用作免疫测定的标准化对照的人因子XIII

摘要

本发明提供了用于对测定，如免疫测定中检测的信号的量进行标准化的组合物和方法。该组合物和方法可用于改善免疫测定的精确度，如检测对象是否感染逆转录病毒如HIV的免疫测定。

说明书

相关专利申请的交叉引用

本申请要求2012年6月22日提交的美国临时专利申请第61/663,293号的 优先权，其通过引用全文纳入本文。

发明领域

本发明涉及免疫诊断的领域。

技术背景

检测生物样品中HIV抗原和针对HIV抗原的抗体的免疫测定可用于测定 对象是否感染或已经暴露于HIV。现有的测定检测HIV抗原和针对HIV-1的 抗体，包括组O和M，以及针对HIV-2的抗体。然而，检测生物样品中分析 物的量的测定受到可能产生欺骗性结果的误差的影响。存在多种可能产生误差 的因素。这些因素包括试剂浓度的变化(例如，由于试剂稳定性或设备吸量误 差所致)、设备处理步骤(例如，试剂分散体积、洗涤步骤后不完全抽吸导致 试剂稀释、孵育计时)、设备条件(检测器温度)和样品基质影响(例如，血 清与血浆)。

美国专利号7,141,362中描述了一种用于对测定中分析的样品的量或体积 进行检验的方法。该方法检测了样品中人血凝集因子XIII(hFXIII)亚基a和 b的量以确定样品的体积，并且也可用于将血浆和血清与其他类型的生物样品 区分开。在使用固体支持物上固定的针对hFXIII亚基的抗体的免疫测定中检测 样品中hFXIII的量。

另外，对样品如校准物、对照或患者试样(血清或血浆)的重复分析可能 产生不一致的结果，其导致高变异系数(相对标准偏差％)。在一些情况中， 变化可高达50％或更大并且可能足够对于一些重复样产生归为阳性的响应但 对其他重复样则呈阴性。这种变异性在诸如HIV检测的关键测定中是不可接受 的。本发明解决了在分析中导致高变异系数的误差的问题。

发明内容

本发明描述了一种可用作生物测定中的标准化标准和/或内部对照的标准 化因子。在一些实施方式中，使所述标准化标准与测定中包括的固体支持物连 接。在一个方面，描述了一种用于对检测生物样品中分析物的免疫测定中的结 果进行标准化的方法。通过与特异性结合单一分析物的结合成员结合来检测分 析物。通过在测试中包含标准化因子，可以校正由样品处理中的变化或与各种 样品类型相关的生物基质影响导致的误差。在一些实施方式中，标准化因子并 不与样品中的分析物特异性结合。

因此，在一些实施方式中，生物样品与结合样品中一种或多种分析物的一 种或多种结合成员一起孵育，并且检测其中是否有任何分析物与结合成员结 合。例如，如果分析物是抗原，则相应的结合成员可以是特异性结合该抗原的 抗体。同样，如果分析物是抗体，则相应的结合成员可以是特异性结合该抗体 的抗原。因此，单个靶分析物特异性结合相应的结合成员，并且一组分析物可 结合至相应的一组结合成员。然后鉴定与给定的结合成员结合的分析物。这种 鉴定的一个方式是使用固定于固体支持物的结合成员，并对于各结合成员使用 不同的固体支持物。例如，在单个固体支持物上仅固定一种结合成员的分子， 并且可通过结合成员本身以外的方式互相区分不同结合成员的固体支持物。可 通过使用与固体支持物相关的区分参数来互相区分固体支持物，带有任何一种 结合成员的所有支持物可通过区分参数与带有任何其他结合成员的所有支持 物区分。因此，可使用区分参数来将固体支持物分成可互相区分的亚群。

可通过使用结合试剂来实现对来自样品的分析物与结合成员之间的免疫 结合的检测。例如，可使用对标准化因子具有结合亲和性的结合试剂和对样品 中各分析物具有结合亲和性的结合试剂来检测结合。在某些实施方式中，结合 试剂与其上固定有结合成员的固体支持物在促进结合试剂与标准化因子和分 析物结合的条件下孵育。在一些实施方式中，结合试剂与标签偶联。在一些实 施方式中，该标签是生物素。在一些实施方式中，该标签是可检测标签，如荧 光部分。

在结合试剂与固体支持物孵育之后，回收固体支持物以从未结合的结合试 剂分离其上结合有分析物和/或标准化因子的支持物。在结合试剂与生物素偶联 的实施方式中，固体支持物可与和可检测标签耦合的链霉亲和素孵育。在一些 实施方式中，该可检测标签是荧光标签，如藻红蛋白(PE)。然后检测与固体 支持物结合的标签的量。例如，可通过能够测量由标签发出的荧光信号的量的 任何方法来检测标签。

检测到的标签的量可与区分参数相关联以得到代表样品中各单独分析物 的水平或量的值，以及代表与固体支持物结合的标准化因子的水平或量的值。 这允许代表样品中各单独分析物的水平的值对代表标准化因子的水平的值进 行标准化。该标准化允许待校正的样品处理中的变化，从而改善测定的性能。 该标准化也允许待校正的例如来自可检测标签的信号强度的变化，其中信号强 度的变化是由于样品的来源(即，生物基质影响)。

在一个实施方式中，标准化因子是人因子XIII(hFXIII)。在一个实施方 式中，该方法使用与固体支持物耦合的人因子XIII作为生物测定中的标准化因 子和/或内部对照。因此，在某些实施方式中，固体支持物的一个亚群具有固定 其上的hFXIII。在一些实施方式中，固体支持物是珠或磁珠。在一个实施方式 中，hFXIII固定于珠。在一些实施方式中，hFXIII固定于磁珠。在一个实施方 式中，固定于珠或磁珠的hFXIII被称为信号标准化珠(SNB)。可使用抗-hFXIII 抗体检测与固体支持物结合的hFXIII。如本文所述，该抗-hFXIII抗体一般不 存在于从对象中分离的生物样品中，但是在样品处理期间与对分析物具有特异 性的其他结合试剂一起加入，以提供检测固定于固体支持物的hFXIII的方式。

在一些实施方式中，固体支持物的一个亚群含有固定于其上的针对hFXIII 的抗体，其用于检测生物样品中存在的hFXIII(即，亚基a和/或b)的结合， 如美国专利号7,141,362所述，其通过引用全文纳入本文。因此，在一些实施 方式中，抗-hFXIII抗体固定于包含珠或磁珠的固体支持物上。在一个实施方 式中，具有固定于其上的抗-hFXIII抗体的珠或磁珠被称作血清检验珠(SVB)。 SVB允许确认测定中存在血清样品。

在另一个方面，提供了一种用于对测定结果进行标准化的方法，如用于检 测生物样品中分析物的多重免疫测定。在某些实施方式中，免疫测定是用于检 测一组分析物，其水平表示生物样品中人免疫缺陷病毒(HIV)的感染。通过 与各自单独结合单独的分析物的相应的一套或一组结合成员结合来检测该组 分析物。样品中的一个或多个分析物与一个或多个结合成员的结合表明该生物 样品来自感染HIV的对象。通过包含标准化因子，可对由样品处理中的变化或 生物基质影响的变化导致的误差进行校正。

在一些实施方式中，该组分析物的成员是HIV抗原和/或结合至HIV-1和 HIV-2的抗体。在某些实施方式中，该组分析物的成员包括：

(i)p24抗原，

(ii)针对HIV 1型的抗体，

(iii)针对HIV 2型的抗体，

(iv)针对HIV 1型，组O的抗体，和

(v)针对HIV 1，组M的抗体。

在一些实施方式中，结合成员与上述的一组HIV分析物中的一员特异性 结合。在一些实施方式中，结合成员是抗-p24抗体、HIV-1包膜蛋白gp-160、 SPOH或AFR。

免疫测定也可包含其上固定有针对人因子XIII的抗体的固体支持物。如 上述，针对人因子XIII的抗体与生物样品中存在的hFXIII结合，并且因此用 作检验样品含有血清或血浆的测定，有助于避免假阴性结果。因此，在一个实 施方式中，结合成员是针对人因子XIII的抗体。

也可使用生物素化的偶联物来检测一组分析物的结合，其水平表示HIV 感染。在一些实施方式中，生物素化的偶联物与HIV抗原、针对HIV-1的抗 体和针对HIV-2的抗体结合。在一些实施方式中，生物素化的偶联物与标准化 因子结合。在一些实施方式中，标准化因子是hFXIII。

