一种苹果茎痘病毒实时荧光定量PCR检测方法

摘要

本发明提供了一种苹果茎痘病毒实时荧光定量PCR检测方法，属于病毒分子检测领域。该方法通过染毒材料的cDNA为模板，以ASPV-cp-F2和ASPV-cp-R2为引物进行PCR扩增，获得阳性重组质粒标准品，以阳性重组质粒标准品的拷贝数浓度和以该浓度的阳性重组质粒标准品为模板、采用特异性引物和探针进行的实时荧光定量PCR的Ct值构建标准曲线；将供试材料按照相同条件进行实时荧光定量PCR，通过比对Ct值与标准曲线，实现供试材料苹果茎痘病毒的定量检测。该方法实现了苹果茎痘病毒的定量测定，而且检测结果可直接通过电脑软件读出，避免了检测结果假阳性以及环境污染问题。

说明书

技术领域

本发明涉及病毒分子检测领域，具体而言，涉及一种苹果茎痘病毒实时荧光定量PCR检测方法。

背景技术

苹果茎痘病毒是苹果和梨树上普遍发生的潜隐性病毒之一，该病毒能引起苹果茎痘病、梨脉黄病、梨石痘病等多种病害，可致苹果和梨产量下降，品质变劣，严重影响我国的果树生产。目前检测ASPV的方法主要是常规RT-PCR技术。

ASPV的常规RT-PCR检测技术方案包括以下步骤：

1、设计常规RT-PCR检测引物；

2、提取果树供试样品的RNA并反转录成cDNA；

3、以cDNA为模版，利用特异扩增引物进行常规PCR扩增；

4、将扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳；

5、通过凝胶成像系统对电泳结果进行观察拍照，若观察到特异扩增条带可证明供试样品中含有ASPV，反则没有。

然而，ASPV的常规RT-PCR检测技术存在缺点：

(1)、操作步骤较为繁琐，费时费力；

(2)、需要对PCR扩增产物进行后处理，只有将扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳才能得到检测结果，但琼脂糖凝胶制作过程中需要加入致癌物质EB，易污染实验室环境，还会对实验人员的健康构成 威胁，同时后处理过程中不同样品间易发生交叉污染，造成检测结果的假阳性现象；

(3)、常规RT-PCR技术只能对病毒进行定性检测，无法定量检测

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种苹果茎痘病毒实时荧光定量PCR检测方法，该检测方法具有可实现供试材料苹果茎痘病毒的定量检测、不存在假阳性以及环境污染、检测时间短以及灵敏度高的技术效果。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

本发明提供了一种苹果茎痘病毒实时荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：

1)、以染毒材料的cDNA为模板，以ASPV-cp-F2和ASPV-cp-R2为引物进行PCR扩增，所获扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳后切胶回收并用载体连接后转化到感受态细胞，挑取阳性克隆增菌培养后进行质粒提取和鉴定，得到阳性重组质粒标准品；

2)、以经过梯度稀释的所述阳性重组质粒标准品的拷贝数浓度和以该浓度的阳性重组质粒标准品为模板、以ASPV-Probe3-F和ASPV-Probe3-R为引物、以ASPV-Probe3为探针所进行的实时荧光定量PCR的Ct值构建标准曲线；

3)、以供试材料的cDNA为模板，按照与步骤2)相同的扩增条件进行实时荧光定量PCR，得到的Ct值与所述标准曲线进行比对，实现供试材料苹果茎痘病毒的定量检测；

其中，所述ASPV-cp-F₂、ASPV-cp-R₂、ASPV-Probe3-F、ASPV-Probe3-R和ASPV-Probe3的核苷酸序列分别如SEQ>

本发明提供的这种检测方法，其采用染毒材料的cDNA为模板，通过特定的引物扩增出产物，该产物再通过载体连接以及转化之后，获得大量复制的片段，挑取阳性克隆增菌培养并进行质粒提取和鉴定(酶切鉴定)进而获得阳性重组质粒标准品。根据该阳性重组质粒标准品分子量将其换算成拷贝数浓度，并梯度稀释；然后以该浓度的阳性重组质粒标准品为模板、以ASPV-Probe3-F和ASPV-Probe3-R为引物、以ASPV-Probe3为探针所进行的实时荧光定量PCR的Ct值构建标准曲线(Ct值-拷贝数浓度)。上述反应中，ASPV-Probe3-F、ASPV-Probe3-R和ASPV-Probe3为特定设置的特异性扩增引物和探针，且在ASPV-Probe3的5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。

