枸杞多糖多元指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱

摘要

枸杞多糖多元指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱，属于中药和功能食品原料及其制品的指纹图谱技术领域。本发明包括枸杞的预处理、枸杞多糖的提取、UV标准指纹图谱的确定、HPSEC标准指纹图谱的确定、IR光谱指纹分析及其标准指纹图谱的确定、完全水解、水解产物衍生化、PCD-HPLC指纹分析及其标准指纹图谱的确定。16个不同产地和品种的枸杞的预处理、枸杞多糖的提取及其多元指纹图谱的构建方法同上，可同时分别操作。枸杞多糖多元指纹图谱的构建方法具有操作简单、稳定、灵敏、精密度高、重现性好等优点，能从色谱的整体特征面貌上把握构杞多糖质量情况及产地来源，为枸杞质量控制和真伪鉴别提供了新的科学方法。

说明书

技术领域

本发明涉及枸杞多糖四种指纹图谱的建立方法，分别是枸杞多糖UV、HPSEC、IR、PCD-HPLC指纹 图谱，本发明还涉及由此方法所得到的枸杞多糖标准指纹图谱。属于中药及其制品和功能食品原料及其制 品的指纹图谱技术领域。

背景技术

枸杞子为茄科植物枸杞的成熟果实，别名西枸杞、白刺、山枸杞、白疙针，简称枸杞，现代药理学研 究表明：枸杞具有补肾益精，养肝明目，补血安神，生津止渴，润肺止咳之功效，临床主要用于治疗肝肾 阴亏、腰膝酸软、头晕目眩、目昏多泪和虚劳咳嗽等疾病。枸杞多糖是其发挥药理学作用的主要物质基础， 也是被研究最多的化学成分之一，具有免疫调节，抗氧化，神经保护，降血糖，抗肿瘤等作用。近年已将 枸杞和枸杞多糖开发成为多种保健功能食品，如枸杞汁、枸杞胶囊、枸杞咀嚼片、枸杞多糖口服液、枸杞 果酒等。

多糖是一类由广泛存在于自然界的生物体产生的独特的生物高分子，是生物体内除蛋白质和核酸以外 的又一类重要的信息分子，具有多种特殊的且在大多数情况下相当复杂的化学结构，主要表现在：组成多 糖的单糖种类、连接位点多，分支结构、糖基的排列顺序、糖苷键构型非常复杂，例如4种不同的单糖可 形成35560种四糖，而单一的化学分析法、仪器分析法难以识别一般多糖的多方面的结构特征。研究表明： 枸杞多糖是一种蛋白结合杂多糖，结构复杂，由2-9种不同的单糖组成，相对分子量范围为8×10⁴-2×10⁶Da， 糖链中含有β-D-吡喃葡萄糖、α-D-吡喃甘露糖、α-D-吡喃半乳糖等单糖，而药典中仅采用含量测定法，并 不能表征和鉴别枸杞样品中多糖的实际质量优劣，急需建立一种快速可靠的指纹分析模型来识别和表征枸 杞多糖。指纹图谱分析法已成为国内外公认的鉴别中药品种和评价中药质量的最有效手段之一，可识别复 杂的天然产物，近年来，该法在分析中药材中小分子化合物的基础上，也被用于少数多糖的分析，如：灵 芝孢子粉多糖和铁皮石斛多糖，因此，可将指纹图谱技术用于枸杞多糖的分析。

目前关于枸杞指纹图谱相关的专利及文章包括：枸杞中甲醇粗提物、乙醇乙腈粗提物、黄酮类化合物、 甜菜碱和类胡萝卜素等小分子化合物的指纹图谱，而有关其主要功效成分的大分子枸杞多糖的指纹图谱的 构建尚未见报道。然而，枸杞多糖作为一种结构复杂的天然生物高分子，其科学全面的检测方法和质量标 准尚不完善，以至于枸杞、枸杞多糖及其相关产品质量参差不齐、难以控制和鉴别。为此，本发明针对枸 杞的主要功效成分多糖类物质，分别采用预处理-热水浸提-UV全波长扫描法、预处理-热水浸提-高效分子 排阻色谱法、预处理-热水浸提-红外光谱检测法和预处理-热水浸提-完全酸水解-PMP柱前衍生反相HPLC 法，对不同产地枸杞样品中的多糖的结构特征指标进行分析表征和比较，确定共有特征峰，建立枸杞多糖 的标准指纹图谱。本发明可为我国枸杞和枸杞多糖的质量检测方法和质量标准的提升及完善提供科学依据 与参考，从而促进我国枸杞类产品的质量提高和稳定，更好地规范枸杞市场，维护消费者权益，造福于国 人的身体健康。

发明内容

本发明的目的是提供枸杞多糖的四种指纹图谱的构建方法，可将枸杞多糖多元指纹图谱作为枸杞类、 枸杞多糖类产品的质量控制和真伪鉴别的主要指标之一。同时，本发明还提供了枸杞多糖的四种标准指纹 图谱。