在一些实施方式中，生物素化的偶联物选自39-PFN-BgG、SV2V、AFR、 针对p24抗原的抗体和针对人因子XIII的抗体。

在一些实施方式中，固体支持物是珠或磁珠。

在一些实施方式中，固体支持物与四甲基尸胺若丹明(TMRC)耦合。

本发明还涉及包含固定于固体支持物上的标准化因子和一组结合成员(其 各自固定于固体支持物上)的试剂盒。该组结合成员包括任何上述各种结合成 员，并且固体支持物还含有经选择的区分参数，使得带有该组的任一结合成员 的所有支持物可通过这些参数与带有组中其他结合成员的所有支持物区分。

在一些实施方式中，试剂盒包括用于确定对象是否感染HIV或用于确定 对象中感染阶段的一组结合成员。在一些实施方式中，所述对象是人。因此， 在一些实施方式中，试剂盒包括固定于固体支持物上的标准化因子和多种结合 成员，固定于固体支持物上的各结合成员，所述多种结合成员包括：(i)抗-p24 抗体，(ii)HIV-1包膜蛋白gp-160，(ii)HIV-2SPOH和(iv)HIV-O AFR。 在一些实施方式中，固体支持物包括经选择的区分参数，使得带有多种结合成 员中的任一结合成员的所有支持物可与带有多种结合成员的其他结合成员的 所有支持物区分。

在一些实施方式中，试剂盒包括不与来自生物样品的分析物结合的标准化 因子。在一个实施方式中，标准化因子是hFXIII。该试剂盒还可包括固定于固 体支持物上的针对人因子XIII的抗体。

在某些实施方式中，该试剂盒还提供了固定于固体支持物上的四甲基尸胺 若丹明(TMRC)。在一些实施方式中，固体支持物是珠或磁珠。

定义

“结合试剂”是对另一种化合物具有结合亲和性的化合物。例如，结合试 剂可以高亲和性与固定于固体支持物上的标准化因子结合。结合试剂也可与生 物样品中的分析物结合。结合试剂可与标准化因子或靶分析物发生免疫反应。 例如，结合试剂可以是特异性结合生物样品中的标准化因子或抗原的抗体，或 者结合试剂可以是特异性结合生物样品中的抗体的抗原。该结合试剂可与允许 结合试剂被检测到的标签偶联。在一些实施方式中，结合试剂并不固定于固体 支持物上。

本文使用的术语“结合成员”指特异性结合至靶分析物的分子或试剂。结 合成员可以与靶分析物发生免疫反应。例如，结合成员可以是特异性结合生物 样品中的抗体的抗原，或者结合成员可以是特异性结合生物样品中的抗原的抗 体。结合成员可固定于固体支持物上，包括但不限于固定于珠或磁珠上。

“标准化因子”是可用于对测定结果进行标准化的分子。标准化因子通常 不与样品中感兴趣的分析物反应或以高亲和性与之结合。

本文所用术语“标签”或“可检测部分”指可通过光谱、光化学、生物化 学、免疫化学、化学或其它物理手段检测的组合物。标签的示例是32P、荧光 染料、高电子密度试剂、酶(例如，ELISA中常用)、生物素、地高辛以及可 被检测的半抗原和蛋白质或其他实体(例如通过将放射性标签整合至肽中或用 于检测与肽特异性反应的抗体)。该标签可整合至例如抗体和/或其它蛋白质的 任何位置。可以采用本领域已知的用于使抗体或蛋白质(肽)与标签偶联的任 何方法，例如，使用如下文献中所述的方法：Hermanson，Bioconjugate Techniques (《生物结合技术》)1996，学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)， 圣迭戈。或者，使用高亲和性相互作用的方法可以获得相同的效果，其中一对 结合伴侣(binding partner)中的一个能够结合另一个，例如生物素和链霉亲和 素。本文所述本发明的蛋白质可直接用同位素、发色团、发光团、色原体标记， 或者间接标记，例如通过生物素，该生物素随后可被复合体中的链霉亲和素(包 含荧光、放射性或可被直接检测的其他部分)结合。因此，生物素化的抗体被 认为是本文使用的“经标记的抗体”。

本文所用术语“抗体”指由一个或多个免疫球蛋白基因编码的多肽，或其 特异性结合并识别分析物(抗原)的片段。识别的免疫球蛋白轻链被归类为K 或λ。免疫球蛋白重链分为γ、μ、α、δ或ε，它们进而分别定义免疫球蛋白类 型IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。

免疫球蛋白G(IgG抗体)的结构单元的一个示例是四聚体。各这类四聚 体由相同的两对多肽链组成，每对包含一条“轻”链(约25kD)和一条“重” 链(约50-70kD)。每条链的N末端确定约100至110个或更多个氨基酸构成 的可变区，所述可变区主要负责抗原识别。术语“轻链可变区”(VL)和“重 链可变区”(VH)分别指这些轻链和重链。

抗体以完整的免疫球蛋白形式或用不同肽酶对完整的免疫球蛋白进行消 化产生的具有良好表征的片段形式存在。因此，例如，胃蛋白酶在铰链区中的 二硫键连接附近消化抗体，产生F(ab′)₂，Fab的二聚体，其本身是由二硫键连 接于V_H-C_Hl的轻链。可在温和条件下还原F(ab′)₂二聚体以打断铰链区中的二 硫连接，从而将F(ab′)₂二聚体转化为两个Fab′单体。Fab′单体实质上是具有部 分铰链区的Fab(参见Paul编，Fundamental Immunology(《基础免疫学》)， 第三版，雷文出版社(Raven Press)，纽约，1993)。虽然根据对完整抗体的 消化定义了多种抗体片段，但是本领域技术人员应理解，这类片段也可用化学 方法或重组DNA方法从头合成。因此，本文中所用术语“抗体”也包括通过 全抗体修饰或用重组DNA方法从头合成所产生的抗体片段，如单链Fv。

涉及蛋白质、肽或抗原时，描述与抗体结合的术语“特异性(或选择性)” 或“特异性(或选择性)与……发生免疫反应”或“具有对……的结合特异性” 指能在蛋白质和其它生物物质的异质群体存在的情况下确定是否存在蛋白质、 肽或抗原的结合反应。因此，在给定的免疫测定条件下，特定的抗体结合样品 中的特定蛋白质而不以显著量结合样品中存在的其他蛋白质。在这样的条件下 与抗体的特异性结合可能需要就抗体对特定蛋白质的特异性来选出的抗体。例 如，可以选择针对某一蛋白质产生的抗体以得到不与其他蛋白质而与该蛋白质 发生特异性免疫反应的抗体。可利用各种免疫测定形式来选择与特定蛋白质发 生特异性免疫反应的抗体。例如，常规使用固相ELISA免疫测定、Western印 迹或免疫组化法来选择与某一蛋白质发生特异性免疫反应的单克隆抗体。参 见，Harlow和Lane，Antibodies，A Laboratory Manual(《抗体，实验室手册》)， 冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Publications)，纽约(1988)，来获得关于 可用于确定特定免疫反应性的免疫测定形式和条件的描述。通常，特异性或选 择性反应会是背景信号或噪音的至少2倍，更通常而言是背景的多于10至100 倍。

用于本发明的某些实施方式的抗体是抗人抗体，尤其是那些经标记的抗人 抗体。这些抗人抗体中优选针对人IgG的那些抗体、针对人IgM的那些抗体和 针对人IgA的那些抗体。

术语“生物样品”包括从生物体中得到的多种样品类型。该术语包括体液 诸如血液、唾液、血清、血浆、尿液和生物来源的其它液体样品，固体组织样 品诸如活检样品或组织培养物或来源于其中的细胞及其子代。如本文所述，生 物样品一般是含有可检测量的感兴趣分析物，例如抗原、抗体、蛋白质、肽、 核酸或小分子的体液或组织。该术语包含获得后经任何方式处理的样品，如试 剂处理、溶解、沉降或对某些组分的富集。该术语包括临床样品，也包括细胞 培养物中的细胞、细胞上清液、细胞裂解物、血清、血浆、其他生物液体和组 织样品。优选的生物样品是血液样品、血浆样品和血清样品。

本文所用术语“固体支持物”指可固定试剂(如抗体或抗原)的固体惰性 表面或主体，所述试剂在本文所述任何结合反应中具有反应活性。本文所用术 语“固定”指分子基础的偶联，其在本文所述试验的任意步骤期间、在任何施 加的条件下都不会移开或去耦合。这类固定可通过共价键、离子键、亲和型键 或任何其他化学键实现。