以供试材料的cDNA为模板按照与构建上述标准曲线相同的条件进行cDNA为模板，通过供试材料反应的Ct值以及标准曲线，直接获得供试材料中的苹果茎痘病毒的含量。

该方法实现了供试材料中的苹果茎痘病毒的定量测定，而且检测结果可直接通过电脑软件读出，不需要凝胶电泳以及成像检测等操作，进而避免了检测结果假阳性的同时也避免了环境污染以及EB对操作人员造成的身体危害。另外，该检测方法整个检测过程仅需1小时左右，具有节约时间以及灵敏度高的优点。

可选的，在步骤1)中：所述染毒材料的cDNA的制备方法包括：

提取感染有苹果茎痘病毒材料的总RNA，并以该RNA为模板进行反转录，得到染毒材料的cDNA。

通过提取感染有苹果茎痘病毒材料的总RNA，再进行反转录获得染毒材料的cDNA，该方法操作简便，易于实现。

可选的，在步骤1)中，所述琼脂糖凝胶电泳中所用的琼脂糖凝胶的浓度为1-2％。

可选的，在步骤1)中：所述载体为pEASY-T₃，所述感受态细胞为E.coli>

扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳后切胶回收片段，且为了获得大量复制的目标片段，该回收片段利用pEASY-T₃连接后转化到E.coli>

可选的，在步骤2)中：

所述阳性重组质粒标准品的OD₂₆₀/OD₂₈₀比值在1.8-2.0之间。

OD₂₆₀/OD₂₈₀比值在1.8-2.0之间的阳性重组质粒标准品，其纯度高，因此制成的标准曲线能够更加准确的反应Ct值与起始模板拷贝数浓度的关系。

可选的，在步骤2)中：

所述阳性重组质粒标准品的拷贝数浓度范围为：1.0×10⁸拷贝/μL～1.0×10¹拷贝/μL，且所述梯度稀释的倍数为10倍。

10倍稀释梯度的阳性重组质粒标准品的拷贝数浓度和其进行荧光定量PCR反应的Ct值的散点坐标均匀，更易获得高相关系数的标准曲线；而且1.0×10⁸拷贝/μL～1.0×10¹拷贝/μL检测范围大，提高了供试材料病毒检测的广泛性。

可选的，在步骤2)中：

所述标准曲线以所述阳性重组质粒标准品的拷贝数浓度的对数值为横坐标，以所述Ct值为纵坐标。

可选的，在步骤2)中，所述实时荧光定量PCR的过程中，反应体系为：

TransStart Probe qPCR Super Mix 10μL，ASPV-Probe3-F和ASPV-Probe3-R 4-5pmol，ASPV-Probe34-5pmol，模板1.0μL，双蒸水补齐至20μL。

可选的，在步骤2)中，所述实时荧光定量PCR的过程中，扩增程序为：

94℃预变性30-35s；94℃变性4-7s，55℃退火12-15s，72℃延伸15-20s，共35-40个循环。

该扩增程序下，其扩增特异性好。

可选的，所述实时荧光定量PCR采用Bio-Rad iQ^TM5实时荧光定量PCR仪进行。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)、通过标准曲线实现对供试材料中ASPV病毒的定量检测，而常规PCR技术只能实现ASPV的定性检测。

(2)、检测结果可由电脑软件直接读出，不需要进行反应后处理，所以避免了检测结果假阳性的产生及环境的污染。

(3)、该实时荧光定量PCR检测过程只需要1小时左右，与常规PCR技术相比，大大简化了检测步骤，缩短了检测的时间。

(4)、通过与常规PCR技术对比，其灵敏度是常规RT-PCR技术的100倍。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明实施例2提供的重组质粒ASPV-cp实时荧光定量PCR的特异性检测；

图2为现有技术中常规PCR检测ASPV的灵敏度测试结果图；

图3为本发明实施例2提供的检测方法检测ASPV的灵敏度测试结果图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

需要指出的是，在本发明的所有实施例以及应用例中，感染ASPV的田间苹果叶片于2012年6月采自河北省保定市温仁村，田间供试样品2014年7月采自河北科技师范学院园艺实验站，苹果脱毒组培苗由河北农业大学生物技术实验室提供。

此外，对于所用到的主要仪器和设备来源如下：

RNAiso Plus，RNAiso-mate，EASY Dilution购自大连宝生物工程有限公司；

2×ES TaqMasterMix购自北京康为世纪生物科技有限公司；

TransStart Probe qPCR Super Mix，TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix及pEASY-T₃>