本发明的技术方案：枸杞多糖多元指纹图谱的建立方法包括下列步骤：

1、枸杞的预处理

准确称取枸杞子120g，均匀平铺于瓷盘中，60℃烘6h使其完全干燥，将枸杞子干品用粉碎机粉碎， 计重M₁g。将M₁g枸杞粉置于1000mL烧瓶中，加入3倍体积80％乙醇，85℃回流2h，冷却，抽干弃 去溶剂后置于1000mL烧瓶中，加入2.25倍体积80％乙醇，85℃回流2h，冷却，抽干弃去溶剂，烘干， 计重M₂g。将M₂g乙醇处理后样品置于索氏提取器中，加入6倍体积氯仿甲醇(氯仿∶甲醇＝2∶1)混合溶液， 70℃回流脱脂4h，抽干弃去溶剂，干燥，得脱脂后枸杞粗粉M₃g。

2、枸杞多糖的提取

将M₃g枸杞粗粉置于烧杯中，按料液比1∶15加入蒸馏水，80℃提取3次，每次2h，将水提液合并， 过滤。减压蒸发浓缩至水提液总体积的1/5，4000rpm离心5min除去杂质，加入4倍体积工业乙醇醇沉 10h。4000rpm离心10min得到沉淀，沉淀依次用无水乙醇、丙酮洗涤后真空干燥，得枸杞多糖粗品cLBP。

3、枸杞多糖UV标准指纹图谱的确定

精密称取烘干至恒重的cLBP 10.0mg置于10mL容量瓶，以蒸馏水溶解并定容至10mL得1mg/mL 多糖溶液，于200～400nm区间进行扫描得到枸杞多糖紫外全波长扫描光谱图。

16个不同产地、不同品种枸杞多糖的UV指纹图谱如图1所示。

对16个UV指纹图谱使用中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2004A)处理，得到枸杞多糖标准UV 指纹图谱，如图2所示。

4、枸杞多糖HPSEC标准指纹图谱的确定

精密称取烘干至恒重的cLBP 10.0mg置于2mL容量瓶，以去离子水溶解并定容至2mL得5mg/mL 多糖溶液，用0.45μm微孔膜过滤后供HPLC进样分析，得到枸杞多糖的HPSEC指纹图谱，再使用中药 色谱指纹图谱相似度评价软件(2004A)处理图谱，得到枸杞多糖HPSEC标准指纹图谱。HPLC分析条件 为：仪器：岛津LC-20AT高效液相色谱仪；色谱柱：KS-805糖分析色谱柱；流动相：去离子水；柱温： 30℃；检测器：RID-10A示差检测器；流速：1.0mL/min；进样体积：20μL。

16个不同产地、不同品种枸杞多糖的HPSEC指纹图谱如图3所示。

对16个HPSEC指纹图谱使用中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2004A)处理，得到枸杞多糖标准 HPSEC指纹图谱，如图4所示。

5、枸杞多糖IR指纹分析

傅立叶变换红外光谱仪检测条件：仪器：BRUKER-MPA型红外光谱仪；方法：样品和KBr以1∶100 混合研磨压片，样品约2.0mg，KBr约200mg，研磨取样；检测波数：4000～500cm^-1。在此条件下得到 枸杞多糖的IR指纹图谱。

16个不同产地、不同品种枸杞多糖的IR指纹图谱如图5所示。

6、枸杞多糖IR标准指纹图谱的确定及相似度分析

比较16个不同产地、不同品种的枸杞多糖样品IR光谱图，确定其共有特征峰为18个，所述的18个 共有特征峰的波数λ^-1(cm^-1)的相对标准偏差RSD均小于2％，即：

1号峰平均λ^-1为535.1，RSD为0.22％；

2号峰平均λ^-1为621.4，RSD为0.61％；

3号峰平均λ^-1为668.4，RSD为0.03％；

4号峰平均λ^-1为771.5，RSD为0.70％；

5号峰平均λ^-1为831.2，RSD为0.08％；

6号峰平均λ^-1为918.0，RSD为0.37％；

7号峰平均λ^-1为1018.9，RSD为0.19％；

8号峰平均λ^-1为1050.0，RSD为0.14％；

9号峰平均λ^-1为1078.3，RSD为0.15％；

10号峰平均λ^-1为1103.4，RSD为0.22％；

11号峰平均λ^-1为1144.6，RSD为0.12％；

12号峰平均λ^-1为1245.6，RSD为0.55％；

13号峰平均λ^-1为1328.5，RSD为0.33％；

14号峰平均λ^-1为1417.2，RSD为0.08％；

15号峰平均λ^-1为1610.9，RSD为0.05％；

16号峰平均λ^-1为1746.8，RSD为0.16％；

17号峰平均λ^-1为2933.4，RSD为0.06％；

18号峰平均λ^-1为3355.6，RSD为0.40％；

枸杞多糖的IR标准指纹图谱如图6所示。

运用中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2004A)处理图谱，得到枸杞多糖IR标准指纹图谱。再分别 使用夹角余弦法和相关系数法计算不同样品间的相似度(1800-600cm^-1范围内的特征峰吸收值)。相似度 评价结果表明：夹角余弦法相似度范围为0.9310～1.0000，平均值为：0.9896；相关系数法相似度范围为 0.8612-1.0000，平均值为0.9746，则16个不同产地、不同品种枸杞多糖的相似度较高。