本文所用术语“颗粒”指固体主体，通常任何形状或表面结构的线性尺寸 为微米级(即小于100微米)。本文所用术语“珠”指形状为球形或近球形的 颗粒，通常在组合物中多聚化。

“多重”测定是在单个样品中同时检测超过一种分析物的分析方法。

本文所用术语“分析物”或“靶分析物”表示生物样品中存在的分子并且 指示对象(如人对象)中生物学状况存在与否。术语生物学状况可以不受限制 地使用，并且可包括正常状况和异常状况。例如，生物学状况可以是病理状况， 如疾病、感染、癌症或自身免疫疾病。分析物也可指示疾病或感染的阶段或发 展，如在疾病治疗期间或感染的不同阶段期间。分析物也可指示对生物学状况 的诊断或预后。

术语“经标记的结合部分”是指与标签偶联或耦合的分子或试剂。标签可 以是可检测标签，如荧光团，或可以是间接标记的标签，例如生物素或链霉亲 和素标记，或用可用于产生可检测信号的酶如碱性磷酸酶(AP)或马辣根过氧 化物酶(HRP)标记。经标记的结合部分可与结合试剂结合，或者当标签是亲 和素、链霉亲和素或等同物时，与生物素化的偶联物结合。

本文所用术语“区分参数”是指与连接或固定至固体支持物的结合成员无 关的固体支持物的特征。因此，区分参数允许其上固定有不同结合成员的固体 支持物可通过除了结合成员本身以外的方式互相区分。

术语“生物基质”是指含有感兴趣的分析物的样品的来源。例如，生物基 质可以是生物流体，例如但不限于，血清、血浆、全血、尿、唾液、淋巴液或 脑脊液。术语“生物基质影响”指当样品衍生自不同的生物基质时，测定信号 的变化。

附图说明

图1说明了使用人因子XIII包被的珠作为对照并且在检测HIV p24抗原 的代表性HIV测定中产生经标准化的信号。进行了12个重复样，并且如实施 例1所述对数据进行标准化。

图2说明了使用人因子XIII包被的珠作为对照并且在检测针对HIV-1的 人多克隆抗体的代表性多重HIV对照测定中产生经标准化的信号。进行了5 个重复样，并且如实施例2所述对数据进行标准化。

图3说明了使用人因子XIII包被的珠作为对照并且在检测针对HIV-2的 人多克隆抗体的代表性多重HIV对照测定中产生经标准化的信号。进行了5 个重复样，并且如实施例2所述对数据进行标准化。

图4说明了使用人因子XIII包被的珠作为对照并且在检测针对HIV-O的 兔单克隆抗体的代表性多重HIV对照测定中产生经标准化的信号。进行了5 个重复样，并且如实施例2所述对数据进行标准化。

图5说明了在检测针对HIV-O的抗体的代表性实验中反应容器中剩余的 生物素偶联物的各种量所降低的测定信号，如实施例5所述。

图6说明了在补充有相同浓度的HIV p24抗原的各种生物基质中的来自相 同供体的血清和血浆样品中检测到的HIV p24抗原信号和人因子XIII信号的相 对响应的曲线图。

图7说明了来自图6所示的相同实验的经标准化的信号的曲线图，显示了 不同生物基质中所有样品的较低变化。

选择的实施方式的描述

本发明提供了用于在进行生物测定时校正样品处理和/或生物基质影响中 的变化的组合物和方法。该组合物包含与固体支持物耦合的标准化因子。在一 些实施方式中，标准化因子可以是能够与固体支持物连接且不与生物样品中靶 分析物特异性结合的任何合适的分子。标准化因子可与固体支持物共价或非共 价连接。在一些实施方式中，固体支持物是珠或磁珠。因此，在一些实施方式 中，标准化因子与珠耦合，并且标准化珠以与来自样品的分析物特异性结合的 珠相同的方式与测定中的后续检测步骤期间使用的试剂相互作用。与标准化因 子耦合的固体支持物可用于检验校正样品处理和用于测定信号标准化。信号标 准化提供了对于生物样品、对照和校准物的提高的测定精确度，并且改善了在 测定中使用的试剂的使用期间的信号稳定性。

在一个实施方式中，标准化因子是人因子XIII(hFXIII)。在一个实施方 式中，该方法使用与固体支持物偶联的人因子XIII作为生物测定中的标准化因 子和/或内部对照。在一个方面，提供了与hFXIII耦合的固体支持物用作标准 化标准和/或内部对照。

因此，在一些实施方式中，可在免疫测定中使用hFXIII-耦合的固体支持 物来校正样品处理中的变化。在一个实施方式中，hFXIII-耦合的固体支持物允 许对检测到的信号的量进行标准化以提高测定精确度。可通过例如标签来产生 信号。在一个实施方式中，hFXIII-耦合的固体支持物允许对检测到的标签的量 进行标准化以校正所述方法中所用试剂的储存期间可检测标签的量的损失。

在一些实施方式中，hFXIII-耦合的固体支持物允许检测无效测定，例如， 通过当测定信号落入预定极限以下时进行检测来进行所述检测。例如，可使用 hFXIII对各样品的信号进行标准化，并且将经标准化的信号与期望的对照值相 比较。如果经标准化的样品信号太低，则测定结果可能会由于基质影响或其他 处理误差而降低，因而结果可被标记为无效。

可在用于分析生物样品是否存在一种或多种分析物的方法中使用与固体 支持物耦合的标准化因子，这些分析物的水平指示对象中的疾病状态。在一些 实施方式中，一种或多种分析物包括一组分析物。本发明的分析物包括在来自 对象(包括但不限于人对象)的生物样品中存在的抗原和抗体。在一些实施方 式中，样品中分析物的存在、缺失或水平指示对象患有疾病或其它病理状况， 或处于发展疾病或其他病理状况的风险中。例如，在一些实施方式中，分析物 表示对象被病毒感染，如逆转录病毒。因此，在一些实施方式中，分析物表示 对象被人免疫缺陷病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)或单纯疱疹病毒(HSV) 感染。在一个实施方式中，分析物表示患者被HIV感染。指示人对象的HIV 感染的分析物包括HIV抗原，如p24抗原、针对HIV-1(组M、O、N和P) 的抗体，和针对HIV-2(包括多种亚型)的抗体。

在该方法的一些实施方式中，生物样品与其上固定有针对组中各分析 物的结合成员的多种固体支持物孵育。本发明的结合成员包括能够特异性 结合至生物样品中分析物的抗原和抗体。例如，能够特异性结合至指示人 对象的HIV感染的分析物的结合成员包括抗-p24抗体、用于检测HIV-1的 gp160蛋白、用于检测HIV-1/M的39PEN、用于检测HIV-1/O的AFR、用 于检测HIV-2的SPOH、用于检测HIV-2的gp36肽和用于检测HIV-2的 SV2V。39PFN和AFR分别是模拟HIV-1组M和O的免疫优势区的肽。 SPOH和SV2V是模拟HIV-2的免疫优势区的肽。在下表(表1)中提供了 所述肽的序列。

表1：结合HIV抗体的肽的序列。

在一些实施方式中，结合成员与连接至固体支持物的另一种蛋白质偶联， 如BSA。在一个实施方式中，结合成员是抗-hFXIII抗体。因此，在一个实施 方式中，生物样品与其上固定有抗-hFXIII抗体的多种固体支持物孵育。在促 进各分析物(如果样品中存在)与固定于固体支持物上的结合成员的结合的条 件下进行孵育。促进分析物与固体支持物上结合成员的结合的条件包括在缓冲 的溶液中，如在约25-37℃的温度下在pH为约7.0至约7.4的磷酸盐缓冲液中 孵育样品持续约10至60分钟。在一些实施方式中，结合构成免疫结合。

免疫结合发生的确定由本发明的某些实施方式中的一个或多个步骤组成， 且这可涉及从未结合的抗原或抗体中分离或回收抗原-抗体复合物。实现这种 分离或回收的一个方式是通过使用固体支持物。因此，本发明还提供了其上固 定有针对一组分析物中各分析物的结合成员的多种固体支持物。在一些实施方 式中，多种固体支持物被分为亚群，其特征在于各亚群包括仅与分析物组的一 种分析物结合的结合成员。在一些实施方式中，如本文所述，固体支持物的各 亚群可通过区分参数与固体支持物的其他亚群区分。

