一种褐潮藻种检测方法及试剂盒

摘要

本发明涉及一种褐潮藻种检测方法，包括以下步骤：1)设计并合成特异性引物AanF和AanR和探针Aan？probe，AanF的序列为AAAGCTCGTAGTTGGATTCCTGG，AanR的序列为GTGTTCAACGCAGGCTTACG，探针Aan？probe的序列为CTTGCGATGGTCTATCCT；2)选择标准品藻株，并构建重组质粒标准品；3)构建标准曲线；4)引物AanF、引物AanR、探针Aan？probe特异性验证；5)样品检测与结果分析。本发明所述的检测方法可以用于褐潮藻种的定性、定量检测，具有灵敏度高、重现性好、连续可测、操作简便、易于控制、分析时间短等优点。

说明书

技术领域

本发明涉及藻类检测技术领域，尤其涉及一种褐潮藻种检测方法及试剂 盒。

背景技术

褐潮藻种Aureococcus anophagefferens在分类学上属于原生藻菌门 (Stramenopiles)、浮生藻纲(Pelagophyceae)。自2009年开始，我国秦 皇岛近岸海域出现了由Aureococcus anophagefferens(简写为A. anophagefferens)引发的有害赤潮——褐潮，给北戴河滨海旅游业和水产 养殖造成极为严重的影响。对于我国而言，褐潮是一种新型生态灾害，其原 因种A.anophagefferens的藻细胞不仅太小(约3μm)，而且没有明显的形 态特征，采用在显微镜下观察藻细胞形态的传统方法进行物种鉴定非常困 难，急需找到一种快速有效的定性定量检测技术，为监测褐潮的发生和发展 过程、及时预防褐潮暴发所带来的危害提供技术支持。目前分子探针技术是 对藻类种群动态进行直接监测的主要发展方向，而大量、连续甚至实时跟踪 监测目标藻类种群动态变化过程，是开展有害褐潮暴发机理、预防褐潮暴发 研究的基础。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，鉴于传统方法鉴定褐潮藻种比较困难， 提供一种定性、定量的褐潮藻种检测方法，具有灵敏度高、重现性好、连续 可测、操作简便、易于控制、分析时间短等优点。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一种褐潮藻种检测方法，包括以下步骤：

1)设计并合成特异引物和探针:

采用序列比对软件(如ClustalW)比对A.anophagefferens和GenBank 中与其亲缘关系较近的藻种(如Aureoumbra lagunensis和Pelagococcus  subviridis)的18S rDNA序列，设计A.anophagefferens的特异性引物 AanF、AanR和探针Aan probe，进行合成；

所述引物AanF具有如SEQ ID NO.1所示的序列： AAAGCTCGTAGTTGGATTCCTGG；

所述引物AanR具有如SEQ ID NO.2所示的序列：GTGTTCAACGCAGGCTTACG；

所述探针Aan probe具有如SEQ ID NO.3所示的序列： CTTGCGATGGTCTATCCT；

2)构建重组质粒标准品：

a)选择标准品藻株：由于目前我国褐潮暴发藻种还未实现室内纯化培 养，因此选择A.anophagefferens(CCMP1784)藻株作为标准品藻株，所述标 准品藻株购自NCMA(National Center for Marine Algae and Microbiota)， 经检测与我国褐潮原因种具高度同源性(同源性可以达到99.7％)，接种， 采用(f/2+Si)培养液培养，获得标准品藻株培养液；

b)利用显微镜检测标准品藻株培养液的藻细胞数，利用0.45μm滤膜过 滤，收集藻细胞，将带有藻细胞的滤膜-20℃保存；

c)将步骤b)所述滤膜上的藻细胞提取DNA，并利用引物SSU-F(如SEQ ID  NO.4所示)和SSU-R(如SEQ ID NO.5所示)PCR扩增后测序验证，当测序结 果与预期序列一致后，即为藻细胞标准品DNA提取液；

d)以步骤c)得到的藻细胞标准品DNA提取液为模板，利用引物AanF和 引物AanR进行PCR扩增，得到PCR产物，并纯化，得到纯化产物；将纯化 后的PCR产物采用TaKaRa pMD^TM18-T Vector Cloning Kit进行连接转化克 隆，提取质粒并测序，比对序列，与预期序列一致说明结果正确，得到的质 粒即为重组质粒标准品。