7、枸杞多糖的完全水解

称取cLBP 10.0mg于安瓿瓶中，加入2mol/L的三氟乙酸1mL，封口，100℃水解8h，使用甲醇洗 涤水解液4次去除三氟乙酸，再加2mL超纯水溶解完全水解产物，备用。

8、枸杞多糖完全水解产物的PMP衍生化反应

取步骤7完全水解后超纯水溶解的水解产物100μL，加入50μL的0.6mol/L NaOH，混合后加入100μL PMP甲醇溶液，混匀后放入烘箱，70℃反应100min，取出冷却后，加入100μL 0.3mol/L HCl，混匀后再 加入750μL的超纯水，用1mL三氯甲烷萃取过量的PMP，静置后取水层再加入1mL氯仿萃取，重复三 次，将水相用0.45μm微孔膜过滤后供HPLC进样分析。

9、衍生化产物反相HPLC指纹分析

反相HPLC分析条件为：岛津LC-20AT高效液相色谱仪；色谱柱：RP-C18(4.6mm×250mm，5μm， Waters，USA)；流动相：pH 6.7的0.1mol/L磷酸盐缓冲液-乙腈，磷酸盐缓冲液∶乙腈体积比为84∶16；柱 温：30℃；检测波长：250nm；流速：1.0mL/min；进样体积：40μL；在此条件下进样分析步骤8过滤后 的PMP衍生化产物，得到枸杞多糖的PCD-HPLC指纹图谱。

16个不同产地、不同品种枸杞多糖的PCD-HPLC指纹图谱如图7所示。

10、PCD-HPLC标准指纹图谱的确定及相似度分析

通过16个不同产地、不同品种的枸杞样品中多糖完全水解产物的PMP衍生物的高效液相色谱测定， 比较其色谱图，确定共有特征峰为9个：所述的9个共有特征峰以半乳糖醛酸峰为参照的相对保留时间RT 的相对标准偏差RSD均小于2％：即：

1号峰平均RT为0.536，RSD为0.74％；

2号峰平均RT为0.702，RSD为0.58％；

3号峰平均RT为0.762，RSD为0.75％；

4号峰平均RT为0.872，RSD为0.23％；

5号峰平均RT为1.000，RSD为0；

6号峰平均RT为1.197，RSD为0.26％；

7号峰平均RT为1.381，RSD为0.22％；

8号峰平均RT为1.476，RSD为0.37％；

9号峰平均RT为1.530，RSD为0.20％；

其中超过总峰面积5％的指纹峰有4个，分别为：5号峰半乳糖醛酸，峰面积比为12.77％-36.58％；6 号峰葡萄糖，峰面积比为7.91％-18.60％；7号峰半乳糖，峰面积比为11.17％-22.81％；9号峰阿拉伯糖， 峰面积比为25.10％-35.25％。

枸杞多糖的PCD-HPLC标准指纹图谱如图8所示。

其中1号峰、2号峰、3号峰、4号峰、5号峰、6号峰、7号峰、8号峰、9号峰分别对应为甘露糖、 核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖；这些单糖是根据与枸杞多 糖样品分析条件相同的单糖混合标准溶液的PCD-HPLC的保留时间对照定性；单糖混标溶液的柱前衍生化 反应同步骤8，将步骤8中“取步骤7完全水解后超纯水溶解的水解产物”改为“取单糖混合标准溶液”， 该单糖混标溶液中核糖浓度为68mmol/L，其余各单糖浓度均为16mmol/L。

运用中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2004A)处理图谱，得到枸杞多糖PCD-HPLC标准指纹图谱。 再分别使用夹角余弦法和相关系数法计算不同样品间的相似度。相似度评价结果表明：夹角余弦法相似度 范围为0.8432～1.0000，平均值为：0.9705；相关系数法相似度范围为0.6888-1.0000，平均值为0.9419，则 16个不同产地、不同品种枸杞多糖的相似度较高。

有益效果

1、本发明分别利用紫外全波长扫描法和高效分子排阻色谱法，确定枸杞多糖UV和HPSEC标准指纹 图谱，可以直接或辅助鉴别枸杞和枸杞多糖类产品的真伪，操作简便、快速、易于掌握，避免了传统方法 因必须进行多步分离纯化和多种波谱手段分析而带来的耗时、费力、成本高、无法快速检测的缺陷。

2、本发明利用傅里叶变换红外光谱技术，确定枸杞多糖IR标准指纹图谱，灵敏度较高，非糖类物质 干扰较小，能够从结构上把握枸杞多糖的质量情况及产地来源，为枸杞和枸杞多糖类产品的质量控制和真 伪鉴别提供一种识别性更强、灵敏度更高的方法。