在某些实施方式中，提供了其上固定有人因子XIII的固体支持物亚群。 在一些实施方式中，hFXIII固定于珠或磁珠。在一个实施方式中，固定于珠或 磁珠的hFXIII被称为信号标准化珠(SNB)。

在某些实施方式中，固体支持物的一个亚群具有固定其上的结合hFXIII 的抗体。在一些实施方式中，抗-hFXIII抗体固定于珠或磁珠。在一个实施方 式中，固定于珠或磁珠的抗-hFXIII抗体被称作血清检验珠(SVB)。如本文 所述，SVB可用于检验添加到测定中的生物样品的量，以及样品是否来自血清、 血浆或一些其他生物样品。

I.固体支持物

本发明中可使用任何类型的固体支持物。固体支持物可包括能够结合蛋白 质、暴露于样品并且分离成离散群的任何表面。所述固体支持物可以是试验容 器的壁或底面、或者插入试验容器中的浸渍条或其他器具、或者置于试验容器 内部或悬浮于试验容器中的颗粒。在许多实施方式中颗粒(尤其是珠)特别有 用，包括微观尺寸(即微粒)和由聚合物材料形成的珠。用作微粒的聚合物是 相对于生物样品的组分和固定在微粒表面的结合成员以外的试验试剂具有化 学惰性的那些。优选的微粒材料(尤其当试验中使用荧光标签时)是具有最低 自荧光的那些，在样品以及试验中使用的任何缓冲液、溶剂、载剂、稀释剂或 悬浮剂中是固体且不溶，此外还可固定试验试剂。合适的聚合物的示例是聚苯 乙烯、聚酯、聚醚、聚烯烃、聚环氧烷、聚酰胺、聚氨酯、多糖、纤维素和聚 异戊二烯。在许多聚合物中交联用于赋予微粒结构完整性和刚性。微粒的尺寸 范围可以变化。在一些实施方式中，微粒的直径范围是约0.3微米至约100微 米，在另一些实施方式中为约0.5微米至约40微米，在又一些实施方式中为约 2微米至约10微米。

在固体支持物是珠的实施方式中，生物样品可在反应容器中与每个样品约 0.1μg至约2.0μg(微克)的珠孵育。例如，样品可与约0.1至约2.0μg、约 0.3至约1.7μg、约0.5至约1.5μg、约0.7至约1.2μg，或约0.8至约1.0μg 的珠孵育。在一些实施方式中，与样品孵育的珠的量足够在约50μL的反应体 积中产生约0.002微克/微升(μg/μL)至约0.04μg/μL的浓度。例如，浓度的 范围可以是约0.002至约0.040μg/μL、约0.004至约0.035μg/μL、约0.008至 约0.030μg/μL、约0.010至约0.025μg/μL、约0.010至约0.020μg/μL、或约 0.012至约0.018μg/μL。较高的珠浓度减少了计算珠的最小数目(例如，50-100 珠结果)以确定给定反应容器的中值信号所需的时间。在一些实施方式中，每 个反应样品计算200个珠结果。

在一些实施方式中，该方法还包括从上述的孵育样品中回收固体支持物。 可通过使用由磁性反应材料(即任何对磁场反应的材料)构成或包含磁性反应 材料的颗粒以方便颗粒的回收和清洗。随后，在颗粒和样品孵育的反应容器上 施加磁场，使得颗粒粘附于容器壁上并通过倾滗或吸除除去液体，从而实现孵 育后或清洗步骤后固相与液相的分离。本发明中感兴趣的磁性反应材料包括顺 磁性材料、铁磁性材料、亚铁磁性材料和变磁性材料。示例包括例如铁、镍和 钴，以及金属氧化物，如Fe₃O₄、BaFe₁₂O₁₉、CoO、NiO、Mn₂O₃、Cr₂O₃和CoMnP。

作为试验一部分的施加和移除磁场的方法和仪器是本领域技术人员熟知 的且已在文献中报道。文献报道的示例是Forrest等，美国专利号4,141,687(泰 克尼康仪器公司(Technicon Instruments Corporation)，1979年2月27日)； Ithakissios，美国专利号4,115,534(3M公司(Minnesota Mining and  Manufacturing Company)，1978年9月19日)；Vlieger，A.M.，等，Ahalytical  Biochemistry 205：1-7(1992)；Dudley，Journal of Clinical Immunoassay 14：77-82 (1991)；以及Smart，Journal of Clinical Immunoassay 15：246-251(1992)。

磁性反应材料可分散在聚合物中，作为聚合物表面上的涂层或作为表面上 的两种或多种涂层之一施用，或者以能够将材料固定于颗粒的任何其他方式整 合或附连。颗粒中磁性反应材料的含量不是关键，且可在较宽范围内变动。然 而，含量会影响微粒的密度，含量和微粒尺寸都可以影响将微粒保持在悬浮状 态的容易程度，该悬浮状态能够使液相和固相间达到最大接触并方便流式细胞 术的进行。微粒中过量的磁性反应材料会产生足够高水平从而干扰试验结果的 自发荧光。因此，在一些实施方式中，磁性反应材料的浓度足够低以最小化材 料发出的任何自发荧光。基于这些考虑，根据本发明，颗粒中的磁性反应材料 是例如重量百分比为约0.05％至约75％(相对于颗粒整体)。在一些实施方式 中，重量百分比范围是约1％至约50％，例如约2％至约25％，例如约2％至约 8％。

在一些实施方式中，结合成员与固体支持物共价耦合。在一些实施方式中， 结合成员是针对hFXIII的抗体，其与固体支持物共价连接。在一些实施方式中， 结合成员是利用碳二亚胺介导的耦合化学反应与固体支持物共价耦合的蛋白 质。将蛋白质共价耦合至固体支持物的其他方法也是本领域熟知的。例如，蛋 白质可与苯乙烯珠上的反应性羧基耦合。初始的羧基珠可通过化学反应转化为 氨基或活化的碳-碳双键基团。固体支持物也可含有反应性氯烷基基团或相似 的烷基化试剂，其能够直接与蛋白质氨基残基反应。

在其他实施方式中，结合成员与固体支持物非共价耦合。例如，蛋白质可 通过静电相互作用吸附到固体支持物的表面上。在一些实施方式中，可用链霉 亲和素包被固体支持物以利用链霉亲和素对生物素的强亲合力来捕获生物素 化的蛋白质、抗原和抗体。可利用常规的碳二亚胺活化化学反应使链霉亲和素 共价耦合至固体支持物。其他结合蛋白质如蛋白G或A可用于将抗体固定于 珠上。

在一些实施方式中，标准化因子与固体支持物共价耦合。在一些实施方式 中，标准化因子是hFXIII，其与固体支持物共价连接。例如，可使用碳二亚胺 介导的耦合化学反应将hFXIII与珠共价连接。在一个实施方式中，hFXIII耦 合至独特的珠区域。在一些实施方式中，hFXIII通过例如吸收来非共价耦合至 固体支持物。在一些实施方式中，hFXIII间接耦合至固体支持物，例如，通过 首先将针对hFXIII的抗体共价耦合至固体支持物，然后将固体支持物与hFXIII 孵育以产生免疫耦合的hFXIII固体支持物。

在一些实施方式中，该测定包括与抗-人因子XIII抗体耦合的固体支持物。 在一个实施方式中，抗-人因子XIII抗体与珠耦合。在一个实施方式中，珠耦 合至小鼠抗人FXIII单克隆抗体。该实施方式被称为血清检验珠(SVB)。SVB 可用于检测样品中的天然人因子XIII以检验样品添加。与抗-人因子XIII单克 隆抗体耦合的珠的示例在美国专利号7,141,362中描述，其全文通过引用纳入 本文。

在从生物样品中回收固体支持物后，例如，通过采用上述的方法，使固体 支持物与对于各分析物具有结合亲和性的试剂以及对hFXIII具有结合亲和性 的试剂孵育。在一些实施方式中，该试剂是生物素化的偶联物。在一些实施方 式中，生物素化的偶联物是生物素化的蛋白质、肽或抗体。生物素化的偶联物 的示例包括：用于检测HIV-1/M抗体的39-PFN-BgG-生物素；用于检测HIV-2 抗体的SV2V-生物素；用于检测HIV-1/O抗体的AFR-生物素；和用于检测p24 抗原的生物素化的抗-p24抗体。在一些实施方式中，生物素化的偶联物是与人 FXIII结合的生物素化的抗体。