DNA凝胶回收试剂盒和质粒小量提取试剂盒购自生工生物工程(上海)有限公司；

Bio-Rad S1000PCR仪，Bio-Rad iQ^TM5实时荧光定量PCR仪均为美国Bio-Rad公司产品；

NanoDrop 2000微量紫外分光度计为美国Thermo Scientific公司产品。

实施例1

S11：以染毒材料的cDNA为模板，以ASPV-cp-F₂和ASPV-cp-R₂为引物进行PCR扩增，所获扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳后切胶回收并用载体连接后转化到感受态细胞，挑取阳性克隆增菌培养后进行质粒提取和鉴定，得到阳性重组质粒标准品；

S12：以经过梯度稀释的所述阳性重组质粒标准品的拷贝数浓度和以该浓度的阳性重组质粒标准品为模板、以ASPV-Probe3-F和ASPV-Probe3-R为引物、以ASPV-Probe3为探针所进行的实时荧光定量PCR的Ct值构建标准曲线；

S13：以供试材料的cDNA为模板，按照与步骤2)相同的扩增条件进行实时荧光定量PCR，得到的Ct值与所述标准曲线进行比对，实现供试材料苹果茎痘病毒的定量检测。

其中，所述ASPV-cp-F₂、ASPV-cp-R₂、ASPV-Probe3-F、ASPV-Probe3-R和ASPV-Probe3的核苷酸序列分别如SEQ>

表1引物及探针序列

实施例2

S21：获取引物以及探针

根据GenBank中登录的苹果茎痘病毒(ASPV)外壳蛋白基因(cp)的核苷酸序列(登录号：NC003462、AF491930、JF946775、HM125159)，利用Primer Primer 5.0设计出扩增cp基因全序列的引物ASPV-cp-F₂/R₂，用于阳性质粒标准品序列的克隆。

利用clustalX(1.81)对该发明中克隆得到的苹果茎痘病毒cp基因序列及GenBank中已发表的苹果茎痘病毒cp基因序列进行多重比对，选择相对稳定的保守区域作为检测靶标序列，利用Primer Primer 5.0和Primer Express v3.0软件设计特异性扩增引物(ASPV-Probe3-F和ASPV-Probe3-R)和TaqMan探针(请参考表1)，探针5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。

S22：总RNA的提取及cDNA的合成

利用试剂盒提取染毒材料及供试材料的总RNA，并以该总RNA为模板利用反转录试剂盒分别合成cDNA，具体的，称取0.1g苹果叶片，利用RNAiso Plus及RNAiso-mate按照试剂盒说明书提取总RNA，再以Oligo(dT)18为引物利用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix试剂盒进行反转录获得cDNA后，进行常规PCR扩增。

S23：阳性重组质粒标准品的构建

利用引物ASPV-cp-F₂/R₂对田间染病苹果叶片的cDNA进行ASPV-cp基因的PCR扩增。扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳后，采用DNA凝胶回收试剂盒对符合目标片段大小(1444bp)的特异条带进行切胶回收，纯化后连接至pEASY-T₃载体上，并转化至E.coli>

S24：制作标准曲线

用NanoDrop 2000测定提取质粒的OD₂₆₀和OD₂₈₀值及其浓度，OD₂₆₀/OD₂₈₀比值在1.8-2.0的质粒用于制作标准曲线。根据质粒的分子量将其质量浓度换算为拷贝数浓度：copies/μL＝(ng/μL×10^-9)×(6.02×10²³)/(DNA>8拷贝/μL～1.0×10¹拷贝/μL，共8个浓度梯度，并以此为模板参照试剂盒说明书建立20μL扩增体系：

TransStart Probe qPCR Super Mix 10μL，

ASPV-Probe3-F、ASPV-Probe3-R(10pmol/μL)各0.4μL，

ASPV-Probe3(10pmol/μL)0.4μL，

模板(8个梯度)1.0Μl，

双蒸水7.8μL。

在Bio-Rad iQ^TM5实时荧光定量PCR仪上按下列反应参数进行扩增：94℃预变性30s；94℃变性5s，55℃退火15s，72℃延伸15s，共40个循环。反应结束后，利用分析软件自动生成标准曲线。

阳性重组质粒标准品的拷贝数浓度与Ct值均呈现良好的线性关系，相关系数(R²⁾达0.999，扩增效率(E)为99.3％，直线方程为y＝-3.34log(x)+44.117，其中，阳性重组质粒标准品的拷贝数浓度的对数值为x轴，反应的Ct值为y轴。