3、因多糖的活性与其单糖组成、糖苷键连接方式、分支状况等一级结构特征有关，而在一定条件下， 多糖的完全水解产物即单糖的种类和相对量以及多糖的红外光谱测定结果均随一级结构的不同而有所差 异，故通过测定枸杞多糖红外指纹图谱以及其完全水解产物的PCD-HPLC指纹图谱，能有效地表征枸杞和 枸杞多糖类产品的质量从而弥补目前枸杞和枸杞类产品的质量标准和检测方法中，对于多糖仅测定粗多糖 含量而无法鉴别其质量优劣和真伪的严重缺陷。

4、本发明将枸杞多糖的完全水解产物进行PMP衍生化反应后进行反相HPLC分析，用紫外检测器检 测、灵敏度较高，非糖类物质干扰较小，方法稳定，精密度高，易于掌握，避免了传统方法因必须进行多 步分离纯化和多种波谱手段分析而带来的耗时、费力、成本高、无法快速检测的缺陷。

5、相比于铁皮石斛多糖和灵芝孢子粉多糖建立的单一指纹图谱，本发明建立的枸杞多糖多元指纹图 谱(UV、HPSEC、IR和PCD-HPLC指纹图谱)，从多糖结构分析的角度，更加科学全面的反映了多糖的 结构特征，提高了枸杞多糖检测和鉴别的准确性。

6、对于枸杞类产品，枸杞多糖类物质是其主要的功效成分，故用枸杞的多糖成分作为监控指标具有 代表性。而枸杞中多糖是由多种不同多糖组分构成的混合物，它们的极性较强，结构相近，多呈分散性， 故难以像小分子那样可以高分辨、高选择性地进行直接色谱分离分析。本发明不仅确定了枸杞多糖的UV 和IR标准指纹图谱，还将枸杞多糖完全水解后衍生化在反相HPLC柱上分离，确定PCD-HPLC标准指纹 图谱，且分离度和峰形均较好，因而可以有效地进行指纹图谱分析。可根据各个指纹特征峰的相对保留值、 峰面积比及相似度，从色谱的整体特征面貌上把握枸杞多糖的质量情况及产地来源，为枸杞类、枸杞多糖 类产品的质量控制和真伪鉴别提供一种科学的新方法。

附图说明

图1为16个不同产地、不同品种枸杞多糖的UV指纹图谱

图2枸杞多糖的UV标准指纹图谱

图3为16个不同产地、不同品种枸杞多糖的HPSEC指纹图谱

图4枸杞多糖的HPSEC标准指纹图谱

图5为16个不同产地、不同品种枸杞多糖的IR指纹图谱

图6枸杞多糖的IR标准指纹图谱

图7为16个不同产地、不同品种枸杞多糖的PCD-HPLC指纹图谱

图8枸杞多糖的PCD-HPLC标准指纹图谱

共有特征峰分别为：1-Man，2-Rib，3-Rha，4-GlcUA，5-GalUA，6-Glc，7-Gal，8-Xyl，9-Ara

图9为13种单糖对照品PCD-HPLC图谱

图10为宁夏某地区宁杞7号枸杞多糖溶液的紫外全波长扫描图谱

图11为宁夏某地区宁杞7号枸杞多糖溶液的HPSEC图谱

图12为宁夏某地区宁杞7号枸杞多糖的IR测定图谱

图13为宁夏某地区宁杞7号枸杞多糖的PCD-HPLC图谱

各峰分别为：1-Man，2-Rib，3-Rha，4-GlcUA，5-GalUA，6-Glc，7-Gal，8-Xyl，9-Ara

图14为山西某地区枸杞多糖溶液的紫外全波长扫描图谱

图15为山西某地区枸杞多糖溶液的HPSEC图谱

图16为山西某地区枸杞多糖的IR测定图谱

图17为山西某地区枸杞多糖的PCD-HPLC图谱

各峰分别为：1-Man，2-Rib，3-Rha，4-GlcUA，5-GalUA，6-Glc，7-Gal，8-Xyl，9-Ara

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，下述实施例仅用于说明本发明而非对本发明的限制。

实施例1、枸杞多糖多元指纹图谱的建立方法

1、仪器、试剂及样品

1.1仪器

岛津UV-2401PC紫外可见分光光度计

BRUKER-MPA型红外光谱仪

岛津LC-20AT高效液相色谱仪，配有二极管阵列检测器(DAD)和岛津色谱工作站。

1.2试剂：

1.3枸杞原料：

16个批次枸杞原料分别来自宁夏、新疆、青海、河南、河北、甘肃、陕西等不同产地。

2、枸杞的预处理

准确称取枸杞子120g，均匀平铺于瓷盘中，60℃烘6h使其完全干燥，将枸杞子干品用粉碎机粉碎， 计重M₁g。将M₁g枸杞粉置于1000mL烧瓶中，加入3倍体积80％乙醇，85℃回流2h，冷却，抽干弃 去溶剂后置于1000mL烧瓶中，加入2.25倍体积80％乙醇，85℃回流2h，冷却，抽干弃去溶剂，烘干， 计重M₂g。将M₂g乙醇处理后样品置于索氏提取器中，加入6倍体积氯仿甲醇(氯仿∶甲醇＝2∶1)混合溶液， 70℃回流脱脂4h，抽干弃去溶剂，干燥，得脱脂后枸杞粗粉M₃g。

