提高布氏杆菌病活疫苗产品活菌率的方法

摘要

本发明提供一种提高布氏杆菌病活疫苗产品活菌率的方法，所述方法包括一级菌种制备、二级菌种制备和菌液培养。通过提高50％葡萄糖溶液加入量，提高培养基氨氮、总氮含量，控制空气通入量来提高活菌数，能够有效提高布氏杆菌病活疫苗的活菌率，并保持较高的菌体活力，提高冻干后保存期内细菌的存活率。利用本发明方法培养得到的菌液的菌活数可达到1800-2200亿/ml，保存期13个月其菌活数能达到1400-1700亿/ml，活菌率占63％-77％，具有产量高、保存期长、生产成本低等优点。

说明书

技术领域

本发明涉及兽用生物制品领域，具体地说，涉及一种提高布氏杆 菌病活疫苗产品活菌率的方法。

背景技术

布鲁氏菌病(Brucellosis)是由布氏菌属(Brucella)成员引起的一种 人畜共患传染病，严重威胁着人和多种动物的生命健康。OIE将其列 为B类动物疫病，我国将其列为二类动物疫病。该病流行范围广泛， 遍及世界各地。病原为布鲁氏杆菌，为细小、两端钝圆的球杆菌或短 杆菌，革兰氏染色阴性，无鞭毛，不运动，不形成芽孢。羊在国内为 主要传染源，其次为牛和猪。研究认为，使用疫苗是预防和控制布病 的有效方法。

目前市场上普遍使用的疫苗主要是布氏杆菌病活疫苗(S2株)、 布氏菌病活疫苗(A19株)、布氏杆菌病活疫苗(M5或M5-90株)等， 主要用于猪、牛、羊布氏杆菌病的防治。

现有布氏杆菌病活疫苗生产规程如下：

一级菌种制备：冻干菌种启封后，用蛋白胨水溶解，划线移植于 胰蛋白胨琼脂平板或其他适宜培养基上，在36-37℃培养2-3日。观察 菌落形态，选取合适菌落10个以上，移植于胰蛋白胨琼脂斜面培养基， 36-37℃培养48-72小时，作为一级菌种。在2-8℃，使用期应不超过1 个月。

二级菌种制备：取一级菌种接种于胰蛋白胨琼脂扁瓶或其他适宜 培养基，置36-37℃培养48-72小时，肉眼检查纯净后，每个扁瓶加蛋 白胨水(pH 6.5-7.0)适量，将菌苔洗下，接种于1-2万ml的适宜液体 培养基，置36-37℃培养36-72小时，用肝汤琼脂进行纯粹检验，并置 2-8℃保存，使用期应不超过30日。

菌液培养：按培养基量加入适量的消泡剂，灭菌后按培养基体积 的1％-2％接种二级菌种液，在36-37℃逐渐增大通气量，培养36小时， 培养过程中可根据需要加入50％的葡萄糖溶液，每次加入量为培养基 总量的1％-2％。

按现有规程进行布氏杆菌病活疫苗(A19株)、布氏菌病活疫苗 (M5或M5-90株)、布氏杆菌病活疫苗(S2株)生产培养得到菌液的 活菌数A19约为300亿/毫升左右，M5约为500亿/毫升左右，S2约为 1200亿/毫升左右，通过对菌液的进一步浓缩，才能到达1400-1800亿 /ml的菌活数。但是经过保存期实验，疫苗产品存放5个月后，其菌活 数仅能达到600-800亿/ml，其活菌率约占33％-57％。

综上，采用现有规程生产工艺生产的疫苗产品存在菌活率低、保 存期短、生产成本高等问题。

ZL201110180953.7公开了一种布氏杆菌病活疫苗的制备方法，具 体涉及提高布氏杆菌病活疫苗(A19株)菌活数的方法，该方法通过 在现有规程的基础上改变通气量的方式提高菌活数，得到的菌活数能 达到1500-1800亿/ml。通过对该方法生产的活疫苗产品进行保存期试 验，结果表明疫苗产品存放13个月后，其菌活数仅能达到800-1000亿 /ml，其活菌率约占44％-61％。

