一种简便有效的悬浮细胞扩培操作方法

摘要

本发明提供了一种悬浮细胞扩培操作方法，其步骤如下：1)复苏一支293F细胞，加入到37℃水浴预热的培养基中，放入CO2培养箱培养；2)进行第一次扩培：取20ml细胞悬浮液，向细胞悬浮液中倒入80g培养基，旋紧培养瓶盖，放入CO2体积浓度为8％、37℃、转速140rpm的二氧化碳培养箱中培养；3)进行第二次扩培：将新的2L培养瓶旋开瓶盖后放入天平上清零，倒入400g的培养基，再清零天平，继续倒入100g悬浮细胞液，旋紧培养瓶盖，细胞放入CO2体积浓度为8％、37℃、转速140rpm的二氧化碳培养箱中培养；4)进行第三次扩培。本发明的方法简便有效。

说明书

技术领域

本发明属于细胞工程领域，具体涉及一种悬浮细胞扩培操作方法。

背景技术

悬浮培养是游离的单细胞或细胞团按照一定的细胞密度悬浮在液体培养基中进行培养的方法。为使细胞不断增殖，培养一定时间必须进行扩培。扩培的方法是取培养瓶中一小部分悬浮细胞，按一定的稀释比例转移到成分相同的新鲜培养基中，需要较准确的控制悬浮细胞和培养基的量。整个悬浮细胞扩培操作必须满足无菌操作要求。在实验室摇瓶研究阶段，细胞扩培操作中悬浮细胞和培养基的无菌转移一般采用移液器和已灭菌的量筒(或其他已灭菌的带刻度的容器)。当移液体积较小(如200mL以下)时，一般采用移液器进行液体无菌转移。由于移液管的体积限制，当移液体积较大时，用移液器操作会显得特别繁琐，需要移液多次才能完成一个细胞扩培过程，操作效率低，在多次移液之后，容易忘记移液次数，导致移液体积不准。因此，当移液体积较大(如200mL以上)时，一般用已灭菌的量筒(或其他已灭菌的带刻度的容器)进行液体无菌转移。当移液体积较大，用已灭菌的量筒(或其他已灭菌的带刻度的容器)进行液体无菌转移时，需要提前对量筒(或其他可灭菌的带刻度的容器)进行灭菌，增加实验量和实验成本。在操作过程中，需要在悬浮细胞、培养液、无菌量筒(或其他已灭菌的带刻度的容器)和培养瓶之间进行液体的反复转移，增加染菌风险。无菌操作是细胞培养最基本也是最重要的要求，超净工作台或生物安全柜虽可控制空气洁净度到百级，但并不是无菌环境。减少液体反复转移的次数可显著缩短无菌液体与带菌空气的接触时间，减少染菌几率。

发明内容

本发明的目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种简便、有效、安全的悬浮细胞扩培操作方法。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种简便有效的悬浮细胞扩培操作方法，其步骤如下：

1)复苏一支293F细胞，加入到37℃水浴预热的培养基中，放入CO₂培养箱培养；

2)进行第一次扩培：取20ml细胞悬浮液，向细胞悬浮液中倒入80g培养基，旋紧培养瓶盖，放入CO₂体积浓度为8％、37℃、转速140rpm的二氧化碳培养箱中培养；

3)进行第二次扩培：将新的2L培养瓶旋开瓶盖后放入天平上清零，倒入400g的培养基，再清零天平，继续倒入100g悬浮细胞液，旋紧培养瓶盖，细胞放入CO₂体积浓度为8％、37℃、转速140rpm的二氧化碳培养箱中培养；

4)进行第三次扩培：将新的3L培养瓶旋开瓶盖后放入天平上清零，倒入2000g的培养基，再清零天平，继续倒入500g悬浮细胞液，旋紧培养瓶盖混匀，再将一个新的3L培养瓶旋开瓶盖后放入天平上清零，将混匀的细胞倒入1250g到新的3L培养瓶，旋紧瓶盖，两瓶细胞一起放入CO₂体积浓度为8％、37℃、转速140rpm的二氧化碳培养箱中培养。