3、枸杞多糖的提取

将M₃g枸杞粗粉置于烧杯中，按料液比1∶15加入蒸馏水，80℃提取3次，每次2h，将水提液合并， 过滤。减压蒸发浓缩至水提液总体积的1/5，4000rpm离心5min除去杂质，用4倍体积工业乙醇醇沉10h。 4000rpm离心10min得到沉淀，沉淀依次用无水乙醇、丙酮洗涤后真空干燥，得枸杞多糖粗品cLBP。

4、枸杞多糖UV标准指纹图谱的建立

精密称取烘干至恒重的cLBP 10.0mg置于10mL容量瓶，以蒸馏水溶解并定容至10mL得1mg/mL 多糖溶液，于200～400nm区间进行扫描得到枸杞多糖紫外全波长扫描光谱图，16个不同产地、不同品种 枸杞多糖的UV指纹图谱如图1所示。使用中药色谱指纹图谱相似度评价软件处理图谱，得到枸杞多糖标 准指纹图谱如图2所示。

5、枸杞多糖HPSEC标准指纹图谱的建立

精密称取烘干至恒重的cLBP 10.0mg置于2mL容量瓶，以去离子水溶解并定容至2mL得5mg/mL 多糖溶液，用0.45μm微孔膜过滤后供HPLC进样分析，得到枸杞多糖的HPSEC指纹图谱，再使用中药 色谱指纹图谱相似度评价软件(2004A)处理图谱，得到枸杞多糖HPSEC标准指纹图谱。16个不同产地、 不同品种枸杞多糖的UV指纹图谱如图3所示。使用中药色谱指纹图谱相似度评价软件处理图谱，得到枸 杞多糖标准指纹图谱如图4所示。HPLC分析条件为：仪器：岛津LC-20AT高效液相色谱仪；色谱柱：KS-805 糖分析色谱柱；流动相：去离子水；柱温：30℃；检测器：RID-10A示差检测器；流速：1.0mL/min；进 样体积：20μL。

6、枸杞多糖IR分析

傅立叶变换红外光谱仪检测条件：仪器：BRUKER-MPA型红外光谱仪；方法：样品和KBr以1∶100 混合研磨压片，样品约2.0mg，KBr约200mg，研磨取样；检测波数：4000～500cm^-1。在此条件下得到枸 杞多糖的IR指纹图谱，16个不同产地、不同品种枸杞多糖的IR指纹图谱如图5所示。

7、枸杞多糖IR标准指纹图谱的建立及共有指纹峰的特征

比较16个不同产地、不同品种的枸杞多糖样品的IR光谱图，确定其共有特征峰为18个，所述的18 个共有特征峰的波数λ^-1的相对标准偏差RSD均小于2％，且枸杞多糖IR的特征吸收峰在1800～1200cm^-1， 1100～1000cm^-1和900～600cm^-1波数范围内。

枸杞多糖的IR标准指纹图谱如图6所示。

16个不同产地、不同品种的枸杞多糖IR指纹图谱共有特征峰的波数λ^-1及其RSD值见表1。

表1枸杞多糖IR指纹图谱共有特征峰的波数及其RSD值

运用中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2004A)处理图谱，得到枸杞多糖IR标准指纹图谱。再分别 使用夹角余弦法和相关系数法计算不同样品间的相似度(1800-600cm^-1范围内的特征峰吸收值)。相似度 评价结果表明：夹角余弦法相似度范围为0.9310～1.0000，平均值为：0.9896；相关系数法相似度范围为 0.8612-1.0000，平均值为0.9746，则16个不同产地、不同品种枸杞多糖的相似度较高。

16个枸杞多糖IR指纹图谱相似度见表2，表中上三角为夹角余弦法相似度计算结果，下三角为相关 系数法相似度计算结果。

表2枸杞多糖样品IR指纹图谱相似度

8、枸杞多糖的完全水解

称取cLBP 10.0mg于安瓿瓶中，加入2mol/L的三氟乙酸1mL，封口，100℃水解8h，使用甲醇洗 涤水解液4次去除三氟乙酸，再加2mL超纯水溶解完全水解产物，备用。

9、枸杞多糖完全水解产物的PMP衍生化反应

取水解后的样品液(或混合单糖标准液)100μL，加入50μL的0.6mol/L NaOH，混合后加入100μL PMP甲醇溶液，混匀后放入烘箱，70℃反应100min，取出冷却后，加入100μL 0.3mol/L HCl，混匀后再 加入750μL的超纯水，用1mL三氯甲烷萃取过量的PMP，静置后取水层再加入1mL氯仿萃取，重复三 次，将水相用0.45μm微孔膜过滤后供HPLC进样分析。

