一种检测人凝血酶原复合物抗凝能力的方法

摘要

本发明公开了一种检测人凝血酶原复合物抗凝能力的方法，步骤如下：(1)取人凝血酶原复合物，稀释至凝血因子IX为0.8-1.3IU/ml，加入等体积浓度为4-6IU/ml的人凝血酶溶液，混匀，室温放置1-2min；(2)再加入与人凝血酶溶液等体积的凝血酶发色底物溶液，混匀，22-28℃条件下孵育4-6min，所述发色底物溶液的浓度为0.5-0.7mg/ml；(3)在405nm波长条件测定吸光值，每30s-50s测定1次，共测定5-8次；(4)以测定的吸光值为纵坐标(y)，以时间(s)为横坐标(x)，绘制吸光值随时间变化的趋势，并建立线性方程y＝kx+a，其中k为斜率，计算1/k的值，即可。本发明检测人凝血酶原复合物抗凝能力的方法操作简便，重复性好，可定量检测PCCs制品的综合抗凝能力，评价PCCs制品的安全性。

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测人凝血酶原复合物抗凝能力的方法。

背景技术

人凝血酶原复合物(prothrombin complex concentrates，PCCs)是从健 康人血浆中分离制备的一种血浆蛋白制品，主要包含四种凝血因子 (coagulation factor，F)，分别为FII、FVII、FIX、FX，此四种凝血因子具 有相似的理化性质，同时均需依赖维生素K合成；此外，还含有蛋白C(protein  C,PC)、蛋白S(protein S,PS)、蛋白Z(protein Z,PZ)同样依赖维生素K 合成的三种抗凝蛋白。自上世纪60年代该制品用于乙型血友病的临床防治以 来，由于其成分较为复杂，其临床适应症不断扩大，还可用于先天性或后天 获得的FII、FVII、FX、PC、PS缺乏，肝脏疾病所引起的凝血功能紊乱症， 长期输注FⅧ机体产生抗FⅧ抗体的甲型血友病及外伤引起的严重失血的治 疗，近年来又扩大至服用双香豆素抗凝药物过量而引起的出血症的治疗。我 国人口基数大，肝病患者人群比例高，再加上高纯的FII、FVII、FX、PC、 PS制剂缺乏，因此PCCs临床应用更广泛。

自PCCs制品用于临床以来，有不少关于导致血栓形成并发症的报道， 为了减少其血栓性风险，上世纪90年代，不少学者认为在PCCs中加入肝素 及抗凝血酶(antithrombin，AT)抗凝血制剂可降低PCCs的致血栓性，但对 PCCs中肝素及AT的具体加入量并没有一个硬性的统一标准，并且，国内外 厂家大多采用DEAE-sephadex A50凝胶进行PCCs分离，但具体工艺条件并 不相同，导致其含有的PC、PS、PZ也不一致，加之肝素及AT加入量没有 一个统一标准，导致PCCs中抗凝成分(PC、PS、PZ、肝素及AT)含量有 很大差异，从而致使PCCs的抗凝能力也有很大不同。

目前，生物制品的抗凝能力通常通过检测抗凝物质的活性含量来衡量。 然而，由于不同工艺及统一标准的缺乏使不同PCCs中抗凝成分(PC、PS、 PZ、肝素及AT)含量不一致，且其与促凝成分FII、FVII、FIX、FX混杂在 一起。因此，PCCs制品的抗凝能力检测非常复杂，且综合抗凝能力很难评 价，进而无法确定PCCs制品的血栓发生风险。

急需寻找一种能够测定PCCs综合抗凝能力的方法。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种检测人凝血酶原复合物抗凝能力 的方法，可以测定PCCs综合抗凝能力。

本发明检测人凝血酶原复合物抗凝能力的方法，它包括如下步骤：

(1)取人凝血酶原复合物，稀释至FIX为0.8-1.3IU/ml，加入等体积浓 度为4-6IU/ml的人凝血酶溶液，混匀，室温放置1-2min；

(2)再加入与人凝血酶等体积的凝血酶发色底物溶液，混匀，22-28℃ 水浴条件下孵育4-6min，所述发色底物溶液的浓度为0.5-0.7mg/ml；

(3)在405nm波长条件测定吸光值，每30-50s测定1次，共测定5-8 次；

(4)以上述测定的吸光值为纵坐标(y)，以时间(s)为横坐标(x)， 绘制吸光值随时间变化的趋势，并建立线性方程y＝kx+a，其中k为斜率，计 算1/k的值，即可。