3)构建标准曲线：

a)选取步骤2)获得的重组质粒标准品，利用Nanodrop 2000测定其质量 浓度，根据质粒浓度与拷贝数换算公式：拷贝数浓度＝(质量浓度×10^-9×6.02 ×10²³)/(碱基对数×660)，计算获得质粒拷贝数浓度(copies/μL)，将 其按照10倍梯度系列稀释；

取至少5个梯度的重组质粒标准品，每个浓度样品一式三份，作为荧光 定量PCR扩增的模板，利用引物AanF、AanR和探针Aan probe进行荧光定 量PCR扩增，得到Ct值；将质粒拷贝数的对数值(以10为底)与相应Ct 值进行线性回归分析，最终获得重组质粒标准品的Ct-质粒拷贝数标准曲线；

b)选取步骤2)得到的已知A.anophagefferens藻细胞数量的藻细胞标 准品DNA提取液，进行10倍系列梯度稀释，取至少5个梯度的藻细胞标准 品DNA提取液模板作为模板，每个浓度样品一式三份，用AanF、AanR和探 针Aan probe进行荧光定量PCR扩增，得到Ct值；将藻细胞数的对数值(以 10为底)与相应Ct值进行线性回归分析，得到藻细胞标准品DNA提取液的 Ct-藻细胞数标准曲线；

c)通过步骤a)中得到的重组质粒标准曲线和步骤b)中得到的藻细胞标 准曲线，以质粒拷贝数为横坐标、藻细胞数对数(以10为底)为纵坐标， 得到质粒拷贝数-藻细胞数标准曲线；

4)引物和探针特异性验证：分别提取中肋骨条藻、三角褐指藻、海洋小 球藻和海洋原甲藻中的DNA，分别以双蒸水、中肋骨条藻DNA提取液、三角 褐指藻DNA提取液、海洋小球藻DNA提取液和海洋原甲藻DNA提取液为阴性 对照，以引物AanF、引物AanR和探针Aan Probe进行荧光定量PCR扩增， 当检测不到扩增曲线时，说明所用引物和探针不能用于这些样品的检测，进 一步说明所述引物和探针为褐潮藻种的特异性引物和探针

5)检测样品和结果分析：

a)提取待测样品DNA：采集表层水样，记录待测样品的体积，每个站位 取至少3个平行样，立即用0.45μm滤膜过滤，藻细胞被滤膜收集，带有藻 细胞的滤膜-20℃保存；提取滤膜上的藻细胞中的DNA，利用琼脂糖凝胶电泳 检测，分装，保存，作为未知待测样品DNA提取液；

b)步骤a)得到的未知待测DNA提取液为模板，利用引物AanF、AanR和 探针Aan probe进行荧光定量PCR扩增，得到Ct值，根据步骤3)得到的Ct- 质粒拷贝数标准曲线、Ct-藻细胞数标准曲线、质粒拷贝数-藻细胞数标准曲 线，计算待测样品中的藻细胞数，除以待测样品的体积，得到藻细胞密度。

本发明所述的DNA提取方法可以采用常规的DNA提取方法，也可以采用 市售的试剂盒进行提取，如本发明所述的实施例中利用土壤DNA提取试剂盒 UltraClean^TM Soil DNA Isolation Kit(Mo Bio Laboratories,Inc.,Solana  Beach,California,USA)提取DNA。

本发明所述的藻细胞标准品DNA提取液和重组质粒标准品可以在-80℃ 下长期保存(一年以内)，保存时间超过1年后，为了保证检测结果的精确 性，藻细胞标准品DNA提取液和重组质粒标准品建议重新提取 A.anophagefferens的DNA和构建重组质粒标准品。

一种利用上述褐潮藻种检测方法制备的褐潮藻种检测试剂盒，包括：重 组质粒标准品、藻细胞标准品DNA提取液、引物AanF、引物AanR、探针Aan  probe、阴性对照、荧光定量PCR扩增试剂。

所述荧光定量PCR扩增试剂包括：2×PROBE FAST qPCR Master Mix  Universal、ROX校正染料、PCR级无菌水，所述荧光定量PCR扩增试剂均为 市售。