生物素化肽的方法为本领域熟知。例如，用于生物素化的最常用和通用方 法是通过使具有N-羟基琥珀酰亚胺酯基团的生物素衍生物的反应。这种化学 官能团允许生物素和蛋白质氨基基团之间在非常温和的反应条件(室温，中性 至高pH)下通常在较短时间(约1小时)内完全形成稳定的共价酰胺键。生 物素衍生物是市售可得的并且生物素和蛋白质之间的距离和连接类型可以根 据特定靶生物素偶联物的需要进行调整。含有活性酰肼基团的生物素衍生物也 可用于将生物素连接到蛋白质的可及羰基部分。如果存在对在其含糖结构域附 近直接标记蛋白质的需求，则经常使用这些化合物。使用携带N-乙基马来酰 亚胺基团或相似的不饱和碳-碳键的生物素衍生物来靶向蛋白质硫醇并且提供 蛋白质的位点特异性标记的另一个示例。其他更为专用的生物素衍生物携带化 学官能团(如芳基叠氮化物)，利用紫外光可使其光化学活化。一旦经光化学 活化，这些瞬时的生物素物质会被允许与各种类型的蛋白质残基反应。参见， 例如，Richard P.Haugland，《荧光探针和研究化学品》(Handbook of Fluorescent  Probes and Research Chemicals)，第4章，生物素和半抗原，第63-80页，第 6版，1996，其通过引用纳入本文。

在促进生物素化的偶联物与hFXIII和分析物的结合的条件下孵育生物素 化的偶联物。合适的条件包括含NaCl的磷酸盐缓冲液、蛋白质稳定剂、封闭 物和防腐剂。pH的范围可以是约7.0-7.4。

在一些实施方式中，在固体支持物与生物素化的偶联物孵育之后，通过洗 涤去除过量的偶联物并且使固体支持物与经标记的结合部分孵育。在一些实施 方式中，经标记的结合部分选自链霉亲和素和亲和素。在一些实施方式中，该 标签是荧光团，其中许多在文献中报道并因此为本领域技术人员已知，并且其 多数易于从生物技术工业的市场供应商处购得。荧光团的文献来源包括 Cardullo等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：8790-8794(1988)；Dexter，D.L.，J.of  Chemical Physics 21：836-850(1953)；Hochstrasser等，Biophysical Chemistry 45： 133-141(1992)；Selvin，P.，Methods in Enzymology 246：300-334(1995)；Steinberg， I.Ann.Rev.Biochem.，40：83-114(1971)；Stryer，L. Ann.Rev.Biochem.，47： 819-846(1978)；Wang等，Tetrahedron Letters 31：6493-6496(1990)；以及Wang 等，Anal.Chem.67：1197-1203(1995)。

以下是可用作标签的荧光团示例：

4-乙酰胺基-4’-异硫氰酸根合芪-2，2’二磺酸

吖啶

吖啶异硫氰酸酯

5-(2’-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)

4-氨基-N-[3-乙烯基磺酰基)苯基]萘酰亚胺-3，5二磺酸酯

N-(4-苯胺基-1-萘基)马来酰亚胺

邻氨基苯甲酰胺(anthranilamide)

BODIPY

亮黄(Brilliant Yellow)

香豆素

7-氨基-4-甲基香豆素(AMC，香豆素120)

7-氨基-4-三氟甲基香豆素(香豆素151)

花青染料

四氯四溴荧光素(cyanosine)

4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)

5’，5”-二溴连苯三酚-磺酞(溴邻苯三酚红)

7-二乙基氨基-3-(4′-异硫氰酸根合苯基)-4-甲基香豆素

二亚乙基三胺五乙酸酯

4，4′-二异硫氰根合二氢-芪-2，2′-二磺酸

4，4′-二异硫氰酸根合芪-2，2′-二磺酸

5-[二甲基氨基]萘-1-磺酰氯(DNS，丹酰氯)

4-(4’-二甲基氨基苯基偶氮)苯甲酸(DABCYL)

4-二甲基氨基苯基偶氮苯基-4’-异硫氰酸酯(DABITC)

曙红

曙红异硫氰酸酯

赤藓红B

赤藓红异硫氰酸酯

溴乙非啶(ethidium)

5-羧基荧光素(FAM)

5-(4，6-二氯三嗪-2-基)氨基荧光素(DTAF)

2’，7’-二甲氧基-4’5’-二氯-6-羧基荧光素(JOE)

荧光素

荧光素异硫氰酸酯

荧光胺

IR144

IR1446

孔雀石绿异硫氰酸酯

4-甲基伞形酮

邻甲酚酞

硝基酪氨酸

副品红

酚红

藻红蛋白(包括但不限于B型和R型)

邻苯二甲醛

芘

丁酸芘

琥珀酰亚胺基1-丁酸芘

量子点

活性红4(Cibacron 亮红3B-A)

6-羧基-X-若丹明(ROX)

6-羧基若丹明(R6G)

丽丝胺若丹明B磺酰氯

若丹明B

若丹明123

若丹明X异硫氰酸酯

磺基若丹明B

磺基若丹明101

磺基若丹明101的磺酰氯衍生物(德州红)

N，N，N’，N’-四甲基-6-羧基若丹明(TAMRA)

四甲基若丹明

四甲基若丹明异硫氰酸酯(TRITC)

核黄素

玫红酸

镧系螯合衍生物

用于免疫试验的优选的一组荧光团是荧光素、荧光素异硫氰酸酯、藻红蛋 白、若丹明B和德州红(磺基若丹明101的磺酰氯衍生物)。特别优选藻红蛋 白。因此，在一个实施方式中，经标记的结合部分是与藻红蛋白(PE)偶联的 链霉亲和素。本段前列表中的任何荧光团都可使用荧光团和结合部分上的适当 功能基团，通过常规共价结合连接至结合成员。对此类基团的识别以及形成所 述连接的反应对于本领域技术人员是显而易见的。

可用于代替荧光团的其他标签是放射性标签和酶标签。这些方法也为本领 域熟知。

在固体支持物与经标记的结合成员孵育之后，使用上述的回收方法回收固 体支持物，并且检测与支持物结合的标签的量。在一些实施方式中，检测步骤 包括检测由上述的荧光标签产生的荧光信号的量。

在一些实施方式中，通过流式细胞术检测荧光信号。流式细胞术用于带有 双激光器系统的珠尺寸分类法(正向/侧向散射)以对珠的染色区域分类，然后 对来自各区域的荧光信号进行定量。本领域技术人员已知用于鉴定固相群和相 关的群信号的其他多重方法。示例包括使用在珠的停流固定之后使用 LED-CCD成像鉴定并定量的Luminex技术(参见因特网， www.luminexcorp.com/Products/Instruments/MAGPIX/)。另一个示例是使用具 有高密度代码的圆柱体玻璃微珠作为固相以及凹槽板(groove plate)检测方法 的Ilumina Veracode^TM多重技术(参见因特网， www.illumina.com/systems/beadxpress/technology.ilmn)。多重方法的其他示例 包括基于芯片的测定，如Randox生物芯片测定技术测定(参见因特网， www.randox.com/Biochip％20Immunoassays.php)。

在一些实施方式中，使用镧系螯合试剂来产生荧光信号并使用时间分辨荧 光来检测荧光信号。镧系螯合物的独特之处在于它们的荧光衰减展示出较长的 寿命和较大的“斯托克位移”。镧系螯合物的使用允许免疫测定分析物检测的 较高灵敏度。螯合物可以是定制合成的并通过类似的用于常规荧光团(像荧光 素、若丹明、藻红蛋白等)的化学偶联技术连接到蛋白质和抗体。与最常用的 螯合物缔合的金属是铕。基于该技术的市售系统是(解离增强的镧 系元素氟免疫测定)TRF(时间分辨荧光)测定系统(马萨诸塞州沃森姆的金 埃尔默公司(Perkin Elmer))。

在一些实施方式中，检测到的标签的量与本文所述的区分参数相关联以得 到单独代表生物样品中分析物水平的值。在一些实施方式中，将代表分析物水 平的值对代表标准化因子水平的值进行标准化。例如，在一些实施方式中，通 过将代表分析物水平的值除以代表标准化因子水平的值(即分析物信号/人 FXIII信号之比)来对值进行标准化，并且将该结果乘以一个常数以产生经标 准化的值。可使用经标准化的值(也称为经标准化的信号)来校正实施该方法 期间样品处理和生物基质影响中的变化。在一些实施方式中，经标准化的值显 著降低了使用相同生物样品的不同重复样测定之间的变异系数(相对标准偏差 ％)。