室温：25℃±5℃。

优选地，步骤(1)中，稀释至凝血因子1-1.2IU/ml。

优选地，步骤(1)中，人凝血酶溶液的浓度为5IU/ml。

优选地，步骤(1)中，室温放置的时间为2min。

优选地，步骤(2)中，所述凝血酶发色底物为CS-01(38)，其分子式为 H-D-Phe-Pip-Arg-pNa·2HCl。

优选地，步骤(2)中，所述孵育的温度是26℃。

优选地，步骤(2)中，所述孵育的时间是6min。

优选地，步骤(2)中，所述发色底物溶液的浓度为0.6mg/ml。

优选地，步骤(3)中，每40-50s测定1次。

优选地，步骤(3)中，共测定5-6次。

为了能准确衡量人凝血酶原复合物的抗凝能力，研究人员目前致力于其 抗凝成分(如PC、PS、PZ、肝素、AT)的单一活性含量测定，然而其整体 抗凝能力却无法评价。

然而，本发明人意外的发现，采用本发明方法可以直接检测人凝血酶原 复合物的整体抗凝能力，而无需检测每个抗凝物质的活性含量，取得了意料 不到的技术效果。

发明人在研究过程中发现，采用本发明方法，将人凝血酶原复合物与凝 血酶及其底物在本发明特定条件下反应，在特定的时间段内，吸光值(OD 值)的变化快慢与人凝血酶原复合物的抗凝能力呈线性负相关，而吸光值与 时间的线性方程中的斜率就是反应吸光值的变化快慢的参数，因而通过计算 该斜率的倒数，就可以确定人凝血酶原复合物的抗凝能力。

本发明检测人凝血酶原复合物的方法操作简便，重复性好，可定量测定 PCCs制品的综合抗凝能力，从而可对不同PCCs制品的安全性进行评价及比 较。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的 详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。 凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1不同肝素及AT含量的PCCs制品测定的OD值随时间(s)变化 曲线及线性方程

图2国内外四种PCCs制品测定的OD值随时间(s)变化曲线及线性 方程

具体实施方式

凝血酶原复合物(PCCs)，购自国内外制品公司；

人凝血酶，购自sigma公司，批号：SLBK7230V；

凝血酶发色底物CS-01(38)，购自HYPEN-biomed公司，批号：30401-1。 实施例1本发明检测方法

1.人凝血酶原复合物(PCCs)制品的稀释

将PCCs制品用纯水稀释至0.8IU FIX/ml，取40μl加入微孔板中。

2.PCCs与人凝血酶混合

取40μl浓度为4IU/ml的的人凝血酶，加入上述微孔板中，轻微震荡， 混合均匀，室温放置1min。

3.显色反应

上述微孔板中加入40μl浓度为0.5mg/ml的发色底物CS-01(38)(分子式： H-D-Phe-Pip-Arg-pNa·2HCl)溶液，混合均匀，22℃水浴条件下孵育4min。

4.吸光度测定

405nm波长条件测定吸光值(OD值)，每30s测定1次，测定5次，共 150s。

5.线性方程建立

以上述测定的OD值为纵坐标(y)，以时间(s)为横坐标(x)，绘制 OD值随时间变化的趋势，并建立线性方程y＝kx+a，其中k为斜率。

6.综合抗凝能力的定量计算

计算1/k值，即为PCCs综合抗凝能力。

实施例2本发明检测方法

1.人凝血酶原复合物(PCCs)制品的稀释

将PCCs制品用纯水稀释至0.8-1.0IU FIX/ml，取60μl加入微孔板中。

2.PCCs与人凝血酶混合

取60μl浓度为5IU/ml的的人凝血酶，加入上述微孔板中，轻微震荡， 混合均匀，室温放置1.5min。

3.显色反应

上述微孔板中加入60μl浓度为0.6mg/ml的发色底物CS-01(38)(分子式： H-D-Phe-Pip-Arg-pNa·2HCl)溶液，混合均匀，25℃水浴条件下孵育5min。

4.吸光度测定

405nm波长条件测定吸光值(OD值)，每40s测定1次，测定7次，共 280s。

5.线性方程建立

以上述测定的OD值为纵坐标(y)，以时间(s)为横坐标(x)，绘制 OD值随时间变化的趋势，并建立线性方程y＝kx+a，其中k为斜率。

6.综合抗凝能力的定量计算

计算1/k值，即为PCCs综合抗凝能力。

实施例3本发明检测方法

1.人凝血酶原复合物(PCCs)制品的稀释

将PCCs制品用纯水稀释至1.3IU FIX/ml，取80μl加入微孔板中。

2.PCCs与人凝血酶混合

取80μl浓度为6IU/ml的的人凝血酶，加入上述微孔板中，轻微震荡， 混合均匀，室温放置2min。

3.显色反应

上述微孔板中加入80μl浓度为0.7mg/ml的发色底物CS-01(38)(分子式： H-D-Phe-Pip-Arg-pNa·2HCl)溶液，混合均匀，28℃水浴条件下孵育6min。