根据本发明的方法，优选地，所述步骤1)中，CO₂培养箱的培养条件为：CO₂体积浓度为8％、37℃、摇床转速140rpm。

根据本发明的方法，优选地，所述步骤1)中，细胞培养3天。

根据本发明的方法，优选地，所述培养基为FreeStyle^TM 293 Expression Medium，Gibco12338。

与现有的悬浮细胞扩培操作方法相比，本发明的方法具有以下优势：

(1)为控制实验成本，质量称取设备的精度和最大量程都不必太高，精度在0.1g，最大量程在3000g即可，这样的设备市场售价在100元左右，能很好实现设备成本的控制；

(2)质量称取设备放入超净工作台或生物安全柜里专用，能更好的避免污染风险；

(3)不需要对量取器材进行灭菌处理，当天可完成细胞扩培操作；传统操作中需要提前一天对器材进行灭菌处理，烘干后第二天进行实验操作；相比传统操作方法，本发明的方法使实验时间缩短一倍；

(4)传统操作方法中在对量取器材进行灭菌处理过程和烘干过程中，需要消耗电力和人力资源，从长远统计来看，本发明可以显著减少能源消耗和提高生产率。

附图说明

图1是悬浮细胞扩培的活细胞密度。

图2是悬浮细胞扩培的细胞活率。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的应用范围。

37℃水浴预热培养基(FreeStyle^TM 293 Expression Medium，Gibco 12338)，从液氮中取出293F细胞(BIOWIT C0004)，手握解冻，与预热的10ml培养基混匀，1000rpm离心5分钟，弃上清，10ml预热的培养基重悬，取样计算活细胞密度和细胞活率，在无菌摇瓶中将活细胞密度稀释到5×10⁵cells/ml，放入CO₂培养箱培养，CO₂培养箱条件设置为：8％CO₂(体积浓度)、37℃、摇床转速140rpm。细胞培养3天后，取样计算活细胞密度和细胞活率。将细胞悬浮液用移液器精确分为两份，每份20ml。其中一份为实验组，用天平称量的方法进行细胞扩培；另一份为对照组，用体积量取的方法进行细胞扩培。实验组和对照组都为3天扩培一次，扩增倍数都为5倍。每次扩培前测定活细胞密度和细胞活率，扩培3次后，量筒量取培养体系的体积。

实验组：第一次扩培时，将原培养瓶旋开瓶盖后放入天平上清零，倒入80g的培养基(与以上培养基相同)，旋紧培养瓶盖，细胞放入8％CO₂(体积浓度)、37℃、转速140rpm的二氧化碳培养箱中培养。第二次扩培时，将新的2L培养瓶旋开瓶盖后放入天平上清零，倒入400g的培养基(与以上培养基相同)，再清零天平，继续倒入100g悬浮细胞液，旋紧培养瓶盖，细胞放入8％CO₂(体积浓度)、37℃、转速140rpm的二氧化碳培养箱中培养。第三次扩培时，将新的3L培养瓶旋开瓶盖后放入天平上清零，倒入2000g的培养基(与以上培养基相同)，再清零天平，继续倒入500g悬浮细胞液，旋紧培养瓶盖混匀，再将一个新的3L培养瓶旋开瓶盖后放入天平上清零，将混匀的细胞倒入1250g到新的3L培养瓶，旋紧瓶盖，两瓶细胞一起放入8％CO₂(体积浓度)、37℃、转速140rpm的二氧化碳培养箱中培养。

对照组采用常规体积量取法进行扩培。

实验结果：

1.每次细胞扩培时，取样计算活细胞密度，数据见图1，发现用天平称量进行悬浮细胞扩培与用量筒量取进行悬浮细胞扩培对活细胞密度的影响一致，两者没有差异。

2.每次细胞扩培时，取样计算细胞活率，数据见图2，发现用天平称量进行悬浮细胞扩培与用量筒量取进行悬浮细胞扩培对细胞活率的影响一致，两者没有差异。

3.培养结束后，用量筒对培养体系进行定量，最终体积相差很小，几乎没有区别，数据见下表。

方法培养结束(即按各自方法扩增到2.5L)后，最终体积天平称量约2480ml量筒量取约2490ml

可见，采用本发明的悬浮细胞扩培操作方法，对细胞增殖没有影响，对最终体积也没有产生影响，并且操作简便有效，能够明显缩短实验时间，减少能源消耗，提高生产率。