所述阴性对照为双蒸水、中肋骨条藻DNA提取液、三角褐指藻DNA提取 液、海洋小球藻DNA提取液和海洋原甲藻DNA提取液。

本发明的有益效果是：

本发明所述的褐潮藻种检测方法是一种针对褐潮藻种的快速、有效的检 测技术，既可以用于定性检测，也可以用于定量检测；为监测褐潮的发生和 发展过程、及时预防褐潮暴发所带来的危害提供技术支持；通过分子探针技 术对藻类种群动态进行直接监测，可以大量、连续甚至实时跟踪监测目标藻 类种群动态变化过程，是开展有害褐潮暴发机理、预防褐潮暴发研究的基础。 本发明所述的褐潮藻种检测方法具有灵敏度高、重现性好、连续可测、操作 简便、易于控制、分析时间短等优点，本发明所述的特异性引物和探针具有 良好的特异性。

另外，本发明所述的褐潮藻种检测方法还具备如下优势： A.anophagefferens的藻细胞标准品DNA提取液和制作好的 A.anophagefferens重组质粒标准品保存在-80℃下，可以长期保存。因此不 需要每次测定样品都需要提取藻细胞DNA和构建重组质粒标准品，只需要利 用已构建好的重组质粒标准品和藻细胞标准品DNA提取液构建标准曲线，生 成质粒拷贝数-藻细胞数标准曲线，使检测步骤更为简洁，检测时间短。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。进一步根据本发 明所述的褐潮藻种检测方法，将本发明所述的特异性引物AanF、AanR和探 针Aan probe试剂、藻细胞标准品DNA提取液、重组质粒标准品等试剂组装 成试剂盒，以检测试剂盒的形式提供，方便、快捷的用于褐潮藻种的定性、 定量检测。

附图说明

图1为倒置显微镜下的A.anophagefferens藻细胞；

图2为A.anophagefferens重组质粒标准品扩增图；

图3为A.anophagefferens重组质粒标准品Ct-质粒拷贝数标准曲线；

图4为A.anophagefferens藻细胞标准品DNA提取液扩增图；

图5为A.anophagefferens藻细胞标准品DNA提取液的Ct-藻细胞数标 准曲线；

图6为双蒸水、中肋骨条藻DNA提取液、三角褐指藻DNA提取液、海洋 小球藻DNA提取液、海洋原甲藻DNA提取液的荧光定量PCR结果。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本 发明，并非用于限定本发明的范围。

一种褐潮藻种检测方法，包括以下步骤：

1)设计并合成特异引物和探针:

采用ClustalW软件比对A.anophagefferens和GenBank中与其亲缘关 系较近的藻种(如Aureoumbra lagunensis和Pelagococcus subviridis) 的18S rDNA序列，设计A.anophagefferens的特异性引物AanF、AanR和 Taqman探针Aan probe，进行合成：

引物AanF具有如SEQ ID NO.1所示的序列：AAAGCTCGTAGTTGGATTCCTGG；

引物AanR具有如SEQ ID NO.2所示的序列：GTGTTCAACGCAGGCTTACG；

探针Aan probe具有如SEQ ID NO.3所示的序列：CTTGCGATGGTCTATCCT。

2)构建重组质粒标准品：

a)选择标准品藻株：由于目前我国褐潮暴发藻种还未实现室内纯化培 养，因此选择A.anophagefferens(CCMP1784)藻株作为标准品藻株，所述标 准品藻株购自NCMA(National Center for Marine Algae and Microbiota)， 经检测与我国褐潮原因种具高度同源性(同源性为99.7％)，采用(f/2+Si) 培养液培养，获得标准品藻株培养液；

标准品藻株的培养方法如下：

配制(f/2+S i)培养液：

配制钠盐溶液：将7.5g NaNO₃、0.5g NaH₂PO₄·2H₂O、2.0g Na₂SiO₃·9H₂O 一起置于烧杯中，加入50mL双蒸水充分溶解，定容至100mL,混匀；

