1000和2000μg·L^-1的微宇宙系统中铜离子的加权平均浓度分别为110.80，212.06和420.26μg·L^-1。由图中可以看到，铜离子加入后水中实测浓度快速下降，到35d时达到相对稳定。

②大型溞丰度变化

试验期间各受试组大型溞的丰度(平均组计数的算术平均值，下同)变化见图4(a)。由图可见，大型溞的繁殖受铜离子抑制非常明显，整个试验周期内处理组的大型溞丰度远低于空白对照组。在空白对照组中，试验初始大型溞的数量因为食物充足而大幅增长，在第21天达到顶峰，而后大型溞种群数量因环境承载能力的不足而减少，并在第30～50天达到相对稳定状态。在第50天以后，大型溞数量因系统营养物质耗尽而不断下降。在试验早期，不同铜离子浓度处理组中大型溞数量均处于较低水平。在试验后期，由于铜离子浓度的降低，最低浓度组的大型溞表现出恢复的趋势，而其它两个浓度组的大型溞仍未见数量增长。

③轮虫丰度变化

微宇宙中萼花臂尾轮虫丰度的变化如图4(b)所示。由图中可以看 出在接种后的一周内，各浓度组的轮虫丰度均增大，空白对照组增加的轮虫数量远高于其它处理组。接种的一周后，空白对照组和处理组中轮虫丰度均迅速下降。虽然溞类摄食和铜离子毒性均可导致轮虫增长停滞，但空白对照组轮虫丰度的快速下降证实溞类摄食的影响更加直接。铜离子处理组在极低的大型溞丰度下出现的轮虫丰度下降可能主要由高浓度铜离子的生物毒性所导致。此后空白对照组轮虫丰度在第42～49天、第56～63天出现小幅度的增长，110.80μg·L^-1处理组轮虫保持相对稳定的丰度，其它处理组在整个试验期间的丰度接近零且没有增长。

④藻类丰度变化

微宇宙中各种藻类的丰度变化如图5所示。总体而言，四尾栅藻和小球藻的丰度变化较其它两种藻类更高，因此四尾栅藻和小球藻构成了水中藻类的优势种群。此外，在整个试验周期中，空白对照组中四种藻类丰度均低于受试组，而不同浓度处理组藻类丰度则呈现出不同的规律：所有处理组四尾栅藻丰度随铜离子浓度升高而降低；212.06和420.26μg·L^-1处理组斜生栅藻丰度相似，均高于110.80μg·L^-1处理组；所有处理组羊角月牙藻丰度变化规律与斜生栅藻相似，与铜离子浓度无显著相关性；处理组小球藻丰度前期与空白对照组无显著差异，后期(46d后)随铜离子浓度升高而升高。对比微宇宙中溞类丰度变化规律可知，较高的溞类捕食压力是导致空白对照组藻类丰度普遍偏低的直接原因。而处理组在较低的溞类捕食压力下仍呈现出不同的铜离子浓度相关性可能与溞类捕食选择性和藻类对铜离子危害响应敏感性差异有关。根据本试验测试结果可推断，处理组中大型溞倾向于优先捕食斜生栅藻和小球藻，而四尾栅藻丰度的降低主要归因于铜离子的生物毒性作用。

微宇宙中总藻丰度和叶绿素a的变化如图6所示。由图6(a)可知，空白对照组总藻丰度在整个周期内都低于各个处理组，且在试验中期 (28～49d)相对平稳、在后期(49d后)略有增长。铜离子对总藻丰度的影响呈现出与四尾栅藻相似的浓度-效应关系，主要是因为四尾栅藻作为整个试验周期内的主要优势藻种，掩盖了其它藻类数量的微弱变化；在试验后期，110.80μg·L^-1铜离子暴露浓度下的藻类数量由于大型溞种群的恢复而先于其它浓度组下降，其它浓度组中的藻类数量因为铜离子实际浓度的降低和营养物质的耗尽而表现出先增长后下降的趋势。图6(b)呈现一种与图6(a)显著不同的规律：从第35天开始，空白对照组中叶绿素a含量明显上升，此时可明显观察到空白对照组缸壁上开始长出固着藻类。由于固着藻类数量体现在叶绿素a的测定结果中且未体现在总藻丰度的测定结果中，所以推断此时的固着藻类已成为空白对照组中的优势种群。处理组未观察到固着藻类的生长，鉴于溞类对固着藻类的捕食难度，这可能反映了铜离子对固着藻类的生长抑制效应。

⑤系统功能指标变化

图7展示了微宇宙中净初级生产量P和呼吸作用量R及其比值在整个试验期间的变化。由图7可知，P和R表现出相似的规律：在整个试验周期内，420.26μg·L^-1处理组P和R均低于空白对照组，而其它处理组与空白对照组无显著差异。由图7(c)可知，所有处理组的P/R变化几乎一致：前35天均在1上下小范围内波动，在第35天到42天由于R的快速下降而上升，其后经过一段时间的平稳期，试验结束前一周由于营养物质的耗尽而下降。