发明内容

本发明的目的是克服现有的布氏杆菌病活疫苗的生产方法中生 产的疫苗产品活菌率低、保存期短、生产成本高等问题，提供一种提 高布氏杆菌病活疫苗产品活菌率的新方法。

为了实现本发明目的，本发明提供的一种提高布氏杆菌病活疫苗 产品活菌率的方法，所述方法包括一级菌种制备、二级菌种制备和菌 液培养。

其中，在一级菌种制备阶段，冻干菌种启封后，用蛋白胨水溶解， 划线移植于胰蛋白胨琼脂平板或其他适宜培养基上，在36-37℃培养 2-3日。观察菌落形态，选取合适菌落10个以上，移植于胰蛋白胨琼 脂斜面培养基，36-37℃培养48-72小时，作为一级菌种。在2-8℃，使 用期应不超过1个月。

在二级菌种制备阶段，取一级菌种接种于胰蛋白胨琼脂扁瓶或其 他适宜培养基上，置36-37℃培养48-72小时，肉眼检查纯净后，向扁 瓶中加入蛋白胨水将菌苔洗下，接种液体培养基，置36-37℃通入洁 净压缩空气培养36-72小时后，进行纯粹检验，并置2-8℃保存。使用 期应不超过30日。

在菌液培养阶段，基础培养基中氨氮含量应不低于1.6mg/ml，总 氮量不低于5.5mg/ml，另外向培养基中加入培养基重量0.003～0.005％ 的消泡剂，灭菌后按培养基体积的1％-2％接种二级菌种，同时按培养 基体积的4％-6％加入浓度为50％的葡萄糖溶液，在36-37℃按照逐步增 大通气量的方式通入洁净压缩空气进行培养，培养36小时；在通气培 养过程中，根据需要加入浓度为50％的葡萄糖溶液，每次加入量为培 养基总重量的1％-3％，且培养36小时后培养基的pH值为6.9-7.2(优选 pH7.0)。培养结束后取样进行纯粹检验及活菌计数，应符合质量标准。

前述的方法，在菌液培养阶段，所述逐步增大通气量是指单位时 间内空气通入单位培养基气量，具体如下：

0～3小时：0.1～0.15m³/L·小时

3～6小时：0.15～0.2m³/L·小时

6～9小时：0.2～0.23m³/L·小时

9～12小时：0.23～0.24m³/L·小时

12～18小时：0.24～0.26m³/L·小时

18～24小时：0.26～0.3m³/L·小时

24～36小时：0.3～0.33m³/L·小时

本发明中使用的消泡剂为聚醚多元醇。

所述洁净压缩空气是指普通空气经无油压缩机压缩，再经吸附式 压缩空气干燥器及多级过滤器、除味活性炭过滤器和末端0.22μm滤器 除菌过滤，其中尘埃粒径≤0.01μm，脱臭≥99.5％，残油≤0.003ppm。

本发明中涉及的布氏杆菌病活疫苗包括但不限于S2株、A19株、 M5株或M5-90株。

本发明提供了一种提高布氏杆菌病活疫苗产品活菌率的生产工 艺，为布氏杆菌病活疫苗的生产提供了新技术。通过提高50％葡萄糖 溶液加入量，提高培养基氨氮、总氮含量，控制空气通入量来提高活 菌数，能够有效提高布氏杆菌病活疫苗的活菌率，并保持较高的菌体 活力，提高冻干后保存期内细菌的存活率。利用本发明方法培养得到 的菌液的菌活数可达到1800-2200亿/ml，保存期13个月其菌活数能达 到1400-1700亿/ml，活菌率占63％-77％，具有产量高、保存期长、生 产成本低等优点。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未 特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规 手段，所用原料均为市售商品。

以下实施例所述洁净压缩空气是指普通空气经无油压缩机压缩， 再经吸附式压缩空气干燥器及多级过滤器、除味活性炭过滤器和末端 0.22μm滤器除菌过滤，其中尘埃粒径≤0.01μm，脱臭≥99.5％，残油 ≤0.003ppm。

实施例1布氏杆菌病活疫苗(S2株)的制备

一、菌种

猪种布氏菌弱毒菌S2株，由中国兽医药品监察所供应。

二、生产用种子制备

一级菌种的制备与鉴定：

按《布氏杆菌病活疫苗制造及检验规程》(简称“规程”)要求开 启布氏杆菌病活疫苗(S2株)冻干菌种安瓶溶解稀释后，划线接种酶 胰蛋白胨琼脂平板培养基上，37℃培养72小时。

