中国仓鼠卵巢细胞系

摘要

本发明人提供了一种中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，所述细胞与野生型中国仓鼠卵巢细胞相比能够实现更高的蛋白质唾液酸化，例如在存在功能性GnT 1的情况下，其中所述CHO细胞可通过以蓖麻凝集素I(RCA-I)选择来获得。

说明书

本申请为分案申请，其原申请的申请日为2009年9月18日，申 请号为200980146306.5(国际申请号PCT/SG2009/000348)，名称为“中 国仓鼠卵巢细胞系”。

引用2008年9月19日提交的流水号61/098,270的美国申请和2009 年6月3日提交的流水号61/183,647的美国申请，发明人宋(Song) 是这些申请的发明人。

前述申请、本申请和前述申请中(包括每件前述申请审查过程中) 引用或参考的每份文件(“申请和文章引用的文件”)，以及在每件前述申 请和文章中以及在申请和文章引用的任何文件中引用或提及的任何产品 的任何厂商说明书或目录，均藉此通过引用纳入本文。再者，本文中引 用的所有文件，本文引用的文件中引用或参考的所有文件，以及本文引 用或提及的任何产品的任何厂商说明书或目录，均藉此通过引用纳入本 文。通过引用纳入本文的文件或其中的任何教导均可用于实施本发明。 通过引用纳入本文的文件不等同于现有技术。

技术领域

本发明涉及生物技术和分子生物学领域。本发明具体涉及中国仓鼠 卵巢细胞系及其在重组蛋白表达中的用途。

背景技术

蛋白质可用于多种诊断的、药理学的、农业的、营养的和研究的 应用。由于生产蛋白质尤其是治疗性蛋白质成本高，因此在生产效率 或者蛋白质的功能和稳定性方面即使微小的提高仍可有价值。

蛋白质的功能和稳定性以及因此的效用可受到糖残基翻译后加至所 述蛋白质从而形成糖蛋白的影响。例如，将末端唾液酸残基加至附着于 糖蛋白的多糖通常会增加蛋白质在血液中的寿命，在某些情况下还会影 响溶解度、热稳定性、对蛋白酶攻击的抗性、抗原性和一些糖蛋白的比 活。参见例如Gu and Wang(1998),Biotechnol.and Bioeng.58(6):642-48； Morell et al.(1968),J.Biol.Chem.243(1):155-59。

由细胞系例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞产生的重组糖蛋白蛋白质 和药物主要由不同唾液酸化的同工型构成。唾液酸化不良的同工型具有 更短的循环半衰期，因此效能较低。

因此需要增加糖蛋白的唾液酸含量，特别是对于要用于药理学应用 的糖蛋白。事实上，生物技术领域中的主要研究焦点之一已经是如何增 加重组蛋白质药物的唾液酸化。

发明内容

根据本发明的第1方面，本发明人提供了中国仓鼠卵巢(CHO)细 胞，所述细胞与野生型中国仓鼠卵巢细胞相比能够实现更高的蛋白质唾 液酸化，其中所述CHO细胞通过以蓖麻(Ricinus communis)凝集素I (RCA-I)进行选择而获得。所述CHO细胞能够在存在功能性GnT 1 的情况下实现更高的唾液酸化。

所述CHO细胞可包含GnT 1基因突变。

GnT 1基因突变可包括一种或多种在GnT 1序列(GenBank登记号： AF343963)的规定位置的如下突变：(a)在位置1015处C转换成T；(b) 在位置1300处G颠换成C；(c)在位置638处A颠换成C；(d)在位 置784处C颠换成G；(e)在位置811处T颠换成A；(f)致使所编码 的氨基酸序列从位置236开始移码的在位置706处的插入；(g)在位置 1015处C转换成T；(h)在位置246处G转换成A；(i)在位置258处 G转换成A；(j)在位置859处A转换成T。

GnT 1基因可包含显示于SEQ ID NO:1中的GnT 1核酸序列。

所述CHO细胞可表达包含一种或多种在GnT 1序列(GenBank登 记号：AF343963)的规定位置的如下突变的GnT 1蛋白质：(a)在位置 434处Ala突变为Pro；(b)在位置213处Asp→Ala；(c)在位置262 处Arg→Gly；(d)在位置271处Trp→Arg；(e)由在编码GnT 1核 酸序列位置706处的插入导致的从位置236开始的移码；(f)在位置339 处Gln→STOP；(g)在位置82处Trp→STOP；(h)在位置86处 Trp→STOP；(i)在位置287Lys→STOP。

