通过定向进化构建的热稳定性提高的脂肪酶突变体

摘要

通过定向进化构建的热稳定性提高的脂肪酶突变体，属于酶的基因工程技术领域。本发明公开了由华根霉（Rhizopuschinensis）CCTCCM201021脂肪酶作为亲本，经分子生物学技术而获得的热稳定性提高的脂肪酶突变体。在各突变体的氨基酸序列中，涉及到的氨基酸突变为Met101Thr、Glu107Gly、Ala129Ser、Ser151Asn、Cys160Leu、Lys161Arg、Pro168Leu、Pro168His、Leu180His、Asp182Tyr、Thr183Ala、Thr218Ser、Lys219Asp、Ala230Phe、Ser234Phe、Val261Gly、His317Pro、Val329Ala、Glu363Arg、Asn366Asp、Ser373Cys中的一种或几种。以在65℃下半衰期t50来表示，这些突变体的热稳定性较亲本华根霉脂肪酶得到了提高。本发明也公开了编码脂肪酶突变体的DNA序列、表达载体、宿主细胞。

说明书

技术领域

本发明涉及通过定向进化构建的热稳定性提高的脂肪酶突变体，具体地说涉及利用分子生物学技术获得热稳定性提高的脂肪酶突变体，属于酶的基因工程技术领域。

背景技术

脂肪酶（EC 3.1.1.3）不仅能催化油脂水解，也能在非水相中催化酯合成、转酯化、酸解等反应，被广泛地应用于化学，食品，制药和洗涤剂或生物能源工业中。微生物是脂肪酶的一个重要来源，而根霉又是微生物脂肪酶的重要生产菌。如今，已有超过30种根霉脂肪酶实现了商品化生产。根霉脂肪酶大都具有高度1,3-位置选择性，因此常用于油脂加工中。但是油脂加工通常需要在较高温度下进行，而根霉脂肪酶属于中温脂肪酶，在65℃下的半衰期仅有15 min左右，热稳定性差不仅限制了其应用范围，而且易于失活，增加了生产成本。

定向进化属于非理性设计，是指通过在实验室中模拟达尔文自然进化过程，针对某一蛋白质酶的基因，通过改进的诱变技术改造的酶的基因，然后根据特定的改造目的，筛选有价值的天然酶。近10年来，定向进化技术已经在酯酶和脂肪酶性质改造领域取得巨大的成功，主要集中于提高酶的催化反应活性，改进底物特异性，提高热稳定性，对映立体选择性等方面（Johannes TW et al. Curr. Opin. Microbiol, 2006, 9: 261-267）。 

发明人在前期研究中成功从酿造浓香型大曲酒的酒曲中筛选到一株高产脂肪酶的华根霉（Rhizopus chinensis ）CCTCC M 201021菌株，并从该菌株中首次克隆得到脂肪酶基因序列，并实现该脂肪酶在巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）中的高水平分泌表达（Yu Xiao-Wei et al. J Mol Catal B: Enzym, 2009, 57:304-311）。本发明以华根霉脂肪酶基因为模板，利用定向进化技术获得了热稳定性显著提高的脂肪酶突变体。

酶分子的热稳定性提高可以用其半衰期（t₅₀）来体现。即酶的活力降低到原来活力一半时所需要的时间。半衰期长，则酶稳定性高。反之，则稳定性差。因此，t₅₀的提高代表了酶分子热稳定性的提高。

    定义：

氨基酸和DNA核酸序列的命名法

使用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，用三字母代码形式。DNA核酸序列采用公认IUPAC命名法。

脂肪酶突变体的标识

采用 “原始氨基酸 位置 替换的氨基酸”来表示脂肪酶突变体中突变的氨基酸。如 Glu107Gly， 表示位置107的氨基酸由亲本脂肪酶的Glu替换成Gly，位置的编号对应于附件序列表1 中亲本华根霉脂肪酶RCL的氨基酸序列编号。

