烟用香精香料的液相色谱指纹图谱的构建方法

摘要

本发明公开了一种烟用香精香料的液相色谱指纹图谱的构建方法。是利用液相色谱的二极管阵列检测器和折光指数检测器进行液相色谱指纹图谱的分析构建，所述液相色谱的参数条件为：色谱柱：METACARBHPLUS300×7.8mm；保护柱：METACARBHPLUS保护柱；柱温箱温度：60℃；流动相：6mMH

说明书

技术领域

本发明属于烟用香精分析检测和质量控制技术领域，更具体地，涉及一种烟用香精香料的液相色谱指纹图谱的构建方法。

背景技术

烟用香精香料技术是烟草行业的重要核心技术之一，烟用香精香料对保持卷烟品牌的香气风格特征具有重要意义。香精香料质量的变化直接影响卷烟的质量。烟用香精香料多取材于天然香料，其质量会受到原产地、生产工艺等诸多因素影响，而烟用香精香料对卷烟品质的影响是来自于自身多种成分之间的协同作用，所以系统的分析化学成分，建立全面反映所含成分的指纹图谱将更加有效地体现其化学成分的整体性。通过计算指纹图谱之间相似度来定性地对烟用香精香料的品质进行监控，是一种重要和理想的控制途径。应用液相色谱建立香精香料的指纹图谱可有效地应用于烟用香精香料的安全性和质量稳定性控制以及性质区分等诸多方面，具有重要的意义。烟用香精香料的化学成分的多样性和复杂性一直都是其质量控制的重点和难点，烟用香精香料指纹图谱的获得，只有在建立科学的液相色谱分析方法后才能稳定、简便和有效地获得。

指纹图谱是随着现代分析技术发展而诞生的一种从整体上研究复杂物质体系的技术，目前在环境保护、食品评价、中药质量控制等领域中得到应用，尤其在中药材上应用比较广泛。而指纹图谱在烟用香精香料质量控制方面的应用报道相对较少。

现有研究有利用气相色谱 - 质谱联用仪（ GC/MS ）两种分析仪器的联用对烟用香精香料的化学成分进行分析，获取特征的指纹图谱，通过计算实测样品与标准样品之间指纹图谱相似度的数值，判断两者内在化学成分的接近程度。

高效液相色谱法是非常重要的分析方法之一，在卷烟生产企业和研究单位使用较广泛。随着对产品检测要求的不断提高，HPLC中采用检测器联用技术，取得了一些进展，但多数是在中药领域。但目前少见应用高效液相色谱法进行烟用香精香料的指纹图谱研究。因为在具体分析特定的对象中，选择怎样的检测器进行联用、如何进行检测器之间的联接、样品应该怎样科学地预处理、在所述检测器联用情况下如何确定具体的检测条件等方面存在着很多的科技难关需要去攻克，以色谱柱为例，色谱柱的价格昂贵，如果参照现有研究成果进行简单筛选工艺条件，不断更换色谱柱以获得最终方案，昂贵的研究成本很难承受。而各个工艺条件之间互相影响、互相牵制，如何才能够使用更加低的成本去进行更有效、快捷的分析工作，一直是困扰着本技术领域的技术难题，针对一种对象所取得的检测器联用研究成果并不能简单参照地应用于另一种对象，尤其是针对化学成分具有多样性和复杂性特点的烟用香精香料。

目前未见将两种检测器科学联用实现一次进样成功并结合适宜的色谱分离条件成功建立烟用香精香料指纹图谱的相关技术报道。

发明内容

本发明的要解决的技术问题是针对现有应用液相色谱建立烟用香精香料指纹图谱的技术不足，提供一种烟用香精香料的液相色谱指纹图谱的构建方法。

本发明的另一要解决的技术问题是提供所述构建方法的应用。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

提供一种烟用香精香料的液相色谱指纹图谱的构建方法，是利用液相色谱的二极管阵列检测器（PDAD）和折光指数检测器（RID）进行液相色谱指纹图谱的分析构建，所述液相色谱的参数条件为：

色谱柱：METACARB H PLUS 300×7.8 mm；

保护柱：METACARB H PLUS保护柱；

柱温箱温度：60℃；

流动相：6 mM H₂SO₄；

流速：0.4 mL/min；

停泵时间：120 min。

二极管阵列检测器检测波长：200～360 nm；

折光指数检测器光学元件温度：30～45℃。

进一步优选地，所述DAD检测波长：210 nm；

进一步优选地，所述RID光学元件温度：35 ℃。

所述烟用香精香料的液相色谱指纹图谱的构建方法，采用简单易行的相同方法对样品进行前处理后实现一次进样，全面获得烟草样品的指纹图谱分析。所述方法包括以下步骤：

S1.样品前处理；

S2.装置构建；将两种检测器安装于液相色谱仪器中，其中二极管阵列检测器在前，折光指数检测器在后；流动相液体先经过二极管阵列检测器，再经过折光指数检测器，最后作为废液排出检测器；