配制微量元素溶液：将3.15g FeCl₃·6H₂O和4.36gNa₂EDTA混合，一起 置于烧杯中，溶于900mL双蒸水，再依次加入1mL 9.8g/L CuSO₄·5H₂O溶液、 1mL 22g/L ZnSO₄·7H₂O溶液、1mL 10g/L CoCl₂·6H₂O溶液、1mL 180g/L MnCl₂·4H₂O溶液、1mL 6.3g/L NaMoO₄·6H₂O溶液，混合均匀，双蒸水定容至1000mL， 混合均匀，即微量元素溶液；

配制维生素培养液：取100mg维生素B₁和0.5mg维生素B₁₂注射性瓶装 药剂混合到一起，溶于1000mL双蒸水中，即维生素培养液；

将上述钠盐溶液、微量元素溶液、维生素培养液均按照1/1000比例加 入灭菌海水中用于A.anophagefferens的培养；

取8个灭过菌的250mL三角瓶，加入盐度为(30±1)psu的100mL灭 菌海水，按照1/1000比例加入(f/2-Si)培养液，从处于指数生长期的 A.anophagefferens的同一培养瓶中，取20mL培养液分别接种到这8个三角 瓶中，无菌透气封口膜封口，水温(20±1)℃、光强(3000±100)lx和光 暗周期12h:12h条件下培养。

b)计算藻细胞培养液藻细胞数：

培养10天后，将8个三角瓶中的藻细胞培养液同时倒入灭过菌的1000mL 三角瓶中，轻轻混匀后，取3份5mL于4000rpm下离心10min(三个平行)， 每个离心管中移走4mL上清液，剩余1mL(相当于浓缩5倍)，轻轻混匀后， 取1μL直接在倒置显微镜40倍放大倍数下进行藻细胞计数，每份样品3个 平行。在倒置显微镜下观察的藻细胞如图1所示；

显微镜下计数结果为藻细胞密度平均75cells/μL，因此原培养液的藻 细胞密度为75cells/μL÷5倍＝15cells/μL＝1.5×10⁷cells/L。另外取3 份200mL(0.2L)样品分别用0.45μm滤膜过滤，滤膜上收集了藻细胞，将 带有藻细胞的滤膜-20℃保存，用于样品总DNA的提取，因此每个滤膜所包 含的藻细胞数量约为1.5×10⁷cells/L×0.2L＝3.0×10⁶个。

c)提取标准品藻株DNA：

利用土壤DNA提取试剂盒UltraClean^TM Soil DNA IsolationKit(Mo Bio  Laboratories,Inc.,Solana Beach,California,USA)提取收集的标准品 藻株DNA，获得A.anophagefferens的藻细胞标准品DNA提取液；以该藻细 胞标准品DNA提取液为模板，采用真核生物通用引物SSU-F和SSU-R进行PCR 扩增，

引物SSU-F的序列如SEQI D NO.4所示，为ACC TGG TTG ATC CTG CCA GT；

引物SSU-R的序列如SEQI D NO.5所示，为TCA CCT ACG GAA ACC TTGT；

PCR反应体系和反应条件如下所示：

PCR反应体系：

10×buffer 2μl dNTP(2.5mM) 1.6μl 引物SSU-F(10μM) 0.3μL 引物SSU-R(10μM) 0.3μL Takara Taq酶(5U/μL) 0.2μL 模板 1μL 双蒸水 补充至20μL

PCR反应条件：

将PCR产物纯化后进行测序，测序结果如SEQ ID NO.6所示，获得的序 列长度为1717bp，经BLAST验证与GenBank登录号HQ710572.1的 A.anophagefferens的18S rRNA序列同源性为100％，与登录号JQ420078.1、 AF117778.1、AF117776.1、AF119119.1、AF117777.1、AF118443.1、 AF117779.1、JQ420083.1、JQ420077.1、JQ420082.1、JQ420084.1、 JQ420080.1、JQ420079.1和JQ420081.1的A.anophagefferens的18S rRNA 序列同源性为99％，与登录号U40257.1的A.anophagefferens的18S rRNA 序列同源性为98％，表明上述所提取的藻细胞标准品DNA提取液即为 A.anophagefferens的标准品DNA，且根据步骤b)测得的藻细胞数量为3.0 ×10⁶个。

d)将A.anophagefferens的藻细胞标准品DNA提取液采用所设计的引物 AanF和AanR进行PCR扩增，PCR反应体系和反应条件如下所示：

PCR反应体系：

10×buffer 2μl dNTP(2.5mM) 1.6μl 引物AanF(10μM) 0.3μL 引物AanR(10μM) 0.3μL Takara Taq酶(5U/μL) 0.2μL 模板 1μL 双蒸水 补充至20μL