4.吸光度测定

405nm波长条件测定吸光值(OD值)，每50s测定1次，测定8次，共 400s。

5.线性方程建立

以上述测定的OD值为纵坐标(y)，以时间(s)为横坐标(x)，绘制 OD值随时间变化的趋势，并建立线性方程y＝kx+a，其中k为斜率。

6.综合抗凝能力的定量计算

计算1/k值，即为PCCs综合抗凝能力。

以下用实验例的方式说明本发明的有益效果：

实验例1不同肝素及AT含量的PCCs综合抗凝能力的测定及比较

1.实验方法

(1)取市售PCCs浓缩物，测定FIX活性含量，超纯水稀释至FIX活性 含量为1.2IU/ml，分装200μl一支。分别往等量PCCs浓缩物稀释液中添加适 量的AT(抗凝血酶)(50IU/ml)和肝素(1000IU/ml)溶液，制备不同肝素 及AT活性含量的PCCs制品，因添加不同AT及肝素体积所导致的体积差， 加入适量超纯水弥补，最终体积均为250μl。制备不同肝素及AT活性含量的 PCCs制品分别标识为A、B、C、D，如表1所示。分别取所制备的不同AT 及肝素活性含量的PCCs制品50μl，加入96孔板中。以上操作均在2-4℃条 件下进行。

表1不同AT及肝素活性含量的PCCs制品

制品编号 AT活性含量(IU/ml) 肝素活性含量(IU/ml) A 0 0 B 0.4 5 C 0.8 0 D 0.8 2.5

(2)每孔加入6IU/ml人凝血酶50μl，均匀混合，室温放置2min。

(3)每孔加入0.6mg/ml的发色底物CS-01(38)溶液50μl，混合均匀，26℃ 水浴条件下孵育6min。

(4)酶标仪405nm波长读取吸光值(OD值)，40s测定1次，共5次， 200s。3次重复检测，取OD值平均值。

(5)以测定的OD值为纵坐标(y)，以时间(s)为横坐标(x)，绘制 OD值随时间变化曲线，并建立线性方程y＝kx+a。

(6)分别计算1/k值，即为不同肝素及AT含量PCCs的综合抗凝能力。

2.实验结果

线性方程如图1所示，抗凝能力结果如下表2所示：

表2不同肝素及AT含量的PCCs综合抗凝能力的测定

制品编号 线性方程k值 综合抗凝能力(1/k值) A 0.04 25.0000 B 0.0271 36.9004 C 0.0344 29.0698 D 0.0305 32.7869

由图1和表2对比可以看出：

1.A组PCCs未添加AT及肝素，而B、C、D组PCCs均添加了AT和/ 或肝素，它们的抗凝能力强于A组PCCs。

使用本发明检测方法检测发现，A组PCCs的抗凝能力为25.0000，而B、 C、D组PCCs抗凝能力分别为36.9004、29.0698和32.7869，均大于A组PCCs， 说明B、C、D组PCCs的抗凝能力强于A组PCCs，与预期结果一致。

2.D组PCCs比C组PCCs与多了2.5IU/ml的肝素，其抗凝能力强于C 组PCCs。

使用本发明检测方法检测发现，D组PCCs抗凝能力分别为32.7869，而 C组PCCs的抗凝能力为29.0698，说明D组PCCs的抗凝能力强于C组PCCs， 与预期结果一致。

实验结果说明，本发明方法可以准确检测PCCs制品的抗凝能力。

实验例2国内外不同PCCs制品综合抗凝能力的测定及比较

1.实验方法

(1)取4种国内外不同厂家的PCCs制品，标记为A、B、C、D。分别 按说明书充分溶解4种制品，2-4℃放置，取1ml，30min内用超纯水稀释FIX 活性浓度为1IU/ml。分别取70μl稀释后的PCCs，加入96孔板中。

(2)每孔加入5IU/ml人凝血酶70μl，均匀混合，室温放置1.5min。

(3)每孔加入0.55mg/ml的发色底物CS-01(38)溶液70μl，混合均匀， 25℃水浴条件下孵育5min。

(4)酶标仪405nm波长读取吸光值(OD值)，50s测定1次，共6次， 300s。3次重复检测，取OD值平均值。

(5)以测定的OD值为纵坐标(y)，以时间(s)为横坐标(x)，绘制 OD值随时间变化曲线，并建立线性方程y＝kx+a，如附图2所示。

(6)分别计算1/k值，即为PCCs的综合抗凝能力。A、B、C、D 4种 PCCs综合抗凝能力如表3所示。

2.实验结果

表3国内外4种不同PCCs制品综合抗凝能力的测定

制品编号 线性方程k值 综合抗凝能力(1/k值) A 0.0395 25.3165 B 0.0612 16.3399 C 0.0547 18.2815 D 0.0368 27.1739

由于国内外厂家制备PCCs的工艺有差异，其含有的促凝成分及抗凝成 分不相同，其综合抗凝能力应不相同。实验结果表3所示，A、B、C、D综 合抗凝能力分别为：25.3165、16.3399、18.2815、27.1739。

实验结果说明，本发明方法可以有效检测PCCs制品的抗凝能力。

综上，本发明方法可以有效检测人凝血酶原复合物的抗凝能力，操作简 便，成本低廉，应用前景良好。