所述CHO细胞可表达如SEQ ID NO:2中所示的GnT 1蛋白质。

所述CHO细胞可包含编码目的蛋白质例如重组目的蛋白质的核 酸序列。所述目的蛋白质可包括促红细胞生成素(EPO)或干扰素-γ (IFN-γ)。

所述CHO细胞可包含编码功能性GnT 1的核酸序列。编码目的 蛋白质的核酸序列和编码功能性GnT 1的核酸序列可以包含在一个 表达载体中。

编码目的蛋白质的核酸序列和编码功能性GnT 1的核酸序列可 以被稳定地转染至所述CHO细胞中。

根据本发明的第2方面，提供了包含根据本发明第1方面的CHO 细胞的CHO细胞系。

所述CHO细胞系可包括JW152细胞系(根据布达佩斯条约以登 记号PTA-9657保藏于ATCC)、JW80细胞系、JW36细胞系、 KFC15002细胞系、KFC 15071细胞系、KFC5008细胞系、JW152 细胞系、KFC5026细胞系、KFC20011细胞系或KFC 15047细胞系。

可以使所述CHO细胞或CHO细胞系适应悬浮培养。

根据本发明的第3方面，本发明人提供了由根据本发明第1或2 方面的CHO细胞或CHO细胞系表达的重组蛋白质。

所述重组蛋白质可包括促红细胞生成素(EPO)或干扰素-γ (IFN-γ)。

所述重组蛋白质的pKa可为4或更小，3.5或更小，3或更小， 2.5或更小，或者2或更小，或者其Z-值可大于150，例如大于160， 大于170，大于180，例如大于190，大于200，大于210，例如大于 220或大于230，或者以上两种情况同时满足。

本发明的第4方面提供了表达重组蛋白质的方法，所述方法包括 将编码所述蛋白质的核酸导入上文列出的CHO细胞，使所述蛋白质 从所述CHO细胞或其后代表达，并任选地纯化所述蛋白质。

所述方法可包括将编码功能性GnT 1的核酸导入所述CHO细 胞。

所述方法可包括导入包含编码所述蛋白质的核酸序列和编码功 能性GnT 1的核酸序列的表达载体。

所述方法可包括稳定地转染编码目的蛋白质的核酸序列和编码 功能性GnT 1的核酸序列。

根据本发明的第5方面，本发明人提供了包含以下序列的核酸： SEQ ID NO:1中所示的序列，或包含GnT 1序列和表D1第2列所 列突变的序列，或者其变体、同源物、衍生物或片段。

在第6方面中，本发明提供了包含以下序列的多肽：如SEQ ID  NO:2中所示的序列，或包含GnT 1序列和表D1第3列所列突变的 序列，或者其变体、同源物、衍生物或片段。

在本发明第7方面中，提供了提供CHO细胞或细胞系的方法， 所述方法包括在存在蓖麻凝集素I(RCA-I)的情况下培养CHO细胞， 并选择培养中存活的细胞。

所述方法可包括在存在蓖麻凝集素I(RCA-I)的情况下培养CHO 细胞，并选择培养中存活的细胞。

所述方法可包括将所述CHO细胞暴露于浓度为0.1μg/ml至100 μg/ml，例如上至50μg/ml或上至20μg/ml，例如10μg/ml或5μg/ml 的RCA-I。

所述方法可包括将所述CHO细胞暴露于RCA-I达1小时、数小 时(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12小时)、过夜，至 数日例如2天或3天，例如过夜。

所述方法还可包括，选择在凝集试验中不与RCA-I反应的细胞。

根据本发明的第8方面，本发明人提供了可通过上文列出的方法 得到的CHO细胞或CHO细胞系。

除非另外指出，否则本发明的实施将运用化学、分子生物学、微 生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些是本领域普通技术人 员的能力所能及的。这些技术在文献中有说明。例如，参见J. Sambrook,E.F.Fritsch,and T.Maniatis,1989,Molecualr Cloning： A Laboratory Manual,Second Edition,Books 1-3,Cold Spring Harbor  Laboratory Press；Ausubel,F.M.et al.(1995and periodic supplements；Current Protocols in Molecular Biology,ch.9,13,and 16, John Wiley&Sons,New York,N.Y.)；B.Roe,J.Crabtree,and A. Kahn,1996,DNA Isolation and Sequencing：Essential Techniques, John Wiley&Sons；J.M.Polak and James O’D.McGee,1990,In Situ  Hybridization：Principles and Practice；Oxford University Press；M.J. Gait(Editor),1984,Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach, Irl Press；D.M.J.Lilley and J.E.Dahlberg,1992,Methods of  Enzymology：DNA Structure Part A：Synthesis and Physical Analysis  of DNA Methods in Enzymology,Academic Press；Using Antibodies： A Laboratory Manual：Portable Protocol NO.I by Edward Harlow, David Lane,Ed Harlow(1999,Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-544-7)；Antibodies：A Laboratory Manual by Ed  Harlow(Editor),David Lane(Editor)(1988,Cold Spring Harbor  Laboratory Press,ISBN 0-87969-314-2),1855.Handbook of Drug  Screening,edited by Ramakrishna Seethala,Prabhavathi B. Fernandes(2001,New York,NY,Marcel Dekker,ISBN 0-8247-0562-9)；和Lab Ref：A Handbook of Recipes,Reagents,and  Other Reference Tools for Use at the Bench,Edited Jane Roskams  and Linda Rodgers,2002,Cold Spring Harbor Laboratory,ISBN 0-87969-630-3。这些通用文本的每一篇都通过引用的方式纳入本文。