PCR反应条件：

将得到的PCR产物进行纯化，然后将纯化后的PCR产物采用TaKaRa  pMD^TM18-T Vector Cloning Kit进行连接、转化、获得单克隆，提取质粒并 纯化，然后采用引物AanF和AanR进行PCR扩增，1％琼脂糖凝胶电泳检验， 取通过验证的阳性重组质粒进行测序，测序结果如SEQ ID NO.7所示，得到 的序列长度为168bp，经BLAST验证与GenBank登录号JQ420084.1、 JQ420083.1、JQ420082.1、JQ420078.1、JQ420077.1、HQ710572.1、 AF117778.1、AF117776.1、AF117779.1、AF119119.1、AF117777.1和 AF118443.1的A.anophagefferens的18S rRNA同源性都为100％，表明目标 DNA序列已经成功连接，所得质粒即为A.anophagefferens的重组质粒标准 品。

3)构建标准曲线：

a)构建重组质粒标准品Ct-质粒拷贝数标准曲线

将步骤2)获得的重组质粒标准品，用Nanodrop 2000测定其质量浓度， 根据质粒浓度与拷贝数换算公式：拷贝数浓度＝(质量浓度×10^-9×6.02× 10²³)/(碱基对数×660)，计算获得重组质粒标准品的拷贝数浓度 (cop ies/μL)，将其按照10倍梯度系列稀释。取至少5个梯度的重组质 粒标准品作为模板，每个浓度样品一式三份，用AanF、AanR和探针Aan probe 进行荧光定量PCR扩增。具体过程如下：

测定质粒质量浓度后，计算得到重组质粒标准品的拷贝数浓度为3.79 ×10¹⁰copies/μL，将其按照10倍梯度系列稀释，选取3.79×10⁹copies/ μL、3.79×10⁸copies/μL、3.79×10⁷copies/μL、3.79×10⁶copies/μL、 3.79×10⁵copies/μL、3.79×10⁴copies/μL、3.79×10³copies/μL共七个 质粒浓度梯度进行荧光定量PCR扩增，荧光定量PCR扩增反应条件和反应体 系如下所示，扩增效果见图2，从图2可以看出：相邻标准品Ct值之差几乎 相同(约为3)，说明各梯度标准品扩增正常；然后将质粒拷贝数的对数值(以 10为底)与相应Ct值进行线性回归分析，最终生成重组质粒标准品的Ct- 质粒拷贝数标准曲线，如图3所示，重组质粒标准品Ct-质粒拷贝数标准曲 线方程为：Ct＝42.341-3.241×l g(质粒copies)(即方程1)，其中R²＝0.999， 扩增效率Eff％＝103.474％，在一般正常扩增效率(90％-110％)范围内，说明 本实验结果可靠。

荧光定量PCR反应体系：

荧光定量PCR反应条件：

b)构建标准品DNA提取液的Ct-藻细胞数标准曲线：

将步骤2)所获得的A.anophagefferens的藻细胞标准品DNA提取液进行 10倍系列梯度稀释，该藻细胞标准品DNA提取液所对应的 A.anophagefferens藻细胞数量为3.0×10⁶cells，取至少5个梯度的藻细胞 标准品DNA提取液作为模板，每个浓度样品一式三份，用引物AanF、引物 AanR和探针Aan probe进行荧光定量PCR扩增，扩增体系和扩增条件同步 骤3)的a)。具体过程如下：选取3.0×10⁶cells、3.0×10⁵cells、3.0× 10⁴cells、3.0×10³cells、3.0×10²cells和3.0×10¹cells共六个藻细胞数 量梯度进行荧光定量PCR扩增，扩增效果见图4所示，从图4可以看出，相 邻标准品Ct值之差几乎相同(约为3)，说明各梯度标准品扩增正常。然后 将藻细胞数的对数值(以10为底)与相应Ct值进行线性回归分析，最终生 成标准品DNA提取液的Ct-藻细胞数标准曲线，如图5所示，标准曲线方程 为：Ct＝38.631-3.200×lg(藻细胞copies)(即为方程2)，其中，R²＝0.998， 扩增效率为Eff％＝105.334％，在一般正常扩增效率(90％-110％)范围内，扩 增正常。