10、PMP衍生化产物的反相HPLC色谱分析

反相HPLC分析条件为：仪器：岛津LC-20AT高效液相色谱仪；色谱柱：RP-C18(4.6mm×250mm，5 μm，Waters，USA)；流动相：pH6.7的0.1mol/L磷酸盐缓冲液-乙腈，磷酸盐缓冲液∶乙腈体积比为84∶16； 柱温：30℃；检测波长：250nm；流速：1.0mL/min；进样体积：40μL；在此条件下进样分析单糖混合标 样和样品的PMP衍生化产物，得到混合标样色谱图(图9)和枸杞多糖样品的PCD-HPLC指纹图谱(图7)。 以半乳糖醛酸为参照，计算标样和样品中各峰的相对保留时间；根据标样和样品的相对保留时间对照定性 枸杞多糖的相关色谱峰；并以峰面积归一化法计算样品图谱各峰的峰面积比。

11、PCD-HPLC标准指纹图谱的建立及共有指纹峰的特征

通过16个不同产地、不同品种的枸杞样品中多糖完全水解产物的PMP衍生物的高效液相色谱测定， 比较其色谱图，确定共有特征峰为9个，所述的9个共有特征峰以半乳糖醛酸峰为参照的相对保留时间RT 的相对标准偏差RSD均小于2％；其中超过总峰面积5％的指纹峰有4个，分别为：5号峰半乳糖醛酸，峰 面积比为12.77％-36.58％；6号峰葡萄糖，峰面积比为7.91％-18.60％；7号峰半乳糖，峰面积比为 11.17％-22.81％；9号峰阿拉伯糖，峰面积比为25.10％-35.25％。

枸杞多糖的PCD-HPLC标准指纹图谱如图8所示。

16个不同产地、不同品种的枸杞多糖样品PCD-HPLC指纹图谱共有特征峰的相对保留时间及峰面积 比范围见表3。

表3枸杞多糖PCD-HPLC指纹图谱共有特征峰的相对保留时间和峰面积比范围

运用中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2004A)处理图谱，得到枸杞多糖PCD-HPLC标准指纹图谱。 再分别使用夹角余弦法和相关系数法计算不同样品间的相似度。相似度评价结果表明：夹角余弦法相似度 范围为0.8432～1.0000，平均值为：0.9705；相关系数法相似度范围为0.6888-1.0000，平均值为0.9419，则 16个不同产地、不同品种枸杞多糖的相似度较高。

16个不同产地、不同品种的枸杞多糖PCD-HPLC指纹图谱的相似度见表4，表中上三角为夹角余弦法 相似度计算结果，下三角为相关系数法相似度计算结果。

表4枸杞多糖PCD-HPLC指纹图谱相似度

实施例2、宁夏某产地宁杞7号枸杞多糖样品的多元指纹图谱分析

1、枸杞的预处理

准确称取枸杞子120g，均匀平铺于瓷盘中，60℃烘6h使其完全干燥，将枸杞子干品用粉碎机粉碎， 计重117g。将117g枸杞粉置于1000mL烧瓶中，加入351mL 80％乙醇，85℃回流2h，冷却，抽干弃 去溶剂，置于1000mL烧瓶中，加入263mL 80％乙醇，85℃回流2h，冷却，抽干弃去溶剂，烘干，计重 53g。将53g样品置于索氏提取器中，加入318mL氯仿甲醇(氯仿∶甲醇＝2∶1)混合溶液，70℃回流脱脂4h， 抽干弃去溶剂，干燥，得脱脂后枸杞粗粉51g。

2、枸杞多糖的提取

将51g枸杞粗粉置于烧杯中，加入765mL蒸馏水，80℃提取3次，每次2h，将水提液合并，过滤。 减压蒸发浓缩至水提液总体积的1/5，4000rpm离心5min去除杂质，用4倍体积工业乙醇醇沉10h。4000 rpm离心10min得到沉淀，沉淀依次用无水乙醇、丙酮洗涤后真空干燥，得枸杞多糖粗品cLBP 5.1960g。

3、枸杞多糖UV指纹分析及与标准指纹图谱的比较

精密称取烘干至恒重的cLBP 10.0mg置于10mL容量瓶，以蒸馏水溶解并定容至10mL得1mg/mL 多糖溶液，于200～400nm区间进行扫描得到枸杞多糖紫外全波长扫描光谱图。枸杞多糖溶液紫外全波长 扫描在200-220nm和260-280nm处有吸收，且在210nm处吸收值最大，该样品的指纹图谱与UV标准指 纹图谱相似，具有UV标准指纹图谱特征。