如 Leu180His/ Thr218Ser，表示位置180和位置218的氨基酸都发生了突变。

发明内容

本发明的目的在于提供通过定向进化构建的热稳定性提高的脂肪酶突变体。

本发明的技术方案：通过定向进化构建的热稳定性提高的脂肪酶突变体，由亲本华根霉（Rhizopus chinensis ）CCTCC M 201021脂肪酶进行定向进化，通过易错PCR、DNA Shuffling和定点突变，获得脂肪酶突变体，亲本华根霉氨基酸序列SEQ ID NO: 1中在氨基酸取代位置发生突变，采用“原始氨基酸-位置-替换的氨基酸”来表示脂肪酶突变体中突变的氨基酸，所述脂肪酶突变体为：，

表1

华根霉脂肪酶氨基酸突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO: 2，有22个突变氨基酸，底色标记显示。

用于表达所述的脂肪酶突变体的表达载体为：pPIC9K，pPIC3.5K，pPICZα，pPICZ；

用于所述的表达载体转化的微生物宿主细胞为毕赤酵母。

与亲本华根霉脂肪酶相比，所述脂肪酶突变体的热稳定性获得了提高，以在65℃下的半衰期t₅₀来表示热稳定性的提高，所述脂肪酶突变体的半衰期以及提高的倍数如下： 

表2

亲本华根霉脂肪酶在65℃下的半衰期t₅₀为16.5 min。

本发明的有益效果：运用分子生物学方法对亲本华根霉脂肪酶进行定向进化，通过易错PCR、DNA Shuffling和定点突变，获得脂肪酶突变体，以半衰期t₅₀表示，脂肪酶突变体的热稳定性得到了提高，如表2所示。

附图说明

根据上海生工生物工程技术服务有限公司测序结果确定突变氨基酸，各个突变体的氨基酸突变位点测序结果如下。

图1脂肪酶突变体1：Ser234Phe测序峰图。

图2脂肪酶突变体2：a：Pro168Leu，b：Val329Ala测序峰图。

图3脂肪酶突变体3：Cys160Leu测序峰图。

图4脂肪酶突变体4：a：His317Pro，b：Met101Thr测序峰图。

图5脂肪酶突变体5：a：Ser151Asn，b：Leu180His测序峰图。

图6脂肪酶突变体6：a：Val261Gly，b：Ser373Cys测序峰图。

图7脂肪酶突变体7：a：Asp182Tyr，b：Ala230Phe测序峰图。

图8脂肪酶突变体8：a：Leu180His，b：Thr218Ser测序峰图。

图9脂肪酶突变体9：a：Asn366Asp，b：Leu180His，c：Val329Ala测序峰图。

图10脂肪酶突变体10：a：Ser234Phe，b：Leu180His，c：Thr218Ser测序峰图。

图11脂肪酶突变体11：a：Ser234Phe，b：Pro168 His，c：Val329Ala，d：Cys160Leu，e：His317Pro，f：Met101Thr测序峰图。

图12脂肪酶突变体12：a：Leu180His，b：Thr218Ser，c：Val261Gly，d： Lys161Arg测序峰图。

图13脂肪酶突变体13：a：Glu107Gly，b：Ala129Ser， C：Glu363Arg， d：Lys161Arg，e：Val261Gly，f：Leu180His测序峰图。

图14脂肪酶突变体14：a：Lys161Arg，b：Leu180His，c：Thr218Ser，d：Met101Thr，e：Thr183Ala，f：Glu107Gly，g：Ser151Asn，h：Glu363Arg测序峰图。

图15脂肪酶突变体15：a：Glu107Gly，b：Ala129Ser，c：Ser151Asn，d：Lys161Arg，e：Leu180His，f：Ser234Phe，g：Glu363Arg，h：Val329Ala测序峰图。

图16脂肪酶突变体12-1：a：Ala230Phe，b：Leu180His，c：Thr218Ser，d：Val261Gly，e：Lys161Arg测序峰图。

图17脂肪酶突变体13-1：a：Glu107Gly，b：Ala129Ser，c：Ser151Asn，d：Lys219Asp，e：Leu180His，f：Glu363Arg，g：Ala230Phe测序峰图。