c)通过步骤a)中得到的重组质粒标准品的Ct-质粒拷贝数标准曲线和步 骤b)中得到的藻细胞标准品DNA提取液的Ct-藻细胞数标准曲线可以获得重 组质粒标准品的质粒拷贝数与藻细胞数的换算关系：根据方程1和方程2获 得藻细胞数与质粒拷贝数之间的关系为lg(藻细胞copies)＝[3.241×lg(质 粒copi es)-3.710]/3.200(即方程3)。

4)引物AanF、引物AanR和探针Aan probe特异性验证

分别提取中肋骨条藻(Skeletonema costatum,硅藻)、三角褐指藻 (Phaeodactylum tricornutum,硅藻)、海洋小球藻(Chlorella sp.,绿 藻)和海洋原甲藻(Prorocentrum micans,甲藻)中的DNA，分别以双蒸水 和中肋骨条藻DNA提取液、三角褐指藻DNA提取液、海洋小球藻DNA提取液 和海洋原甲藻DNA提取液作为阴性对照，以引物AanF、引物AanR和探针Aan  Probe进行荧光定量PCR扩增，荧光定量PCR的反应条件和反应体系同步骤 3)，荧光定量PCR结果如图6所示，发现没有检测到双蒸水和该四种对照藻 DNA提取液的扩增曲线，进一步证实了所设计的AanF、AanR和Aan probe 是A.anophagefferens藻株的特异性引物和探针。说明所设计的引物AanF、 引物AanR和探针Aan probe具有特异性。

5)样品检测与结果分析：

在实际应用过程中，首先采集研究区域内环境水体样品，记录样品的体 积，立即用0.45μm滤膜过滤，滤膜-20℃保存。将附在滤膜上的藻细胞提 取DNA，经过纯化后作为待测样品DNA模板与本发明所构建的重组质粒标准 品、藻细胞标准品DNA同时采用本发明所设计的引物和探针进行荧光定量 PCR扩增，获得重组质粒标准品的Ct-质粒拷贝数标准曲线、藻细胞标准品 DNA提取液的Ct-藻细胞数标准曲线、重组质粒标准品的质粒拷贝数-藻细胞 数标准曲线、以及环境样品的Ct值，最后通过质粒拷贝数与藻细胞数间的 关系计算得到环境样品中的藻细胞数量，然后将藻细胞数量除以所收集待测 样品的体积，最终获得环境中的藻细胞密度。为了提高检测结果的精确度， 每次使用过程中可以重新制定标准曲线。具体样品检测的操作步骤如下：

a)提取环境样品DNA：采集表层水样(0-5cm)，每个站位取三个平行样， 每个样品采集500mL，立即用0.45μm滤膜过滤，滤膜-20℃保存；采用土壤 DNA提取试剂盒UltraClean^TM Soil DNA IsolationKit(Mo Bio Laborator ies, Inc.,Solana Beach,California,USA)提取所得滤膜上的藻细胞的DNA， 得到环境样品总DNA提取液，利用琼脂糖凝胶电泳检测后，分装，-80℃超 低温冰箱保存，作为未知待测样品DNA提取液；

b)以步骤a)得到的待测样品DNA提取液为模板，利用引物AanF、AanR 和探针Aan probe进行荧光定量PCR扩增，反应体系和反应条件参见步骤 3)，根据步骤4)得到的重组质粒标准品的Ct-质粒拷贝数标准曲线、藻细胞 标准品DNA提取液的Ct-藻细胞数标准曲线、重组质粒标准品的质粒拷贝数- 藻细胞数标准曲线，计算环境样品中的藻细胞数，将藻细胞数除以待测样品 的体积，得到藻细胞密度。