信号标准化使方法中使用的样品、对照和校准物具有改善的测定精确度。 信号标准化也使方法中使用的试剂在使用期间具有改善的信号稳定性。应理解 标准化因子也可用于对用于检测对象中的其他生物学状况，如HIV以外的病毒 感染，和/或其他病理状况，如急性或慢性疾病的测定中的值进行标准化。

II.功能基团

使用合适的试验试剂包被颗粒表面可通过静电吸引、特异的亲和相互作 用、疏水相互作用或共价键连接实现。可通过常规方法使用用于试验试剂共价 连接的功能基团对聚合物进行衍生化，特别是通过使用含有功能基团的单体， 如作为唯一单体或共聚单体的单体。合适的功能基团的示例是氨基(-NH₂)、 铵基(-NH₃⁺或-NR₃⁺)、羟基(-OH)、羧酸基团(-COOH)和异氰酸 酯基(-NCO)。用于将羧酸基团导入聚烯烃的有用的单体是例如丙烯酸和甲 基丙烯酸。

连接基团可用作增加颗粒表面反应基团密度的方法，也可用作减少空间位 阻的方法。连接基团也可用作将涂层材料固定至颗粒表面的方法。某些连接基 团是包含一个反应基团的单官能接头，以及包含两个或更多个反应基团的多官 能交联剂，能够与两个或更多个不同的功能性靶标(例如肽、蛋白质、大分子、 半导体纳米晶体或底物)形成键。在一些实施方式中，所述多官能交联剂是包 含两个不同反应基团的异双官能交联剂。合适的反应基团的示例是硫醇基 (-SH)、羧酸酯(-COOR)、羧基(-COOH)、羰基(-C(O)-)、胺(NH₂)、 羟基(-OH)、醛基(-CHO)、羟基(-OH)、活性氢、酯、磷酸盐/酯(-PO₃) 和光敏部分。胺活性基团的示例是异硫氰酸酯、异氰酸酯、酰基叠氮、NHS 酯、磺酰氯、醛和乙二醛、环氧化物和环氧乙烷、碳酸盐/酯、芳基化剂、亚氨 酸酯、碳二亚胺和酸酐。硫醇反应基团的示例是卤化乙酰和烷基卤衍生物、马 来酰亚胺、氮丙啶、丙烯酰基衍生物、芳基化剂和硫醇-二硫化物交换试剂。 羧酸酯反应基团的示例是重氮烷和重氮乙酰基化合物，如羰基二咪唑和碳二亚 胺。羟基反应基团的示例是环氧化物和环氧乙烷、羰基二咪唑、高碘酸盐氧化、 N，N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯或N-羟基琥珀酰亚胺氯甲酸酯、酶促氧化、烷基 卤素和异氰酸酯。醛和酮反应基团的示例是用于席夫碱形成或还原胺化的肼衍 生物。活性氢反应基团的示例是用于曼尼希(Mannich)缩合和碘化反应的重 氮衍生物。光敏基团的示例是芳基叠氮化物和卤代芳基叠氮化物、二苯甲酮、 重氮化合物和双吖丙啶(diazirine)衍生物。

本发明实践中有用的其他合适的反应基团和反应类型通常是生物共轭化 学领域公知的那些。目前优选的使用反应螯合物的反应类型是在相对温和条件 下进行的那些反应。这些包括但不限于亲核取代(例如胺和醇与酰基卤、活性 酯反应)、亲电取代(例如烯胺反应)以及碳-碳和碳-杂原子多键的加成反应 (例如迈克尔反应、狄尔斯-阿尔德加成(Diels-Alder addition))。这些和其 他有用的反应可参见例如March，Advanced Organic Chemistry(《高级有机化 学》)，第三版，约翰威力父子公司(John Wiley&Sons)，纽约，1985；Hermanson， Bioconjugate Techniques(《生物共轭技术》)，学术出版社(Academic Press)， 圣地亚哥，1996；以及Feeney等，Modification Of Proteins(《蛋白质修饰》)； Advances in Chemistry Series(《化学进展系列》)，第198卷，美国化学协会 (American Chemical Society)，华盛顿特区，1982。

在一些实施方式中，所述官能团是包含两个不同反应基团的异双功能交联 剂，所述反应基团含有能够与肽和蛋白质相互作用的杂环。例如，异双官能交 联剂(如N-[γ-马来酰亚胺基丁酰氧基]琥珀酰亚胺酯(GMBS)或4-[N-马来酰 亚胺甲基]环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC))包含能够与肽或蛋白质中的 氨基或硫醇基团相互作用的胺反应基团和硫醇反应基团。适用于异双官能交联 剂的其他反应基团组合包括，例如，羰基和巯基反应基团；胺和光敏基团；巯 基和光敏基团；羰基和光敏基团；羧酸酯和光敏基团；以及精氨酸和光敏基团。 合适的连接基团的示例是聚赖氨酸、聚天冬氨酸、聚谷氨酸和聚精氨酸。可使 用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、CMC 1-环己基-3-(2-吗啉基乙基)碳二亚胺 (CMC)、N-羟基苯并三唑(HOBt)和/或其他交联剂。

来自多种起始单体的常规乳化聚合技术形成的颗粒在许多情况下都适用， 因为其具有最低水平的自荧光。相反地，经修饰增加孔隙从而增加其表面积的 颗粒(即在文献中称作“多孔”颗粒的那些)倾向于发出高水平的自发荧光， 因而通常是不理想的。自发荧光随着尺寸和二乙烯基苯单体含量的增加而增 加。

如上文和下文所述，可利用区分参数使用固体支持物进行多重化，即对给 定组内的所有分析物同时进行测定。

III.区分参数

区分参数的一个示例是颗粒直径，其中固体支持物被分成具有非重叠直径 子范围的组中的颗粒。在这些实施方式中，对直径子范围的宽度和相邻子范围 平均直径之间间隔进行了选择，从而能够通过流式细胞术区分子范围，且这类 选择对于熟知流式细胞术的使用和仪器的技术人员而言是显而易见的。在该说 明书中，术语“平均直径”指数字平均直径。在一些实施方式中，子范围宽度 是平均直径的约±5％CV或更小，其中“CV”代表“变异系数”并定义为颗粒 直径的标准偏差除以平均颗粒直径再乘以100％。多个子范围中平均直径之间 的最小间隔可根据微粒尺寸分布、通过尺寸区分微粒用于附连不同试验试剂的 难易程度以及流式细胞术设备的类型和灵敏度而变化。在一些实施方式中，当 不同子范围的平均直径由其中一个子范围的平均直径的至少约6％间隔开时， 例如其中一个子范围的平均直径的至少约8％，例如其中一个子范围的平均直 径的至少约10％间隔开时，会获得最佳结果。在一些实施方式中，各子范围中 颗粒直径的标准偏差小于相邻子范围的平均直径间隔的三分之一。

可用于区分不同颗粒组的区分参数的另一个示例是荧光。通过将一种或多 种荧光材料整合至颗粒中，荧光材料具有不同荧光发射光谱并在此基础上进行 区分，从而实现通过荧光进行区分。可通过使用具有不同荧光强度或以不同波 长发射荧光的荧光材料，或通过改变整合的荧光材料的含量来实现区分。还可 通过使用针对各颗粒亚组的荧光团的组合实现通过荧光团进行区分。例如，可 制备颗粒使其含有红色荧光物(如Cy5)以及远红荧光物(如Cy5.5)，对于 不同的亚组采用不同的相对含量。可使用其他荧光物进一步扩展该系统。因此， 各微粒可含有波长各异的多种荧光染料。

通过使用不同波长下的荧光发射，波长的差异可用于颗粒组之间彼此的区 分，还同时区分了经标记的抗人抗体中的标签与区分各颗粒组的标签。可用作 区分颗粒组的方法的荧光底物的一个示例是荧光素，而可用于试验检测的底物 的一个示例是藻红蛋白。在该示例的使用中，可使用不同浓度的荧光素对不同 颗粒组进行染色以区分彼此，而藻红蛋白被用作该试验中使用的多种经标记的 结合成员上的标签。

可用于区分多个颗粒组的区分参数的另一个示例是光散射。侧角光散射根 据颗粒尺寸、粒度、吸光度和表面粗糙度的变化而变化，而前角光散射主要受 尺寸和折射率的影响。这些特性中任一项的改变都会导致光散射差异，所述光 散射差异可用作区分多个组的方法。