S3.进样分析；

其中，S1所述的样品前处理具体是取0.1 mL样品置于10 mL容量瓶中，用6 mM H₂SO₄定容并混匀后过滤。

优选地，所述过滤是经0.45μm尼龙滤膜过滤。

优选地，所述进样的量为10μL。

本发明同时提供所述构建方法的应用，应用于建立烟用香精香料样品的指纹图谱。尤其应用于含糖和/或糖醇的烟用香精香料样品的指纹图谱构建。

 本发明的有益效果体现于：

二极管阵列检测器（PDAD）是20世纪80年代才出现的一种光学多通道检测器，它可以看作是UVD的一个分支，目前应用于生物样品、中草药的定性定量分析。二极管阵列检测器（PDAD）的灵敏度较好，但本申请人研究发现，二极管阵列检测器（PDAD）在分析烟用香精香料具有不足，对不具有紫外吸收基团的化合物没有响应，而很多烟用香精香料都含有这类化合物（例如糖或糖醇类），因此单独采用二极管阵列检测器（PDAD）无法体现糖或糖醇类化合物的指纹图谱特征，示差折光检测器（RID）是一种通用型检测器，只要被测组分与洗脱液的折光指数有差别就可使用。示差折光检测器（RID）的灵敏度相对较低，但是对没有紫外吸收的物质具有较好的响应，同时也容易使用，维护成本低。本申请人创造性地研究总结发现利用二极管阵列检测器和示差折光检测器的联用实现烟用香精香料的指纹图谱分析。

但在实际应用中，由于烟用香精香料化学成分具有多样性和复杂性特点，仅仅基于二极管阵列检测器和示差折光检测器的联用设计并不能顺利实现样品的指纹图谱分析。二极管阵列检测器和示差折光检测器的联用设计必须与科学的样品前处理方法、色谱分离整体技术方案合理、系统地结合才能成功解决烟用香精香料的指纹图谱分析。

基于本申请人对烟用香精香料物质特性的长期针对性深入研究，总结出采用浓度为6 mM的 H₂SO₄按比例添加于样品中对进行溶解定容后采用0.45μm尼龙滤膜过滤获得的样品液可用于一次进样并保证后续的分离和指纹图谱分析的成功完成。

进一步地，本发明采用METACARB H PLUS 300×7.8 mm作为色谱柱并同时采用METACARB H PLUS保护柱，配套研究总结出适宜的液相色谱分离装置和精确的工艺，获得较好的适用于所述两种检测器联用的分离效果，结合二极管阵列检测器（DAD）和折光指数检测器（RID）合适联用方式最终实现行联用。

进一步地，本发明结合科学的样品前处理方法获得进样用的样品液，实现一次进样、成功分离并实现两种检测器的联合指纹图谱输出。

综上所述，本发明提供了一种系统完整的、针对烟用香精香料的指纹图谱构建方法，从科学的样品前处理方法、获得配套研究总结出适宜的液相色谱分离装置和精确的工艺，获得较好的适用于所述两种检测器联用的分离效果，结合二极管阵列检测器（DAD）和折光指数检测器（RID）合适联用方式，方便快捷地获得烟用香精香料的指纹图谱信息，可凸显烟用香精香料样品的指纹特征，能有效应用于含不具有紫外吸收基团化合物的烟用香精香料样品的指纹图谱构建，具有重要的实际应用价值。

附图说明

图1 实施例1指纹图谱。

图2 实施例1指纹图谱局部放大图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例进一步说明本发明。除非特别说明，本发明实施例采用的设备、试剂和方法为本领域常规使用的设备、试剂和方法。

实施例1

本实施例采用Agilent 1200 液相色谱仪，配DAD和RID；浓硫酸（分析纯）、超纯水；0.45μm尼龙滤膜。用于检测分析的烟用香精香料样品由广东中烟工业有限责任公司提供，样品仅用于说明本发明方法，并不因此限定本发明方法适用的样品范围。

配制6 mM H₂SO₄溶液（配制方法参照本领域常规）。

检测分析步骤如下：

S1.样品前处理：取0.1 mL烟用香精香料样品置于10 mL容量瓶中，用6 mM H₂SO₄定容并混匀，经0.45μm尼龙滤膜过滤后以备后续步骤进行液相色谱分析；

S2.装置构建；将两种检测器安装于液相色谱仪器中，其中二极管阵列检测器在前，折光指数检测器在后；流动相液体先经过二极管阵列检测器，再经过折光指数检测器，最后作为废液排出检测器；

S3. 进样分析；

本实施例进样量取10μL。

实验过程中，本实施例同时重点研究了改变DAD检测波长对检测结果的影响，改变波长后，在DAD色谱图中的色谱峰的峰高会有所降低，即检测灵敏度会有所降低。灵敏度的提高，有利于获得更多的图谱信息。实验发现在本发明其他检测条件一定的情况下，提供的波长在 200～360 nm波长范围内，适合分析多种化合物，可充分获得烟用香精香料的指纹图谱信息。本实施例同时重点研究了改变RID光学元件温度进行实验。实验发现，RID光学元件温度设置于在 30～45℃范围内，对RID色谱图的影响不明显，与原图基本一致。

综合考虑实验对象的针对性、实验结果的准确性、灵敏度等因素，最后确定的最优的液相色谱的分析参数条件为：

色谱柱：METACARB H PLUS 300×7.8 mm；

保护柱：METACARB H PLUS保护柱；

柱温箱温度：60℃；

流动相：6 mM H₂SO₄；

流速：0.4 mL/min；

停泵时间：120 min；

DAD检测波长：210 nM；

RID光学元件温度：35℃。

在上述分析条件下，获得指纹图谱请见附图1所示，其中上图是DAD色谱图，下图是RID色谱图。附图2是局部放大的指纹图谱。有附图可见，本发明总结出科学合理的前处理方实现烟用香精香料的液相色谱指纹图谱的构建。由指纹图谱可见，该样品成分比较简单，基本不含糖或糖醇类物质，分析结果与其他常规方法检测结果一致。 基于本实施例所获得的烟用香精样品化学组成特征的组分群体分析图谱结合常规的计算分析技术对即可对样品进行专属、宏观、整体的化学特征综合信息分析计算研究。