实施例1

A.anophagefferens纯藻株样品对所构建定量PCR检测方法的验证：

取3个灭过菌的3000mL三角瓶，加入1200mL灭菌海水，按照1/1000 比例加入(f/2-Si)培养液，从处于指数生长期A.anophagefferens的同一 培养瓶中，分别取300mL接种到这3个三角瓶中，培养9天后，显微镜下计 数，计数方法同具体上述步骤2)的步骤b)，结果为3.2×10⁶cells/L。用 0.45μm滤膜过滤，分别获得藻细胞数分别为3.2×10⁶cells、3.2×10³cells 和3.2×10²cells的样品，并提取这些样品中的DNA，经纯化后,以纯化后的 DNA为模板，用引物AanF、AanR和探针Aan probe进行荧光定量PCR扩增， 荧光定量PCR反应体系和反应条件见上述步骤3),通过上述步骤4)得到的重 组质粒标准品的Ct-质粒拷贝数标准曲线、藻细胞标准品DNA提取液的Ct- 藻细胞数标准曲线、重组质粒标准品的质粒拷贝数-藻细胞数标准曲线，计 算样品中的藻细胞数，结果如表1所示：

表1定量PCR方法对A.anophagefferens纯种藻细胞的检测结果

结果表明荧光定量PCR方法对A.anophagefferens纯种藻细胞的检测 结果与显微镜计数结果(表1中实际数量)没有明显差异(p>0.05)，因此 本发明所构建的定量PCR检测方法对A.anophagefferens纯藻株的检测结 果有效。

褐潮暴发时，A.anophagefferens藻细胞密度最高可达10⁶cells/mL， 该方法可以检测的细胞数量为10¹-10⁶cells之间，当水体中藻细胞浓度过低 或过高时，可以通过增大或减小采样体积，从而使得样品的藻细胞数量在检 测范围之内，实现对环境样品中A.anophagefferens的藻细胞进行精确检 测的目的。

实施例2利用本发明所述方法检测环境样品

首先，样品采集：根据2009年-2012年秦皇岛近岸海域褐潮暴发主要区 域，设置采样站位Q(119°′25.568′’E，39°′45.056’N)，采样时间2013 年4月-9月，采样频率每月1次，月初采集。采样期间水温在9.2-26.8℃， 盐度30-32psu。

其次，环境样品总DNA的提取：在Q站位收集表层水样(0-5cm)，取 500mL，立即用0.45μm滤膜过滤，滤膜(带有藻细胞)-20℃保存，每次三 个平行；采用土壤DNA提取试剂盒UltraClean^TM SoilDNA IsolationKit(Mo  Bio Laboratories,Inc.,Solana Beach,California,USA)提取所得滤膜 上藻细胞的总DNA，-80℃超低温冰箱中保存待测；将得到DNA采用琼脂糖电 泳检测，从而获得环境样品的DNA模板，作为未知待测样品DNA提取液。

最后，以获得的未知样品待测DNA提取液为模板，用引物AanF、引物 AanR和探针Aan probe进行荧光定量PCR扩增，荧光定量PCR反应体系和 反应条件见上述步骤3),保证检测结果的准确性，利用前面所述制备好的 A.anophagefferens藻细胞重组质粒标准品、藻细胞标准品DNA提取液和未 知待测样品DNA提取液同时进行荧光定量PCR，获得重组质粒标准品的Ct- 质粒拷贝数标准曲线、藻细胞标准品DNA提取液的Ct-藻细胞数标准曲线、 重组质粒标准品的质粒拷贝数-藻细胞数标准曲线，根据标准曲线方程，计 算各环境样品中的藻细胞数，以采样体积为基数，获得环境样品的藻细胞密 度。结果如表2所示：

表2秦皇岛环境样品4月-9月A.anophagefferens藻细胞检测结果

实施例3环境样品检测结果有效性的验证：

为了进一步验证本发明所述的A.anophagefferens藻细胞荧光定量PCR 检测技术检测环境样品的有效性，采用高通量测序技术对这些环境样品进行 同步检测。

高通量测序技术(pyrosequencing)，堪称二代测序技术，不仅可以检 测各种已知微型生物，而且还能发现新物种，从而了解一个环境中的所有微 型生物的全貌，甚至含量甚微的物种。目前该项技术已经广泛应用于检测各 种环境样品中的微型生物群落组成，如海水、土壤、废水处理系统等。