区分参数的又一个示例是吸光度。对颗粒施加光时，颗粒对光的吸收主要 由侧向(侧角)散射光的强度变化显示，而正向散射光的强度相对不受影响。 因此，颗粒相关的多个有色染料之间的吸光度差异是通过观察侧向散射光强度 的差异确定的。

区分参数的又一个示例是各组中的颗粒数目。当各组中的颗粒数目以已知 方式变化时，可通过具有各反应的颗粒数目将具有多个试验反应的颗粒计数与 特定试验相关联。

如上述示例所示，可将广泛的参数或特征用作区分参数以区分一组的颗粒 和另一组的颗粒。区分参数可来自颗粒尺寸、来自颗粒组成、来自影响光散射 的颗粒物理特征、来自将不同发射光谱和/或散射特征赋予颗粒的可激发荧光染 料或有色染料，或者来自不同浓度的一种或多种荧光染料。当可区分的颗粒参 数是荧光染料或颜色时，可将其包被于颗粒表面上，包埋在颗粒内或者连接至 颗粒材料的分子。因此，可通过将聚合物材料与荧光染料混合，或通过使用染 料浸渍颗粒来制造荧光颗粒。已整合有染料并因此适于在本发明中使用的颗粒 是市售可得的，可购自供应商，如斯菲罗公司(Spherotech，Inc.)(美国伊利 诺伊州利伯蒂维尔)和分子探针有限公司(Molecular Probes，Inc.)(美国俄勒 冈州尤金)。

使用颗粒(尤其是微粒)时，流式细胞术的应用是一种通过区分参数分选 颗粒的简便方法，并在多种情况下确定标签是否已通过试验组分连接至颗粒， 作为试验反应的结果。

流式细胞术的方法和仪器是本领域已知的，且可用于本发明的实践中。通 常，流式细胞术涉及颗粒(或细胞)以流动的方式通过光束并偶联至电光传感 器，通过方式为一次仅有一个颗粒能够通过传感器的区域。当各颗粒通过该区 域时，由于颗粒的存在，光束被扰乱，检测到产生的散射光和荧光。仪器使用 光信号鉴定各颗粒属于哪个亚组，连同标签的存在和量，从而可实现单独的试 验结果。用于流式细胞术的仪器和方法的描述可在文献中找到。示例是 McHugh，“Flow Microsphere Immunoassay for the Quantitative and Simultaneous  Detection of Multiple Soluble Analytes(用于多个可溶性分析物的定量和同时检 测的流式微球免疫试验)”，Methods in Cell Biology 42(《细胞生物学方法 42》)，B部分，(学术出版社(Academic Press)，1994)；McHugh等， “Microsphere-Based Fluorescence Immunoassays Using Flow Cytometry  Instrumentation(使用流式细胞术仪器的基于微球的荧光免疫试验)”，Clinical  Flow Cytometry(《临床流式细胞术》)，Bauer，K.D.，等编(巴尔的摩，马里 兰州，美国：威廉姆斯和威廉姆斯公司(Williams and Williams)，1993)，第 535-544页；Lindmo等，“Immunometric Assay Using Mixtures of Two Particle  Types of Different Affinity(使用不同亲和性的两种颗粒混合物的免疫试验)”， J.Immunol.Meth.126：183-189(1990)；McHugh，“Flow Cytometry and the  Application of Microsphere-Based Fluorescence Immunoassays(流式细胞术和基 于微球的荧光免疫试验的应用)”，Immunochemica 5：116(1991)；Horan等， “Fluid Phase Particle Fluorescence Analysis：Rheumatoid Factor Specificity  Evaluated by Laser Flow Cytophotometry(流相颗粒荧光分析：激光流式光度术 评估的类风湿因子特异性)”，Immunoassays in the Clinical Laboratory(《临 床实验室中的免疫试验》)，185-189(利斯公司(Liss)1979)；Wilson等， “A New Microsphere-Based Immunofluorescence Assay Using Flow Cytometry (一种新的使用流式细胞术的基于微球的免疫荧光试验)”，J.Immunol.Meth. 107：225-230(1988)；Fulwyler等，“Flow Microsphere Immunoassay for the  Quantitative and Simultaneous Detection of Multiple Soluble Analytes(用于多种 可溶性分析物的定量和同时检测的流式微球免疫试验)”，Meth.Cell Biol.33： 613-629(1990)；库尔特电子公司(Coulter Electronics Inc.)，英国专利号 1,561,042(1980年2月13日公开)；以及Steinkamp等，Review of Scientific  Instruments 44(9)：1301-1310(1973)。

本发明的方法以及含有用于实践该方法的材料的本发明的试剂盒能够同 时检测并可选地定量生物样品中的多种分析物。这些分析物或分析物组的存在 可能是取样的对象中生物学状况的存在、缺失或阶段的指示。在一些实施方式 中，利用对样品中多种分析物的一些或全部的检测和/或定量来提供预后或评估 药物(例如抗病毒药物)治疗的有效性。诊断、预后或评估药物有效性可通过 例如将样品中某些分析物的量与健康个体、患病个体或上述两者相关的已知量 相关联来实现。在一些实施方式中，可使用诊断或预后来推荐对象的疗程。

在另一个实施方式中，由于测定试剂随着时间降解，可使用标准化因子来 对信号值进行标准化。例如，SNB信号(类似测定信号)对于生物素化的偶联 物和链霉亲和素-藻红蛋白(SA-PE)试剂的浓度都敏感。由于这些试剂在储存 时降解或在与运输紧迫相关的升高的温度下降解，一般在SNB和测定珠中观 察到信号损失。尽管存在测定信号的绝对损失，使用SNB标准化维持了测定 响应的稳定性。这有利于与校准曲线斜率相关的测定灵敏度。

实施例

实施例1

该实施例证明了可使用HIV检测测定中包含的hFXIII珠来检测测定信号 中意外和不可接受的变化。

方法：

所有的孵育在37℃下进行。含有用于检测HIV分析物、hFXIII、SVB和 ISB的珠的25μL珠试剂和25μL样品孵育28.5分钟，然后洗涤。向珠加入含 生物素化的偶联物的50μL偶联物1试剂并孵育10分钟，然后洗涤。向珠加 入含浓SA-PE的25μL偶联物2和25μL洗涤液并孵育10分钟。在洗涤后， 珠在50μL洗涤液中重悬并递送至检测器。珠在含三乙醇胺和CHAPS(3[(3- 胆酰胺丙基)二甲基铵基(dimethylammonio)]-丙磺酸)、蛋白质稳定剂、封 闭物和防腐剂的缓冲液中。偶联物1和偶联物2在含NaCl、蛋白质稳定剂、 封闭物和防腐剂的磷酸盐缓冲液中。所有的缓冲液的pH为7-7.4。试剂中链霉 亲和素-PE的起始浓度为4-8μg/mL。在反应容器处理期间，将25μL的链霉亲 和素-PE试剂与25μL的稀释液混合至2-4μg/mL的最终工作浓度。

含HIV抗原(p24抗原)的生物样品与共价耦合有抗-p24抗体的磁珠以及 共价耦合有hFXIII的磁珠(本文中称作hFXIII珠或信号标准化珠(SNB)) 孵育。在孵育步骤之后，珠从样品分离，洗涤并且与特异性结合p24抗原和 hFXIII的生物素化抗体(小鼠抗人FXIII-生物素)孵育。生物素偶联的抗-p24 抗体的浓度为5.0μg/mL。生物素偶联的抗-p24抗体的浓度为1.5μg/mL。通过 洗涤去除过量的偶联物并且向珠中加入链霉亲和素-PE偶联物。在用链霉亲和 素-PE孵育之后，珠经洗涤并检测荧光信号的量。进行12个重复样的测定。

如图1所示，对于各重复样，HIV抗原信号的量和hFXIII信号的量正相 关。另外，经标准化的信号(抗原信号/hFXIII信号乘以150)显示出比重复样 之间的抗原信号低得多的变异性。如表2所示，使用经标准化的信号的变异系 数(相对标准偏差％，CV％)比使用抗原信号或hFXIII信号小得多。另外， 可以使用hFXIII信号来检测无效测定结果，如当hFXIII信号落入预定极限以 下时(例如，hFXIII的信号低于250)。