⑥系统内环境指标变化

图7(d)展示了不同处理组pH值随时间的变化。pH值反映了系统内部化学环境的改变，可作为外源胁迫对生态系统功能影响程度的指标。由图中可以看出不同浓度组pH值的数值高低排列与总藻丰度的变化曲线(图6(a))相吻合，表明pH值与藻类的数量呈现一定的相关性：藻类浓度越大，pH值越高。这主要是藻类生长大量消耗水中 碳酸氢根离子引起的。

(4)系统水平生态危害综合评估：

空白对照组和受试组的物种丰度和理化指标进行的单因素方差分析结果见表1。由表中可以看出，大型溞丰度在各个监测时间点均具有显著的剂量-效应正相关关系，但在试验后期(56d以后)LOEC(最低可观测效应浓度，lowest observed effect concentration)由110.80μg·L^-1升至212.06μg·L^-1。这说明铜离子生物毒性是导致大型溞种群变化的主要因素，后期由于铜离子实际浓度的降低促进了溞类种群的恢复。其它生物丰度仅在某些监测时间点表现出显著的剂量-效应关系。值得注意的是，除了叶绿素a浓度外，其它藻类丰度及其总量所表现出的显著剂量-效应关系均为负相关。由于藻类及总量丰度仅涉及水中藻类(小球藻、羊角月牙藻、斜生栅藻和四尾栅藻)，而叶绿素a的浓度同时涵盖固着藻类和其它藻类，因此对比大型溞丰度与铜离子暴露浓度的关系可知，水中藻类(不包括固着藻类)生长受抑制主要归因于大型溞摄食压力，而溞类对固着藻类的摄食难度导致铜离子毒性成为叶绿素a浓度随处理浓度升高而降低的主要原因。

从功能性指标来看，与空白对照组相比，P/R在28天和56天的趋势相反，原因可能是28d时空白对照组的大型溞数量远高于其它处理组，而藻类丰度低于其它处理组，所以空白对照组P/R值低于处理组；56d时处理组的大型溞种群恢复以及总藻丰度的下降，导致其P/R值低于空白对照组。

从内环境指标来看，pH表现出的显著剂量-效应关系均为正相关，这与水中藻类(不包括固着藻类)丰度的变化规律较一致。因此除固着藻类之外的水中藻类种群是影响本系统pH变化的主要因素。

从系统整体水平来看，综合考虑物种丰度和系统功能性指标，铜离子对微宇宙7～56d-NOEC均低于110.80μg·L^-1，63d-NOEC为110.80μg·L^-1，反映了试验后期系统群落的恢复。

表1不同终点在各取样日期的LOECs(Dennett’s test,p<0.05)

^a和对照组相比数量显著上升(↑)或下降(↓)。^b无明显剂量-效应关系。

(5)系统水平生态危害综合表征

综合硫酸铜对微宇宙结构、功能和内环境指标的影响分析，得到硫酸铜对微宇宙系统水平的生态危害综合评估结果如下：

7～56d-NOEC<110.80μg·L^-1；

63d-NOEC＝110.80μg·L^-1。

结合测试评估过程中对影响系统结构、功能和内环境指标变化主导影响因素及种间关系、系统反馈调节的分析，形成硫酸铜系统综合危害路径图(图8).其危害作用路径描述如下：

硫酸铜主要通过直接生物毒性作用和间接种间关系调节作用于本模拟生态系统。首先，硫酸铜主要通过直接生物致毒作用于轮虫、大型溞等浮游类无脊椎动物和固着藻类，而微型浮游藻类的种群变化主要受制于无脊椎动物所释放的捕食压力。再者，由于固着生长的特点，无脊椎动物难以摄食固着藻类，从而导致固着藻类在空白对照组中的快速生长，并与微型浮游藻类产生营养竞争关系。同时，轮虫的种群变化也受到大型溞摄食压力的重要影响。最后水生植物通过光合作用、水生动物通过呼吸作用产生了系统的初级生产量和呼吸消耗量，形成了在平衡状态(P/R＝1)附近变化的群落代谢水平。系统的pH、DO内环境也因这些生物过程发生了改变，加之受试药物硫酸铜自身的浓度变化，最终形成对系统各类生物的反馈信号，进而反向影响系统种群的变化(如在试验后期高浓度处理组小球藻和栅藻种群的恢复以及低浓度处理组大型溞种群的恢复)。整个过程体现了外源化学品对生态系统结构、功能和内环境的影响，以及生态系统的反馈调节作用。

本发明的一种系统水平生态危害综合评估与表征方法已经通过具体的实例进行了描述，本领域技术人员可借鉴本发明内容，适当改变原料、工艺条件等环节来实现相应的其它目的，其相关改变都没有脱离本发明的内容，所有类似的替换和改动对于本领域技术人员来说是显而易见的，都被视为包括在本发明的范围之内。