宁杞7号枸杞多糖的UV指纹图谱如图10所示。

4、枸杞多糖HPSEC指纹分析及与标准指纹图谱的比较

精密称取烘干至恒重的cLBP 10.0mg置于2mL容量瓶，以去离子水溶解并定容至2mL得5mg/mL 多糖溶液，用0.45μm微孔膜过滤后供HPLC进样分析，得到枸杞多糖的HPSEC指纹图谱。枸杞多糖溶 液在5.00-12.50min间有吸收，该样品的指纹图谱与HPSEC标准指纹图谱相似，具有HPSEC标准指纹图 谱特征。HPLC分析条件为：仪器：岛津LC-20AT高效液相色谱仪；色谱柱：KS-805糖分析色谱柱；流 动相：去离子水；柱温：30℃；检测器：RID-10A示差检测器；流速：1.0mL/min；进样体积：20μL。

宁杞7号枸杞多糖的HPSEC指纹图谱如图11所示。

5、枸杞多糖IR指纹分析

傅立叶变换红外光谱仪检测条件：仪器：BRUKER-MPA型红外光谱仪；方法：样品和KBr以1∶100 混合研磨压片，样品约2.0mg，KBr约200mg，研磨取样；检测波数：4000～500cm^-1。在此条件下得到 宁杞7号枸杞多糖的IR指纹图谱。

宁杞7号枸杞多糖的IR指纹图谱如图12所示。

6、与IR标准指纹图谱比较

对照标准指纹图谱，该指纹图谱中含有18个共有特征峰：1-18号特征峰的波数分别为：3338.5，2931.9， 1745.7，1610.7，1416.1，1333.6，1245.2，1144.9，1103.7，1078.0，1051.0，1018.9，921.0，831.5，765.3， 668.6，626.6，535.9cm^-1，在枸杞多糖IR标准指纹图谱特征吸收峰范围内，该样品的指纹图谱与IR标准 指纹图谱相似，具有IR标准指纹图谱特征。

7、枸杞多糖的完全水解

称取宁杞7号cLBP10.0mg于安瓿瓶中，加入2mol/L的三氟乙酸1mL，封口，于100℃水解8h， 使用甲醇洗涤水解液4次去除三氟乙酸，再加2mL超纯水溶解完全水解产物，备用。

8、枸杞多糖完全水解产物的PMP衍生化反应

取宁杞7号完全水解产物100μL，加入50μL的0.6mol/L NaOH，混合后加入100μL PMP甲醇溶液， 混匀后放入烘箱，70℃反应100min，取出冷却后，加入100μL 0.3mol/L HCl，混匀后再加入750μL的超 纯水，用1mL三氯甲烷萃取过量的PMP，静止后取水层再加入1mL氯仿萃取，重复三次，将水相用0.45 μm微孔膜过滤后供HPLC进样分析。

9、衍生化产物反相HPLC指纹分析

反相HPLC分析条件为：岛津LC-20AT高效液相色谱仪；色谱柱：RP-C18(4.6mm×250mm，5μm， Waters，USA)；流动相：pH6.7的0.1mol/L磷酸盐缓冲液-乙腈，磷酸盐缓冲液∶乙腈体积比为84∶16；柱 温：30℃；检测波长：250nm；流速：1.0mL/min；进样体积：40μL；在此条件下进样分析过滤后的PMP 衍生化产物，得到枸杞多糖的PCD-HPLC指纹图谱。

宁杞7号枸杞多糖的PCD-HPLC指纹图谱如图13所示。

10、与PCD-HPLC标准指纹图谱比较

对照标准指纹图谱，该指纹图谱中含有9个共有特征峰，其中4个主要色谱峰的相对保留时间(以半 乳糖醛酸为参照)和峰面积比分别为：5号峰相对保留时间为29.716，峰面积比为30.96％；6号峰相对保 留时间为35.490，峰面积比为14.10％；7号峰相对保留时间为41.005，峰面积比为17.40％；9号峰相对保 留时间为45.450，峰面积比为25.10％。该样品的指纹图谱与PCD-HPLC标准指纹图谱相似，具有枸杞多 糖PCD-HPLC标准指纹图谱特征。

实施例3、山西某产地枸杞多糖样品的多元指纹图谱分析

1、枸杞的预处理

准确称取枸杞子120g，均匀平铺于瓷盘中，60℃烘6h使其完全干燥，将枸杞子干品用粉碎机粉碎， 计重116.5g。将116.5g枸杞粉置于1000mL烧瓶中，加入350mL 80％乙醇，85℃回流2h，冷却，抽干 弃去溶剂后置于1000mL烧瓶中，加入262mL体积80％乙醇，85℃回流2h，冷却，抽干弃去溶剂，烘 干，计重48g。将48g样品置于索氏提取器中，加入288mL氯仿甲醇(氯仿∶甲醇＝2∶1)混合溶液，70℃回 流脱脂4h，抽干弃去溶剂，干燥，得脱脂后枸杞粗粉47g。

2、枸杞多糖的提取

将47g枸杞粗粉置于烧杯中，加入705mL蒸馏水，80℃提取3次，每次2h，将水提液合并，过滤。 减压蒸发浓缩至水提液总体积的1/5，4000rpm离心5min除去杂质，用4倍体积工业乙醇醇沉10h。4000 rpm离心10min得到沉淀，沉淀依次用无水乙醇、丙酮洗涤后真空干燥，得枸杞多糖粗品cLBP 4.7040g。