实施例2所获得的秦皇岛Q站位2013年4月-9月水样DNA提取液为模 板，采用真核生物通用引物euk516F(具有SEQ ID NO.8所示序列 GGAGGGCAAGTCTGGT)和euk1055R(具有SEQ ID NO.9所示序列 ARCGGCCATGCACCACC)进行PCR扩增，为了保证后续数据分析的准确性及可 靠性，首先尽可能使用低循环数扩增，其次保证每个样品扩增的循环数统一。 选取3个样品进行预实验，确保在最低的循环数中绝大多数的样品能够扩增 出浓度合适的产物。

PCR反应体系：

5×FastPfu buffer 4μl dNTPs(2.5mM) 2μl 引物euk516F(5μM) 0.4μL 引物euk1055R(5μM) 0.4μL FastPfu聚合酶 0.4μl 模板 2μL 双蒸水 补充至20μL

PCR反应条件：

将PCR产物进行荧光定量和均一化后，采用Roche 454FLX Titanium  sequencer(Roche 454Life Sciences,Branford,CT,USA)上机进行高通 量测序。然后对测序结果进行数据分析：根据barcode标签统计有效序列； 对有效序列进行修剪，去除低质量序列，丢弃长度短于200bp、模糊碱基数 大于0、序列平均质量低于25的序列，最后获得高质量的优化序列用于后续 分析；通过归类操作(cluster)，将序列按照彼此的相似性分归为许多分 类单元(Operational taxonomic units,OTUs)，在此基础上进行每个样 品的OTUs统计；在进行分类学分析时，首先将每一条优质序列都与SILVA (SSU111版)的SSUrRNA数据库进行比对，找出其最相近且可信度达80％以上 的种属信息。为了获得每个OTUs的分类学信息，将97％相似水平下每一个 OTUs中的所有序列进行一致性分析，找出同一OTUs中的不同序列的最近亲 缘关系的种属信息作为该OTUs的种属信息。由于检测过程中使用的是真核 生物通用引物，一些真菌、微型浮游动物也会被检测出来，因此在进行分类 信息整理过程中，将这些真核生物DNA序列去除后再重新整理浮游藻类的种 类组成。

高通量测序技术检测结果发现4月、5月、6月、7月、8月和9月分别 检测到藻类物种24种、42种、44种、48种、41种和55种，其中褐潮藻株 A.anophagefferens仅在5月、6月和7月被检测到：5月有5个OTUs，占 浮游藻类种群的0.05％；6月有6个OTUs，占浮游藻类种群的0.12％；7月有 78个OTUs，占浮游藻类种群的1.05％。另外4月、8月和9月检测到的前15 种优势藻种类见表3所示：

表3秦皇岛Q站位4月、8月和9月优势藻种类组成的检测结果

比较采用本发明所设计的引物AanF、AanR和探针Aan probe对Q站位 水体DNA样本的检测结果(表2)和采用高通量测序技术的检测结果表明：

1)对褐潮藻种A.anophagefferens的检测结果一致：秦皇岛Q站位在 5月、6月和7月出现A.anophagefferens，藻细胞密度为7月>6月>5月；

2)尽管水体样品在4月、8月和9月有多种藻类(表3)，但在进行荧 光定量PCR过程中都没有检测到扩增曲线，进一步证实引物AanF、AanR和 探针Aan probe具有专一性，是A.anophagefferens的特异引物和探针，环 境样品中其它优势藻类对检测结果没有干扰。

本发明所述的A.anophagefferens的藻细胞标准品DNA提取液和制作好 的A.anophagefferens重组质粒标准品保存在-80℃下，可以长期保存。因 此不需要每次测定样品都需要提取藻细胞DNA和构建质粒，只需要用现成的 藻细胞DNA提取液和重组质粒标准品构建标准曲线，获得质粒拷贝数-藻细 胞密度的关系方程。但是为了保证检测结果的精确性，DNA模板和质粒保存 超过1年后，建议重新提取A.anophagefferens的DNA和构建重组质粒标准 品。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明 的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发 明的保护范围之内。