具体实施方式

实施例中涉及到的培养基及试剂配方如下：

LB液体培养基：蛋白胨 1％，酵母提取物 0.5％，NaCl 1％，pH7.0。

YPD(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium): Yeast Extract 1％, Trypton 2％, Dextrose  2％，制作平板时加入Agar 2％。121 °C高压灭菌20 min。用于筛选G418抗性时加入G418至终浓度为0.25 mg/mL-1.0 mg/mL，即YPD-G418平板。

MD(Minimal Dextrose Medium): YNB 1.34％, Biotin 4×10^-5％, Dextrose 2％, Agar 2％。

MM(Minimal Methanol Medium): YNB1.34％, Biotin4×10^-5％, Methanol 0.5％, Agar2％。

BMGY(Buffered Glycerol-complex Medium): Yeast Extract 1％, Trypton 2％, YNB 1.34％, Biotin 4×10^-5％, Glycerol 1％, 磷酸钾溶液pH 6.0、100 mmol/L。

BMMY(Buffered Methanol-complex Medium): Yeast Extract 1％, Trypton 2％, YNB1.34％, Biotin 4×10^-5％, Methanol 0.5％, 磷酸钾溶液100 mmol/L。

培养基中的单位为％（W/V）

Fast-blue RR染色剂：360μL萘酯（20mg萘酯溶于1mL 2-甲基甲酰胺）与160μL Fast blue RR（80mg Fast blue RR溶于1mL二甲亚砜）相混合。

实施例1、利用易错PCR方法构建表达脂肪酶突变体的毕赤酵母文库

利用易错PCR技术在体外向华根霉脂肪酶基因proRCL引入核苷酸突变。易错PCR的反应条件如下：

其中，上游引物F和下游引物R序列为：

F: 5'-TCAAGATCCCTAGGGTTCCTGTTGGTCATAAAGGTTC-3'; 

R: 5'-AATTCCAGTGCGGCCGCTTACAAACAGCTTCCTTCG-3'。

PCR扩增条件：94℃ 3min；94℃ 1 min，59℃ 1 min，72℃ 2 min，30个循环；72℃10 min。

易错PCR扩增产物经DNA纯化试剂盒纯化后，限制性内切酶AvrⅡ和NotI分别对易错PCR扩增产物和质粒pPIC9K进行消化，连接，获得包含突变体基因的表达质粒，转化至E .coli JM109感受态细胞。涂布于LB（含100 μg/μL的Amp) 平板。生长12 h后，将转化子转移至LB液体培养基中培养，获得表达质粒。

将表达质粒经限制性内切酶SalI线性化后，电转化毕赤酵母GS115感受态细胞。将转化液涂布于MD平板上，30°C培养2 d，构成表达脂肪酶突变体的毕赤酵母文库。

实施例2、利用DNA  Shuffling方法构建表达脂肪酶突变体的毕赤酵母文库

利用DNA Shuffling的方法将易错 PCR构建的脂肪酶突变体中的突变位点进行随机组合。DNA Shuffling的条件如下：

提取易错PCR方法构建的表达脂肪酶突变体的毕赤酵母文库的基因组，用DNase Ⅰ消化30min，将消化产物酚氯仿抽提除去蛋白质后溶解于30 μL 无菌水中。以该基因组为模板进行如下操作：

步骤一：PCR反应体系：

Taq (2.5U)0.5 μL5×buffer（Mg^2+>plus）10 μL基因组0.5 μLdNTP(25mmol/L)4 μLdd H₂O34.5 μL

PCR扩增条件：94℃ 3min；94℃ 1 min，59℃ 1 min，72℃ 2 min，10个循环；72℃10 min。

步骤二：在上述体系中加入引物F和R各1μL，PCR扩增条件：94℃ 3min；94℃ 1 min，59℃ 1 min，72℃ 2 min，30个循环；72℃10 min。