观察菌落形态，应符合规程标准。在低倍显微镜下，分别选取合 格菌落10个以上，混合接种肝汤琼脂斜面中管，37℃培养72小时，按 规程检验应合格。检验合格后置2-8℃保存，待用。

二级菌种的制备：

取一级菌种6支以上各用马丁肉汤刮洗菌苔后分别接种肝汤琼脂 三角瓶斜面(或扁瓶)，37℃培养72小时，经肉眼检查纯净后，选取6 只用适量蛋白胨水或马丁肉汤刮洗菌苔，接种于盛有灭菌马丁肉汤的 种子培养罐，36～37℃通入洁净压缩空气培养36小时，取样进行纯粹 检验及活菌计数，然后保压降温存放或放入种子瓶中置2-8℃存放。

三、制苗用菌液制备与检验

制苗用培养基的制备：配制干粉马丁肉汤(pH6.4-6.8)，配制后 经管道输入反应缸内，另外加培养基重量0.004％的消泡剂聚醚多元 醇，116-119℃高压灭菌60分钟后保压降温至37℃备用。

菌液培养：按培养基量的1.5％接入二级菌种液，同时按培养基体 积的4％加入50％的葡萄糖溶液，在36～37℃按照逐步增大通气量的方 式通入洁净压缩空气进行培养，培养36小时。

单位时间内空气通入单位培养基气量具体如下：

0～3小时：0.15m³/L·小时

3～6小时：0.2m³/L·小时

6～9小时：0.22m³/L·小时

9～12小时：0.24m³/L·小时

12～18小时：0.25m³/L·小时

18～24小时：0.28m³/L·小时

24～36小时：0.32m³/L·小时

在通气培养过程中，可根据需要加入50％的葡萄糖溶液，每次加 入量为培养基总体积的2％。培养结束后取样进行纯粹检验及活菌计 数，应符合质量标准。

制苗用培养基中的氨氮应不低于1.6mg/ml，总氮量应不低于 5.5mg/ml。36小时培养基的pH应保持在7.0左右。

对比例1

分别利用常规生产工艺、ZL201110180953.7的工艺以及实施例1 的改进工艺进行布氏杆菌病活疫苗(S2株)的制备，结果如表1所示。

表1三种工艺参数比较

将常规工艺、ZL201110180953.7工艺和实施例1的改进工艺分别 制备的布氏杆菌病活疫苗(S2株)冻干后放置0个月、3个月、5个月、 7个月、9个月、11个月、13个月分别进行活菌计数检验，菌活数如表 2所示，并计算活菌率。

表2不同时间存放后疫苗的活菌计数及活菌率

实施例2布氏杆菌病活疫苗(A19株)的制备

一、菌种

原始菌种：

牛种布氏菌弱毒菌A19株，由中国兽医药品监察所供应。

二、生产用菌种制备

一级菌种的制备与鉴定：

按《布氏杆菌病活疫苗制造及检验规程》(简称“规程”)要求开 启布氏杆菌病活疫苗(A19株)冻干菌种安瓶溶解稀释后，划线接种 酶胰蛋白胨琼脂平板培养基上，37℃培养72小时。

观察菌落形态，应符合规程标准。在低倍显微镜下，分别选取合 格菌落10个以上，混合接种肝汤琼脂斜面中管，37℃培养72小时，按 规程检验应合格。检验合格后置2-8℃保存，待用。

二级菌种的制备：

取一级菌种6支以上各用马丁肉汤刮洗菌苔后接种肝汤琼脂三角 瓶斜面(或扁瓶)，37℃培养72小时，经肉眼检查纯净后，选取6只用 适量蛋白胨水或马丁肉汤刮洗菌苔，接种于盛有灭菌马丁肉汤的菌种 培养罐，36～37℃通入洁净压缩空气培养36小时，取样进行纯粹检验 及活菌计数，然后保压降温存放或放入菌种瓶中置2-8℃存放。

三、制苗用菌液制备与检验

制苗用培养基的制备：配制干粉马丁肉汤(pH6.4-6.8)，配制后 经管道输入反应缸内，另外加培养基重量0.003的消泡剂聚醚多元醇， 116-119℃高压灭菌60分钟后保压降温至37℃备用。

菌液培养：按培养基量的1％接入二级菌种液，同时按培养基体 积的4％加入50％的葡萄糖溶液，在36～37℃按照逐步增大通气量的方 式通入洁净压缩空气进行培养，培养36小时。

