眼部感染常见病原体的实时荧光多重PCR快速检测试剂盒

摘要

本发明属于核酸检测技术领域，具体涉及眼部感染常见病原体的实时荧光多重PCR快速检测试剂盒。本发明所涉及的检测试剂盒，避免了不同引物/探针之间互相产生交联的问题，每组引物/探针不会对其他目标和非目标核酸序列产生交叉同源性，可实现一次反应同时检测多种引起眼部感染的常见病原体，检测所需时间短，准确性高，为临床和检测实验室提供了有力的检测工具。

说明书

技术领域

   本发明属于核酸检测技术领域，具体涉及眼部感染常见病原体的实时荧光多重PCR快速检测试剂盒。

背景技术

眼睛感染指细菌、病毒、真菌、寄生虫等病原体侵入人体眼部所引起的局部组织炎症反应。最常受到感染的部位包括眼皮、结膜、角膜和巩膜。最常见的炎症是结膜炎和眼睑炎。

感染原因很多，包括不注意眼部卫生，用手揉眼睛引起的细菌或病毒感染;被已感染者直接或间接传染;灰尘等进入眼睛造成角膜异物也可引发感染;母婴传播也可引起眼部感染。

主要感染病毒有单纯疱疹病毒、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒、人类免疫缺陷病毒、腺病毒和肠道病毒等。由于眼部感染有可能直接影响患者视力，并且其他原因，如过敏反应或眼部刺激等也可造成与感染相似的症状，因此通过病原体检测及时确诊眼部感染就显得尤为重要。

病毒分离培养是最特异的诊断方法，培养后应用酶免疫法或核酸探针技术检测培养物上清液中的反转录酶活性或检测病毒抗原，但病毒的分离培养需在特定的实验室中进行，且敏感性较低；电镜观察法实施较为方便，但是可检测病原体种类较少，并且价格昂贵；血清学检查，操作比较繁琐；免疫荧光技术敏感性和特异性均较高，但是结果判读的主观性较强且需要使用荧光显微镜；荧光核酸PCR技术具有敏感性高，检测快速等优点，预期将会在临床诊断中有广泛的应用。然而，传统的荧光实时PCR每次只能扩增一种病原体的核酸，要准确找出致病病原体需多次尝试，耗费大量的时间和精力，并且对于多种病原体导致的感染无法有效区分。新型的多重实时荧光PCR可以有效弥补单重PCR的这些缺陷，是一种非常有应用前景的诊断方法。

要成功实施多重PCR，需要解决几个技术问题：                                                由于每一种扩增子的最佳扩增条件都不一样，需要协调每个单独反应的条件以保证在单一扩增条件下各扩增子都能进行成功扩增。由于需要使用多组引物/探针组合，不同引物/探针之间互相产生交联的可能性很大，因此在设计时需要考虑消除这一可能性。每组引物/探针不能对其他目标和非目标核酸序列有交叉同源性，以防止产生假阳性的结果，影响对疾病的诊断。需要有一定的方法来排除来自于核酸提取方面的问题，这就要求有内对照作为参考。

发明内容

本发明的目的是解决不同引物/探针之间互相产生交联的问题，提供眼部感染常见病原体的实时荧光多重PCR快速检测试剂盒，能够快速、准确的进行检测。

本发明为解决上述问题所采取的技术方案是：眼部感染常见病原体的实时荧光多重PCR快速检测试剂盒，试剂盒内设有阳性对照、阴性对照和内对照，该试剂盒内还设有分别用于检测单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型、带状疱疹病毒、腺病毒和沙眼衣原体中一种或多种病原体的多种引物及探针序列的混合物，其中，用于单纯疱疹病毒1型检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：1 和 SEQ ID NO ：2 ，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：3，荧光标记为FAM；用于单纯疱疹病毒2型检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：4和 SEQ ID NO ：5 ，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：6，荧光标记为VIC；用于带状疱疹病毒检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：7和 SEQ ID NO ：8，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：9，荧光标记为Cy5；用于腺病毒检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：10 和 SEQ ID NO ：11 ，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：12，荧光标记为Cy5；用于沙眼衣原体检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：13 和 SEQ ID NO ：14 ，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：15，荧光标记为ROX；所述的内对照为鼠巨细胞病毒，用于鼠巨细胞病毒检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：16 和 SEQ ID NO ：17 ，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：18，荧光标记为YAK。

有益效果

本发明所涉及的检测试剂盒，避免了不同引物/探针之间互相产生交联的问题，每组引物/探针不会对其他目标和非目标核酸序列产生交叉同源性，可实现一次反应同时检测多种引起眼部感染的常见病原体，检测所需时间短，准确性高，为临床和检测实验室提供了有力的检测工具。

具体实施方式

眼部感染常见病原体的实时荧光多重PCR快速检测试剂盒，试剂盒内设有阳性对照、阴性对照和内对照，该试剂盒内还设有分别用于检测单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型、带状疱疹病毒、腺病毒和沙眼衣原体中一种或多种病原体的多种引物及探针序列的混合物，其中，用于单纯疱疹病毒1型检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：1 和 SEQ ID NO ：2 ，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：3，荧光标记为FAM；用于单纯疱疹病毒2型检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：4和 SEQ ID NO ：5 ，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：6，荧光标记为VIC；用于带状疱疹病毒检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：7和 SEQ ID NO ：8，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：9，荧光标记为Cy5；用于腺病毒检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：10 和 SEQ ID NO ：11 ，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：12，荧光标记为Cy5；用于沙眼衣原体检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：13 和 SEQ ID NO ：14 ，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：15，荧光标记为ROX；所述的内对照为鼠巨细胞病毒，用于鼠巨细胞病毒检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：16 和 SEQ ID NO ：17 ，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：18，荧光标记为YAK。