扩增产物经胶回收纯化试剂盒纯化后，用实施例1同样的方法，构建表达脂肪酶突变体的毕赤酵母文库。

实施例3、高酶活脂肪酶突变体的筛选

将保存于MD平板上的毕赤酵母文库影印复制到MM平板上，30℃培养2天，以表达亲本华根霉脂肪酶的毕赤酵母作为对照菌。

平板初筛：每12 h向MM平皿盖上补加200 μL甲醇诱导重组脂肪酶表达，诱导2-3天后，将平板置于65℃热处理60 min，冷却到室温，向平板上均匀倾倒 Fast-blue RR染色剂约15 mL，2 min内单克隆所显黑褐色深于对照的菌落为初筛目的菌株。

96孔板筛选方法：向1.8 mL/孔（平底）的96孔板中加入300 μL BMGY培养基，121 ℃灭菌20 min。向其中接入初筛获得的菌株，以表达亲本华根霉脂肪酶的毕赤酵母作为对照菌，30 ℃ 250 r/min振荡培养至OD₆₀₀为2-6。离心，弃上清，用900 μL BMMY培养基重悬菌体，每24 h加入1 % （V/V）甲醇诱导脂肪酶表达，诱导4 天，离心收集上清，根据实施例4的方法测定脂肪酶突变体在65℃下的半衰期t₅₀。

筛选易错PCR和DNA Shuffling构建的表达脂肪酶突变体的毕赤酵母文库，分别获得14株热稳定性明显提高的菌株，测定脂肪酶核苷酸序列（由上海生工生物工程技术服务有限公司测序），利用三联体密码子推测脂肪酶的氨基酸序列，脂肪酶突变体的氨基酸取代及半衰期如表3所示。

表3 脂肪酶突变体及其半衰期

实施例4 脂肪酶突变体的t₅₀测定

为测定脂肪酶的t₅₀值，需要对酶进行分离纯化。

摇瓶发酵：接种量10％（V/V），25 mL BMGY培养基中，30℃振荡培养16～20 h 至OD₆₀₀为2～6，离心收集菌体，用BMMY培养基稀释至OD₆₀₀为1，每隔24 h添加0.5 %的甲醇诱导表达，培养3-4 d后，收集发酵上清液。

分离纯化：将突变菌株的发酵上清液经过10 KD超滤膜浓缩，SP-Sepharose FF强阳离子交换层析和Phenyl-Sepharose 6 FF疏水色谱柱层析后得到纯化的突变脂肪酶活性组分。具体操作参考文献Yu Xiao-Wei et al. J Mol Catal B: Enzym, 2009, 57:304-311。

t₅₀的测定方法：

脂肪酶活力的测定方法为pNPP法（Pencreach G et al. Enzyme and Microbial Technol. 1996, 18: 417-422.）。酶活的定义为pH8.0，40℃下反应每分钟产生1 μmol 对硝基苯酚的酶量为一个脂肪酶水解酶活国际单位。脂肪酶在65℃下半衰期的测定方法为：在65℃下处理酶液，在不同处理时间取样，pNPP法测定脂肪酶残余酶活百分比（％）。以残余酶活百分比的log值对时间T（min）作图，直线的斜率为失活常数k_inact。由t₅₀=ln2/k_inact得到脂肪酶在该温度下的t₅₀。

实施例5 定点突变组合脂肪酶突变体的基因突变位点

经过上述易错PCR和DNA Shuffling突变文库的构建，筛选获得如表3所示的脂肪酶突变体。为了考察其中某一个突变及各突变的组合对脂肪酶突变体活力的影响，对表3中的突变位点进行定点突变组合（定点突变可以利用市售的试剂盒进行），将含有上述突变位点组合的基因与载体pPIC9K连接，获得表达质粒，后续毕赤酵母表达如实施例1所述。用实施例4的方法测定脂肪酶突变体在65℃下的t₅₀。热稳定性获得提高的脂肪酶突变体如表4所示。

表4 突变体脂肪酶及其t₅₀提高的倍数

各脂肪酶名称突变位点及其组合65℃下的t₅₀>t₅₀提高的倍数亲本脂肪酶-16.51.0突变体12-1Ala230Phe/Leu180His/Thr218Ser/Val261Gly/ Lys161Arg75545.76突变体13-1Glu107Gly/Ala129Ser/Ser151Asn/Lys219Asp/Leu180His/Glu363Arg/Ala230Phe69041.82