单位时间内空气通入单位培养基气量具体如下：

0～3小时：0.1m³/L·小时

3～6小时：0.15m³/L·小时

6～9小时：0.23m³/L·小时

9～12小时：0.23m³/L·小时

12～18小时：0.26m³/L·小时

18～24小时：0.3m³/L·小时

24～36小时：0.3m³/L·小时

在通气培养过程中，可根据需要加入50％的葡萄糖溶液，每次加 入量为培养基总体积的1％。培养结束后取样进行纯粹检验及活菌计 数，应符合质量标准。

制苗用培养基中的氨氮应不低于1.6mg/ml，总氮量应不低于 5.5mg/ml。36小时培养基的pH应保持在7.0左右。

分别利用常规生产工艺、ZL201110180953.7的工艺以及实施例2 的改进工艺进行布氏杆菌病活疫苗(A19株)的制备，结果如表3所 示。

表3三种工艺参数比较

将常规工艺、ZL201110180953.7工艺和实施例2的改进工艺分别 制备的布氏杆菌病活疫苗(A19株)冻干后放置0个月、3个月、5个 月、7个月、9个月、11个月、13个月分别进行活菌计数检验，菌活数 如表4所示，并计算活菌率。

表4不同时间存放后疫苗的活菌计数及活菌率

实施例3布氏杆菌病活疫苗(M5株)的制备

一、菌种

原始菌种：

羊种布氏菌弱毒菌M5株，由哈尔滨兽医研究所供应。

二、生产用菌种制备

一级菌种的制备与鉴定：

按《布氏杆菌病活疫苗制造及检验规程》(简称“规程”)要求开 启布氏杆菌病活疫苗(M5或M5-90株)冻干菌种安瓶溶解稀释后，划 线接种酶胰蛋白胨琼脂平板培养基上，37℃培养72小时。

观察菌落形态，应符合规程标准。在低倍显微镜下，分别选取合 格菌落10个以上，混合接种肝汤琼脂斜面中管，37℃培养72小时，按 规程检验应合格。检验合格后置2-8℃保存，待用。

二级菌种的制备：

取一级菌种6支以上各用马丁肉汤刮洗菌苔后接种肝汤琼脂三角 瓶斜面(或扁瓶)，37℃培养72小时，经肉眼检查纯净后，选取6只用 适量蛋白胨水或马丁肉汤刮洗菌苔，接种于盛有灭菌马丁肉汤的菌种 培养罐，36～37℃通入洁净压缩空气培养36小时，取样进行纯粹检验 及活菌计数，然后保压降温存放或放入菌种瓶中置2-8℃存放。

三、制苗用菌液制备与检验

制苗用培养基的制备：配制干粉马丁肉汤(pH6.4-6.8)配制后经 管道输入反应缸内，另外加0.005％消泡剂聚醚多元醇，116-119℃高 压灭菌60分钟后保压降温至37℃备用。

菌液培养：按培养基量的2％接入二级菌种菌液，同时按培养基 体积的4％加入50％的葡萄糖溶液，在36～37℃按照逐步增大通气量的 方式通入洁净压缩空气进行培养，培养36小时。

单位时间内空气通入单位培养基气量具体如下：

0～3小时：0.15m³/L·小时

3～6小时：0.2m³/L·小时

6～9小时：0.23m³/L·小时

9～12小时：0.24m³/L·小时

12～18小时：0.26m³/L·小时

18～24小时：0.3m³/L·小时

24～36小时：0.33m³/L·小时

在通气培养过程中，可根据需要加入50％的葡萄糖溶液，每次加 入量为培养基总量的3％。培养结束后取样进行纯粹检验及活菌计数， 应符合质量标准。

制苗用培养基中的氨氮应不低于1.6mg/ml，总氮量应不低于 5.5mg/ml。36小时培养基的pH应保持在7.0左右。

分别利用常规生产工艺、ZL201110180953.7的工艺以及实施例3 的改进工艺进行布氏杆菌病活疫苗(M5株)的制备，结果如表5所示。

表5三种工艺参数比较

将常规工艺、ZL201110180953.7工艺和实施例3的改进工艺分别 制备的布氏杆菌病活疫苗(M5株)冻干后放置0个月、3个月、5个月、 7个月、9个月、11个月、13个月分别进行活菌计数检验，菌活数如表 6所示，并计算活菌率。

表6不同时间存放后疫苗的活菌计数及活菌率

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详 尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本 领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础 上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。