S25：供试材料中ASPV的检测

以步骤S22中供试材料的cDNA为模板，按照与步骤S24相同的扩增条件进行实时荧光定量PCR，得到的Ct值与所述标准曲线进行比对，通过电脑软件直接读出供试材料中的ASPV的检测结果。

此外，为了验证本发明提供的这种实时荧光定量PCR检测方法的检测效果，特进行以下实验分析：

特异性分析

以实施例2制备的重组质粒ASPV-cp(阳性重组质粒标准品)为阳性模板、以重组质粒ACLSV-cp、ASGV-cp为阴性模板，以双蒸水为空白对照，进行实时荧光定量PCR检测，结果如图1所示(其中，1ASPV-cp重组质粒；2ACLSV-cp重组质粒；3ASGV-cp重组质粒；4双蒸水)，结果发现，除ASPV-cp质粒反应管中检测到了呈明显上升趋势的荧光信号外，其余检测结果均为阴性，表明该方法能够特异的检测ASPV。

敏感性分析

对本发明实施例2提供的ASPV-cp阳性质粒(阳性重组质粒标准品)进行10倍倍比稀释后，分别进行常规PCR和实时荧光定量PCR检测。

请参考图2(其中，M：DNA>8copies/μL；2：1.0×107copies/μL；3：1.0×10⁶copies/μL；4：1.0×10⁵copies/μL；5：1.0×10⁴copies/μL；6：1.0×10³copies/μL；7：1.0×10²copies/μL； 8：1.0×10¹copies/μL；9：No>4拷贝/μL。请参考图3(M：DNA>8copies/μL；2：1.0×107copies/μL；3：1.0×10⁶copies/μL；4：1.0×10⁵copies/μL；5：1.0×10⁴copies/μL；6：1.0×10³copies/μL；7：1.0×10²copies/μL；8：1.0×10¹copies/μL；N：No>2拷贝/μL，表明实时荧光定量PCR的灵敏度是常规PCR的100倍。

重复性分析

选取本发明实施例2提供的阳性重组质粒标准品1.0×10⁷、1.0×10⁵、1.0×10³copies/μL>

表2实时荧光定量PCR的重复性分析

应用例

利用本发明实施例2的方法对15份田间苹果叶片进行了检测，结请参考表3，供试样品ASPV的检出率为100％，Ct值为24.15～30.79，病毒含量为9.51×10⁵～9.78×10³copies/μL_，脱毒组培苗和空白对照检测结果均为阴性，阳性对照的Ct值为22.15，病毒含 量为3.78×10⁶copies/μL，表明该方法可用于苹果样品中ASPV的检测。

表3实施例2的检测方法对15份田间苹果叶片的检测结果

样品检测结果Ct值ASPV浓度(copies/μL)1+24.159.51×10⁵2+26.222.28×10⁵3+25.783.09×10⁵4+30.799.78×10³5+25.543.65×10⁵6+26.372.06×10⁵7+28.873.67×10⁴8+26.392.03×10⁵9+29.033.29×10⁴10+26.352.09×10⁵11+28.026.60×10⁴12+27.489.57×10⁴13+29.632.17×10⁴14+26.851.48×10⁵15+28.315.40×10⁴Positive control+22.153.78×10⁶The virus-free plantlets-00CK-00

其中，在表3中，“+”为阳性“-”为阴性。

综上所述，本发明实施例根据ASPV cp基因的保守序列设计合成了特异性引物和Taqman探针，并应用ASPV-cp重组质粒作为标准品构建了标准曲线，建立了针对ASPV的Taqman探针实时荧光 定量PCR检测方法，首次实现了ASPV的定量检测，这也是国内首次关于ASPV实时荧光定量PCR检测方法的报道。

应用该方法整个检测过程只需要1h左右,结果可直接从电脑软件中得出，不需要进行PCR后处理，可有效地防止检测过程的污染和假阳性。该方法可在20μL反应体系中检测到100拷贝/μL的ASPV-cp重组质粒，灵敏度是常规PCR的100倍；且对其它潜隐性病毒重组质粒(ASGV-cp、ACLSV-cp)无特异扩增，批内重复和批间重复的变异系数均小于1％，同以往检测方法相比，具有简便、快速、准确、灵敏、稳定等优点。该方法的应用实现了ASPV检测手段由定性检测到定量检测的飞跃，将为进一步研究ASPV的侵染、增殖、分布及时序变化等规律提供可靠的技术手段，并为研发苹果病毒的多重定量PCR检测体系奠定坚实的基础。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。