最后，还需注意到的是，上述列举的仅是本发明的若干个实施例。显然，本发明不限于以上实施例。

<210>  SEQ ID NO: 1

<211>  389

<212>  PRT

<213>  华根霉（Rhizopus chinensis）CCTCC M 201021脂肪酶氨基酸

 

<400>  1

Met Val Ser Phe Ile  Ser Ile Ser Gln Gly  Val Ser Leu Cys Leu

                  5                   10                   15

Leu Val Ser Ser MET  MET Leu Gly Ser Ser  Ala Val Pro Val Ala 

20                   25                   30

Gly His Lys Gly Ser  Val Lys Ala Thr Asn  Gly Thr Asp Phe Gln

 35                   40                   45

Leu Pro Pro Leu Ile  Ser Ser Arg Cys Thr  Pro Pro Ser His Pro 

50                   55                   60

Glu Thr Thr Gly Asp  Pro Asp Ala Glu Ala  Tyr Tyr Ile Asn Lys 

65                   70                   75

Ser Val Gln Trp Tyr  Gln Ala His Gly Gly  Asn Tyr Thr Ala Leu 

80                   85                   90

Ile Lys Arg Asp Thr  Glu Thr Val Gly Gly  Met Thr Leu Asp Leu 

95                  100                  105

Pro Glu Asn Pro Pro  Pro Ile Pro Ala Thr  Ser Thr Ala Pro Ser 

110                  115                  120

Ser Asp Ser Gly Glu  Val Val Thr Ala Thr  Ala Ala Gln Ile Lys 

125                  130                  135

Glu Leu Thr Asn Tyr  Ala Gly Val Ala Ala  Thr Ala Tyr Cys Arg 

140                  145                  150

Ser Val Val Pro Gly  Thr Lys Trp Asp Cys  Lys Gln Cys Leu Lys 

155                  160                  165

Tyr Val Pro Asp Gly  Lys Leu Ile Lys Thr  Phe Thr Ser Leu Leu

 170                  175                  180

Thr Asp Thr Asn Gly  Phe Ile Leu Arg Ser  Asp Ala Gln Lys Thr 

185                  190                  195

Ile Tyr Val Thr Phe  Arg Gly Thr Asn Ser  Phe Arg Ser Ala Ile 

200                  205                  210

Thr Asp MET Val Phe  Thr Phe Thr Lys Tyr  Ser Pro Val Lys Gly 

215                  220                  225

Ala Lys Val His Ala  Gly Phe Leu Ser Ser  Tyr Asn Gln Val Val 

230                  235                  240

Lys Asp Tyr Phe Pro  Val Val Gln Asp Gln  Leu Thr Ala Tyr Pro 

245                  250                  255

Asp Tyr Lys Val Ile  Val Thr Gly His Ser  Leu Gly Gly Ala Gln 

260                  265                  270

Ala Leu Leu Ala Gly  Met Asp Leu Tyr Gln  Arg Glu Lys Arg Leu 

275                  280                  285

Ser Pro Lys Asn Leu  Ser Ile Tyr Thr Val  Gly Cys Pro Arg Val 

290                  295                  300

Gly Asn Asn Ala Phe  Ala Tyr Tyr Val Asp  Ser Thr Gly Ile Pro 

305                  310                  315

Phe His Arg Thr Val  His Lys Arg Asp Ile  Val Pro His Val Pro 

320                  325                  330

Pro Gln Ala Phe Gly  Tyr Leu His Pro Gly  Val Glu Ser Trp Ile 

335                  340                  345

Lys Glu Asp Pro Ala  Asp Val Gln Ile Cys  Thr Ser Asn Ile Glu 

350                  355                  360

Thr Lys Glu Cys Ser  Asn Ser Ile Val Pro  Phe Thr Ser Ile Ala 

365                  370                  375

Asp His Leu Thr Tyr  Phe Gly Ile Asn Glu  Gly Ser Cys Leu       

380                  385              389

 