3、枸杞多糖UV指纹分析及与标准指纹图谱的比较

精密称取烘干至恒重的cLBP 10.0mg置于10mL容量瓶，以蒸馏水溶解并定容至10mL得1mg/mL 多糖溶液，于200～400nm区间进行扫描得到枸杞多糖紫外全波长扫描光谱图。枸杞多糖溶液紫外全波长 扫描在200-220nm和260-280nm处有吸收，且在211nm处吸收值最大，该样品的指纹图谱与UV标准指 纹图谱相似，具有UV标准指纹图谱特征。

山西枸杞多糖的UV指纹图谱如图14所示。

4、枸杞多糖HPSEC指纹分析及与标准指纹图谱的比较

精密称取烘干至恒重的cLBP 10.0mg置于2mL容量瓶，以蒸馏水溶解并定容至2mL得5mg/mL多 糖溶液，用0.45μm微孔膜过滤后供HPLC进样分析，得到枸杞多糖的HPSEC指纹图谱，枸杞多糖溶液 在5.00-12.50min处有吸收，该样品的指纹图谱与HPSEC标准指纹图谱相似，具有HPSEC标准指纹图谱 特征。HPLC分析条件为：仪器：岛津LC-20AT高效液相色谱仪；色谱柱：KS-805糖分析色谱柱；流动 相：去离子水；柱温：30℃；检测器：RID-10A示差检测器；流速：1.0mL/min；进样体积：20μL。

山西枸杞多糖的HPSEC指纹图谱如图15所示。

5、枸杞多糖IR指纹分析

傅立叶变换红外光谱仪检测条件：仪器：BRUKER-MPA型红外光谱仪；方法：样品和KBr以1∶100 混合研磨压片，样品约2.0mg，KBr约200mg，研磨取样；检测波数：4000～500cm^-1。在此条件下得到 山西枸杞多糖的IR指纹图谱。

山西枸杞多糖的IR指纹图谱如图16所示。

6、与IR标准指纹图谱比较

对照标准指纹图谱，该指纹图谱中含有11个共有特征峰：1-11号特征峰的波数分别为：3366.4，2929.5， 1627.7，1416.2，1324.2，1236.7，1079，829.8，779.3，616.9，535.7cm^-1，在枸杞多糖IR标准指纹图谱特 征吸收峰范围内，该样品的指纹图谱与IR标准指纹图谱具有一定的相似性，具有IR标准指纹图谱特征。 同时缺乏1744.8，1102.8，1019.3，1143.1，1052.0，1611.1，920.3cm^-1附近的吸收峰，与宁杞7号样品(实 施例2)有明显差异，具有地域特征。

7、枸杞多糖的完全水解

称取山西cLBP 10.0mg于安瓿瓶中，加入2mol/L的三氟乙酸1mL，封口，于100℃水解8h，使用 甲醇洗涤水解液4次去除三氟乙酸，再加2mL超纯水溶解完全水解产物，备用。

8、枸杞多糖完全水解产物的PMP衍生化反应

取山西完全水解产物100μL，加入50μL的0.6mol/L NaOH，混合后加入100μL PMP甲醇溶液，混 匀后放入烘箱，70℃反应100min，取出冷却后，加入100μL 0.3mol/L HCl，混匀后再加入750μL的超纯 水，用1mL三氯甲烷萃取过量的PMP，静止后取水层再加入1mL氯仿萃取，重复三次，将水相用0.45μm 微孔膜过滤后供HPLC进样分析。

9、衍生化产物反相HPLC指纹分析

反相HPLC分析条件为：岛津LC-20AT高效液相色谱仪；色谱柱：RP-C18(4.6mm×250mm，5μm， Waters，USA)；流动相：pH6.7的0.1mol/L磷酸盐缓冲液-乙腈，磷酸盐缓冲液∶乙腈体积比为84∶16；柱 温：30℃；检测波长：250nm；流速：1.0mL/min；进样体积：40μL；在此条件下进样分析过滤后的PMP 衍生化产物，得到枸杞多糖的PCD-HPLC指纹图谱。

山西枸杞多糖的PCD-HPLC指纹图谱如图17所示。

10、与PCD-HPLC标准指纹图谱比较

对照标准指纹图谱，该指纹图谱中含有9个共有特征峰，其中4个主要色谱峰的相对保留时间(以半 乳糖醛酸为参照)和峰面积比分别为：5号峰相对保留时间为29.597，峰面积比12.77％；6号峰相对保留 时间为35.282，峰面积比18.60％；7号峰相对保留时间为40.709，峰面积比17.46％；9号峰相对保留时间 为45.115，峰面积比33.77％。该样品的指纹图谱与PCD-HPLC标准指纹图谱相似，具有PCD-HPLC标准 指纹图谱特征。但是半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖四个峰的相对比例与宁杞7号样品(实施例 2)有明显差异，具有地域特征。