实施例一：检测单纯疱疹病毒1：使用单纯疱疹病毒1阳性对照作为样本。相应引物/探针组合及阳性对照的获得见实施例二。在提取之前先向样本和阴性对照加入2μl内对照(5μM)。使用MagMAX Total Nucleic Acid Isolation Kit(Invitrogen)从样本中提取核酸。然后向TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix(Invitrogen, 13.5μl)中分别加入各引物/探针组合(1.5μl)以及从样本或阴性对照提取的核酸(10μl)。样本最终浓度为5μM，引物/探针浓度为0.4μM。随后将各反应管按照以下程序在ABI 7500(Applied Biosystems)实时荧光PCR仪上进行PCR反应：50℃保持15min(逆转录)，95℃保持10min(热启动)；95℃维持8s(变性)，60℃维持34s(退火/延伸，采集荧光信号)，40个循环。结果可检测到单纯疱疹病毒1存在。其余各病原体的检测与实施例1相同。

实施例二：一次检测眼科感染5种病原体的检测试剂盒

1）设计引物/探针组合：根据各个病原体的核酸序列，进行同种间的序列比对以寻找保守区域，并使用Beacon Designer 软件对这些保守区域进行多重PCR的引物和Taqman探针设计。将所得到的各引物/探针组合在NCBI网站上进行BLAST分析以确保与样本中可能存在的其他微生物不发生交叉反应。最后通过实验验证其性能。内对照的设计采用同样的方法。

所设计的各组引物/探针如下：

反应一：含单纯疱疹病毒1,2和带状疱疹病毒

反应二：含腺病毒，沙眼衣原体和鼠巨细胞病毒（内对照）

2）制备各个阳性对照：首先分离各种病原体的核酸，并制备PCR反应体系，然后将各种病原体核酸分别加入反应体系中进行PCR反应。反应产物进行回收并用电泳鉴定。接着使用合适的TA克隆试剂盒（如TOPO  TA Cloning  Kit for Subcloning, with TOP10 E. Coli，Invitrogen)和质粒纯化试剂盒(如PureLink 96 Plasmid Purification System，Invitrogen)获得连接有各目标病原体序列的质粒载体，用来作为PCR反应的阳性对照。

3）制备内对照：使用细胞培养法分离mCMV毒株。

4）准备反应主混合物：使用TaqMan  Fast Virus 1-Step Master Mix（Invitrogen），含有预混的Taq DNA聚合酶，反转录酶，dNTP，RNase抑制剂等组分的主混合物。

5）进行PCR扩增反应：在提取之前先向样本和阴性对照加入2μl内对照(5μM)。使用适当的RNA/DNA提取技术(如MagMAX  Total Nucleic Acid Isolation Kit，Invitrogen)从样本中提取核酸。然后向反应主混合物(13.5μl)中分别加入各引物/探针组合(1.5μl)以及从样本或阴性对照提取的核酸(10μl)。以相同的比例对阳性对照进行混合操作。最终浓度阳性对照为5μM，引物/探针浓度为0.4μM。随后将各反应管按照以下程序在合适的实时荧光PCR仪(如ABI 7500，Applied Biosystems)上进行PCR反应：50℃保持15min(逆转录)，95℃保持10min(热启动)；95℃维持8s(变性)，60℃维持34s(退火/延伸，采集荧光信号)，40个循环。

6）结果判定：所有阴性对照的信号值都应低于阈值。所有阳性对照信号都应有指数上升且Ct值必须小于33。内对照信号应有指数上升且Ct值必须小于33。否则说明扩增不成功。如某种病原体相应的荧光信号产生指数上升，则为阳性，否则为阴性。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  华美生物工程有限公司

 

<120>  眼部感染常见病原体的实时荧光多重PCR快速检测试剂盒

 

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<170>  PatentIn version 3.3

 

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<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

gatggcgaac atcttgag                                                   18

 

 

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<212>  DNA

<213>  人工序列

 

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gttgggtttg tccttctc                                                   18

 

 

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<212>  DNA

<213>  人工序列

 

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atgggacccg tgacacccta                                                 20

 

 

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<212>  DNA

<213>  人工序列

 

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gagctactat gacagcttta g                                               21

 

 

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<212>  DNA

<213>  人工序列

 

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caggataaat tgtgtgatct c                                               21

 

 

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<212>  DNA

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<400>  6

tcttcactag ccgcaggtac g                                               21

 

 

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<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  7

tacggttcac ccgaaatc                                                   18

 

 

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<212>  DNA

<213>  人工序列

 

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ggaagtaacg acgatgaa                                                   18

 

 

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<212>  DNA

<213>  人工序列

 

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cgtcttccgt aaccacatca gca                                             23

 

 

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<212>  DNA

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gtgggtctca tgtactata                                                  19

 

 

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<213>  人工序列

 

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ctctgtgttt ctgtcttg                                                   18

 

 

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<212>  DNA

<213>  人工序列

 

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cgaccacagc attcaactga gatg                                            24

 

 

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<212>  DNA

<213>  人工序列

 

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caagcttaga tccgtttc                                                   18

 

 

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<213>  人工序列

 

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<213>  人工序列

 

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catacggttt tcctcgatga tttgagc                                         27

 

 

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cctgaatgcc ttattctg                                                   18

 

 

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cacacatacc aagtcatg                                                   18

 

 

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<212>  DNA

<213>  人工序列

 

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cgaccgactg accaccgaga  20