<210>  SEQ ID NO: 2

<211>  389

<212>  PRT

<213>  华根霉（Rhizopus chinensis）CCTCC M 201021脂肪酶氨基酸突变体的

脂肪酶氨基酸突变位点：20个突变氨基酸底色标记显示。

<400>  2

Met Val Ser Phe Ile  Ser Ile Ser Gln Gly  Val Ser Leu Cys Leu 

5                   10                   15

Leu Val Ser Ser Met  Met Leu Gly Ser Ser  Ala Val Pro Val Ala 

20                   25                   30

Gly His Lys Gly Ser  Val Lys Ala Thr Asn  Gly Thr Asp Phe Gln 

35                   40                   45

Leu Pro Pro Leu Ile  Ser Ser Arg Cys Thr  Pro Pro Ser His Pro 

50                   55                   60

Glu Thr Thr Gly Asp  Pro Asp Ala Glu Ala  Tyr Tyr Ile Asn Lys 

65                   70                   75

Ser Val Gln Trp Tyr  Gln Ala His Gly Gly  Asn Tyr Thr Ala Leu 

80                   85                   90

Ile Lys Arg Asp Thr  Glu Thr Val Gly Gly  Thr Thr Leu Asp Leu 

95                  100                  105

Pro Gly Asn Pro Pro  Pro Ile Pro Ala Thr  Ser Thr Ala Pro Ser 

110                  115                  120

Ser Asp Ser Gly Glu  Val Val Thr Ser Thr  Ala Ala Gln Ile Lys 

125                  130                  135

Glu Leu Thr Asn Tyr  Ala Gly Val Ala Ala  Thr Ala Tyr Cys Arg 

140                  145                  150

Asn Val Val Pro Gly  Thr Lys Trp Asp Leu  Arg Gln Cys Leu Lys 

155                  160                  165

Tyr Val Leu或His Asp Gly  Lys Leu Ile Lys Thr  Phe Thr Ser Leu His 

170                  175                  180

Thr Tyr Ala Asn Gly  Phe Ile Leu Arg Ser  Asp Ala Gln Lys Thr 

185                  190                  195

Ile Tyr Val Thr Phe  Arg Gly Thr Asn Ser  Phe Arg Ser Ala Ile 

200                  205                  210

Thr Asp Met Val Phe  Thr Phe Ser Asp Tyr  Ser Pro Val Lys Gly 

215                  220                  225

Ala Lys Val His Phe  Tyr Phe Leu Phe Ser  Tyr Asn Gln Val Val 

230                  235                  240

Lys Asp Tyr Phe Pro  Val Val Gln Asp Gln  Leu Thr Ala Tyr Pro 

245                  250                  255

Asp Tyr Lys Val Ile  Gly Thr Gly His Ser  Leu Gly Gly Ala Gln 

260                  265                  270

Ala Leu Leu Ala Gly  Met Asp Leu Tyr Gln  Arg Glu Lys Arg Leu 

275                  280                  285

Ser Pro Lys Asn Leu  Ser Ile Tyr Thr Val  Gly Cys Pro Arg Val 

290                  295                  300

Gly Asn Asn Ala Phe  Ala Tyr Tyr Val Asp  Ser Thr Gly Ile Pro 

305                  310                  315

Phe Pro Arg Thr Val  His Arg Arg Asp Ile  Val Pro His Ala Pro 

320                  325                  330

Pro Gln Ala Phe Gly  Tyr Leu His Pro Gly  Val Glu Ser Trp Ile

 335                  340                  345

Lys Glu Asp Pro Ala  Asp Val Gln Ile Cys  Thr Ser Asn Ile Glu 

350                  355                  360

Thr Lys Arg Cys Ser  Asp Ser Ile Val Pro  Phe Thr Cys Ile Ala 

365                  370                  375

Asp His Leu Thr Tyr  Phe Gly Ile Asn Glu  Gly Ser Cys Leu      

380                  385              389

 

<210>  SEQ ID NO: 3

 

<400>  3

F: 5'-TCAAGATCCCTAGGGTTCCTGTTGGTCATAAAGGTTC-3';

R: 5'-AATTCCAGTGCGGCCGCTTACAAACAGCTTCCTTCG-3'。