附图说明

图1的照片显示，在JW152细胞系中短暂表达的促红细胞生成素 (EPO)对内切糖苷酶H(Endo H)处理是敏感的。短暂表达的EPO 的蛋白质印迹：来自CHO K-1细胞(第1道)、来自JW152细胞(第2 道)、经内切糖苷酶H处理的来自CHO-K1的EPO(第3道)、经内切 糖苷酶H处理的来自JW152的EPO(第4道)。JW152表达的EPO对 Endo H处理敏感，这表明存在于EPO分子上的聚糖结构为高甘露糖型。 因此怀疑来自糖基化通路的前期部分的基因有缺陷。

图2的照片显示，JW152细胞缺少功能性GnT I基因。通过IEF/ 蛋白质印迹测定来分析重组EPO。最左侧的道(CHO WT)显示作为对 照的野生型CHO细胞表达的EPO。第二道显示由JW152细胞产生的 EPO。通过比较两条道，可明显看出JW152细胞中的糖基化不完全。对 于补偿试验，将多个糖基化相关基因(如标明的)中的每一个与EPO构 建体共转染至JW152细胞中。仅GnT I能够补偿JW152细胞中的遗传 缺陷，表明这些细胞缺乏功能性GnT I基因。来自该IEF结果的另一非 常重要的现象是，在存在GnT I的情况下，JW152细胞比野生型细胞对 EPO的唾液酸化好得多。

图3的照片显示，以GnT I共转染后，在JW152而非CHO-K1中 观察到了唾液酸化的提高。CHO-K1、共表达GnT I的CHO-K1中产生 的EPO的唾液酸化模式。JW152细胞中和共表达GnT I的JW152细胞 中产生的EPO。共表达以及不共表达GnT I的CHO-K1的EPO唾液酸 化模式似乎相同，因此，GnT I的过表达不是第4道中所见的唾液酸化 提高的原因。结果表明，在存在GnT I的情况下，JW152细胞比野生型 细胞对重组蛋白质的唾液酸化好得多。以神经氨酸酶——其可切掉唾液 酸——处理样品可导致酸性区中的EPO带在切掉唾液酸后缩减至碱性 区，表明更高唾液酸化形式的EPO的确集中在所述凝胶的酸性区中。

图4的照片显示，在存在功能性GnT I的情况下，以前公开的Lec 1 突变体(具有GnT I缺陷)的EPO表达显示也是高度唾液酸化的。在 CHO-K1、Lec 1和功能性GnT I恢复的Lec 1中表达的短暂EPO。Lec 1 以前已经被报道，并且已经被Pamela Stanley领导的另一小组使用不同 凝集素独立地分离。

图5的照片显示，所有9个CHO糖基化突变体——其抗RCA且带 有不同的GnT I基因突变——均导致不完全的唾液酸化。在JW152、 JW36、JW80、KFC5008、KFC5026、KFC15002、KFC15047、KFC15071、 KFC 20011、CHO-K1中短暂表达的EPO。以RCA凝集素选择的9个 CHO糖基化突变体中产生的EPO，每一所述突变体均带有不同的导致 GnT I功能丧失的GnT I基因突变。与CHO野生型(最右侧)相比，在 这些细胞系中观察到不完全的唾液酸化。EPO临床标准物在最左侧。 RCA凝集素主要产生GnT I缺陷型突变体。

图6的照片显示，在恢复GnT I功能后，所有9个CHO糖基化突 变体短暂表达比在CHO-K1中短暂表达的EPO更好地被唾液酸化的 EPO。

图7的照片显示，GnT I功能恢复的JW152对EPO-Fc融合蛋白质 的唾液酸化也比CHO-K1更好。将在CHO野生型中产生的EPO-Fc融 合蛋白质与在恢复前后在JW152中产生的EPO-Fc融合蛋白质比较。结 果表明，即使用不同的模型糖蛋白，经恢复的JW152仍保持了较优的唾 液酸化。