表2.12个抗原阳性样品重复样的分析

该实施例证明使用hFXIII珠来对产生的分析物值进行标准化改善了测定 精确度。该实施例还证明hFXIII信号标准化珠可用作检测无效测定的对照珠。

实施例2

该实施例证明当实施多重对照样品的重复样时，使用hFXIII珠显著改善 了经标准化的信号的CV。

使含针对HIV-1和HIV-2的人多克隆抗体以及代表HIV-O的兔单克隆抗 体的多重对照样品与共价耦合抗原的磁珠孵育，这些抗原特异性结合抗体(靶 分析物珠)。使HIV-1检测珠与GP-160连接。使HIV-2检测珠与SPOH连接。 使HIV-O检测珠与AFR连接。对照样品也与hFXIII珠孵育。如实施例1所述 处理样品。进行了5个重复样的测定。

如图2所示，在各重复样中HIV-1对照信号与hFXIII信号正相关。经标 准化的信号显示出重复样之间小得多的变化。如表3所示，经标准化的信号的 CV％显著低于HIV-1信号或hFXIII信号的CV％。

表3.HIV-1抗体阳性对照样品的5个重复样的分析。

HIV-1

相似地，图3显示在各重复样中HIV-2对照信号与hFXIII信号正相关。 经标准化的信号显示出重复样之间小得多的变化。表4显示经标准化的信号的 CV％显著低于HIV-2信号或hFXIII信号的CV％。

表4.HIV-2抗体阳性对照样品的5个重复样的分析。

HIV-2

HIV-O对照样品得到了相似的结果。图4显示在各重复样中HIV-O对照 信号与hFXIII信号正相关。经标准化的信号显示出重复样之间小得多的变化。 表5显示经标准化的信号的CV％显著低于HIV-O信号或hFXIII信号的CV％。

表5.HIV-O抗体阳性对照样品的5个重复样的分析。

HIV-

O

实施例3

该实施例描述了影响珠上产生的最终荧光信号的因素。

在上述测定的发展中，观察到样品，如校准物、对照或患者试样(血清或 血浆)的重复样分析可能随机产生测定珠上的可变荧光信号，导致高变异系数。 在一些情况中，信号变化可高达50％或更大并且足以对于一些重复样产生归为 阳性的响应但对其他重复样为阴性。

与测定化学反应和人工或自动化样品处理有关的多个因素影响珠上产生 的最终荧光信号的量级。一些重复样之间信号波动的来源与表6中所列的测定 变化相关。

表6.导致重复样之间信号波动的因素。

步骤-1珠-样品变化

·样品分配体积

·珠分配体积

·珠-样品孵育时间

·珠-样品混合效率

·珠-样品孵育温度

·在分析物与珠结合之后去除大量样品的珠-样品洗涤效率

·在珠-样品洗涤步骤之后残留的洗涤试剂的体积

步骤-2珠-偶联物变化

·生物素偶联物浓度

·生物素偶联物体积

·珠-偶联物孵育时间

·珠-偶联物混合效率

·珠-偶联物孵育温度

·在偶联物与珠结合之后去除大量偶联物的珠-偶联物洗涤效率

·在珠-偶联物洗涤步骤之后残留的洗涤试剂的体积

步骤-3珠-PE变化

·PE分配体积

·珠-PE孵育时间

·珠-PE混合效率

·珠-PE孵育温度

·在分析物与珠结合之后并在检测之前去除大量PE的珠-PE洗涤效率

·从珠-PE结合到荧光检测的时间

·由于温度或电压随时间变化的检测器响应(偏移)

由于hFXIII与珠共价耦合，其不响应步骤-1中所述的分析物-珠结合步骤 中的变化。然而，其响应步骤-1中所示的最终处理(珠-样品洗涤步骤之后残 留洗涤试剂的体积)，因为这影响了在步骤-2中加入的生物素试剂的最终浓度。 该珠响应步骤2和步骤3中所列的其他处理。

实施例4

该实施例证明与用四甲基尸胺若丹明(TMRC)包被的内部标准珠相比， 使用hFXIII信号标准化珠的信号值的标准化减少了重复样之间的变化。

由于荧光检测器响应可能随着时间偏移，一些人工或自动化测定一般包括 用固定量的TMRC包被的内部标准珠(ISB)，由此产生了标准量的信号。可 将测定信号对ISB信号进行标准化以弥补检测器变化。然而，由于ISB并不参 与免疫测定，其并不响应表6中所述的除了检测器偏移以外的潜在处理变化。 对于一系列重复样，如下表7所述，当将信号对ISB进行标准化时，没有观察 到对于实施例2中上述的HIV-1数据的测定精确度的改善。

表7.使用ISB和hFXIII SNB的经标准化的信号的比较。

实施例5

该实施例证明了在加入链霉亲和素-PE之前信号变化受到反应容器中残 留的生物素偶联物的影响。

本发明的发明人观察到如果在表6中的步骤2的洗涤阶段期间没有有效去 除生物素偶联物(例如，由于设备洗涤-吸出误差)，信号会因残留的水性生 物素偶联物与PE的相互作用而显著降低。该结果是PR浓度的有效降低。下 面对这种类型的误差建模，以供于抗体校准物中的HIV-O抗体检测：

构建了4种测试方法(在X轴上标记为HIV、HIV2、HIV3、HIV4)，其 中在加入荧光报告物(PE)之前在反应容器(RV)中故意留下各种量的生物 素偶联物。图5显示了测试方法的信号响应。

HIV表示具有完全RV洗涤方案的标准方法(显示8个重复样)。当在加 入PE试剂之前向RV中分别故意加入10μL或5μL的残留生物素偶联物时， HIV-2和HIV-3显示出信号的完全丧失。在加入PE试剂之前，HIV-4显示出 RV的较差不完全洗涤的影响。ISB信号保持恒定(数据未显示)。

在探索直接与生物素耦合的替代内部标准珠的用途的单独实验中，发现如 果加入足量的生物素珠(即固相生物素)，则测定信号也会下降。ISB并未检 测到测定信号的这种下降，但是由于其似乎对游离PE浓度有影响，SNB追踪 了产生良好精确度的测定信号。

同样，如果生物素偶联物分配体积由于吸量误差而低于期望，或如果残留 洗涤体积由于设备洗涤吸除误差而高于期望，则反应混合物中最终偶联物浓度 降低，导致较低的测定信号和较低的hFXIII信号而ISB信号保持恒定。

总之，该实施例证明在加入经标记的链霉亲和素之前有残留的生物素偶联 物保留在反应容器中时，可使用hFXIII SNB来对测定信号进行标准化。

实施例6

该实施例证明了生物基质影响可造成p24抗原信号的可变回收率，但当使 用用于标准化的hFXIII珠时这种变异性显著降低。

人供者提供了被吸入9种不同类型的收集管的血液试样。玻璃或塑料收集 管含有用于生产血清或血浆的各种抗凝血剂。从不含抗凝血剂的管中得到血 清。一些管含有用于从血清或血浆中分离细胞的血清分离器(SST)或血浆分 离器(PST)屏障。管的类型如下所述：

试样类型 抗凝血剂 玻璃 塑料 血清 无 x x

血清SST 无 x x 血浆 K2-EDTA   x 血浆 柠檬酸钠   x 血浆 肝素钠   x 血浆 肝素锂   x 血浆PST 肝素锂   x

用相同浓度的HIV p24抗原补充各血清或血浆基质并且按照实施例1的方 法每种状况测试5个重复样。

在该实施例中，预计所有的重复样和样品基质类型产生对Ag RFI的相 同响应。然而，如表8和图6所示，在不同的基质类型之间存在显著的变 化。对于所有重复样和样品类型的p24抗原信号的CV％为10.1％。相反， 当用hFXIII对数据进行标准化时，显著降低了变异性。如表8和图7所示， 经标准化的响应(p24信号/hFXIII信号)的CV％改善为4.6％。

表8.收集于不同类型的收集管中并用不同的抗凝血剂处理并对来自 hFXIII的信号进行标准化的血清和血浆样品中HIV p24抗原RF1的检测。

该实施例显示了使用hFXIII对信号进行标准化显著降低了与不同基质影 响相关的变异性。

在所附的权利要求书中，术语“一个”或“一种”是用来表示“一个(种) 或多个(种)”。在述及步骤或要素时，其术语“包含”及其变化形式例如“包 括”和“含有”旨在表示其它步骤或要素的增加是可任选且不被排除的。本说 明书中引用的所有专利、专利申请和其它公开的参考材料都通过引用全文纳入 本文中。当本说明书的内容与本发明引用的任何参考材料或任何现有技术之间 存在矛盾之处的时候，以本说明书为准。所述矛盾之处包括现有技术对词或词 组的定义与本说明书对相同的词或词组明确给出的定义之间的差异。