图8的照片显示，HPAEC色谱图显示从在共表达功能性GnT I的 JW152细胞中表达的EPO-Fc上切下的更好地唾液酸化的聚糖。使用亲 和纯化通过蛋白A结合的色谱柱来纯化在CHO-K1中和在以GnT I共转 染的JW152中短暂表达的EPO-Fc。通过以肽:N-糖苷酶F(PNGase F) 处理将等量EPO-Fc上的聚糖切下，并依照附着于所述聚糖的唾液酸数 目使用高pH阴离子交换色谱(HPAEC)分离。所述色谱清楚地显示， 当与CHO-K1样品比较时，JW152样品在4S基团的峰更高，在1S基团 的峰更低。箭头指出内部对照棉子糖。如所示标明样品。

图9的照片显示由通过RCA-I分离的10个随机挑取的克隆表达的 重组EPO。上面的凝胶，在10种不同的突变系中表达的EPO。将细胞 以仅表达EPO的构建体转染。下面的凝胶，在相同系列以pEIG转染的 细胞系中表达的EPO。该构建体表达EPO和GnT I两者。

图10的照片显示在10种不同的JW152克隆中产生的EPO，所述 JW152克隆被表达EPO和GnT I二者的构建体稳定转染。将JW152细 胞以被称为pEIG的构建体转染。在pEIG中，包含EPO-IRES-GnT I (EIG)的转录单元被克隆至pcDNA3.1中CMV启动子的下游。在转染 后，选择并挑取稳定的克隆。通过IEF/蛋白质印迹测定来分析由10个 所述随机挑取的克隆产生的EPO的唾液酸化模式。结果显示，由不同的 稳定的克隆产生的所有EPO样品是高度唾液酸化的。这意味着，在存在 功能性GnT I的情况下，在稳定表达EPO时，可维持更好的唾液酸化。

图11的照片显示，CHO-K1中EPO的稳定表达显示出比GnT I功 能恢复的JW152的唾液酸化谱更差的唾液酸化谱。将CHO-K1细胞以 包含EPO编码序列的表达载体转染并进行选择。分离克隆，并且以IEF 分析来自9个随机选择的稳定克隆的EPO。结果表明，由不同的稳定的 克隆产生的所有EPO样品的总体唾液酸化均不同，但总的说来，其唾液 酸化不及图10中的EPO样品。

图12的照片显示4个JW152稳定细胞系中产生的EPO，已使所述 细胞系适应无蛋白质培养基中的悬浮成批培养。在贴壁培养中的稳定 JW152细胞系中观察到的唾液酸化模式在悬浮培养中得以保持。

序列表

SEQ ID NO:1是CHO JW 152细胞的N-乙酰葡糖胺转移酶I cDNA 的核酸序列。

SEQ ID NO:2是由SEQ ID NO:1编码的N-乙酰葡糖胺转移酶I的 氨基酸序列。

具体实施方式

本发明人已经使用细胞毒性凝集素RCA-I从CHO-K1细胞分离出 了新的CHO突变细胞系JW152。

由被EPO和GnT I cDNA稳定转染的JW152细胞产生的重组EPO 包含高度唾液酸化的同工型。已使这些稳定转染的细胞系中的几种已适 应悬浮培养，并且在无血清培养基中培养。通过IEF测定来分析这些细 胞产生的EPO。结果表明，无血清培养基中产生的EPO保持高度唾液 酸化。

这些结果表明，JW152细胞有可能成为用于产生蛋白质例如高度唾 液酸化的蛋白质(包括糖蛋白药物)的宿主细胞系。

细胞系JW152在2008年12月11日以作为按照关于用于专利程序 的微生物菌种保藏的国际承认的布达佩斯条约的国际保藏编号的登记号 PTA-9657保藏于美国典型培养物保藏中心(American Type Culture  Collection)，10801University Boulevard,Manassas,VA 20110-2209, United States of America。

因此，本发明人提供了与野生型中国仓鼠卵巢细胞相比能够实现更 高的蛋白质唾液酸化的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或细胞系。

能够实现更高唾液酸化的CHO细胞可以通过合适的选择方法例如 RCA-I选择方法产生。所述方法更详细地记载于下文“CHO细胞和细胞 系”中。因此，RCA-I可用于分离在存在GnT I的情况下产生高度唾液 酸化的重组蛋白质的CHO糖基化突变细胞。

所述选择方法因此特别地包括在本文描述的方法和组合物中。

因此，本发明人提供了中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或细胞系，所述 细胞或细胞系与野生型中国仓鼠卵巢细胞相比能够实现更高的蛋白质唾 液酸化，所述CHO细胞可通过以蓖麻凝集素I(RCA-I)选择来获得。 总的说来，本发明人提供了RCA-I抗性CHO细胞或细胞系，例如RCA-I 抗性CHO-K1细胞或细胞系。

遗传分析已经揭示了JW152细胞中的功能异常N-乙酰葡糖胺转 移酶I(GnT I)基因。对所述突变细胞的GnT I cDNA的分子克隆鉴 定出了产生提前终止密码子的点突变。因此，JW152细胞仅可以合 成只有338个氨基酸的截短形式的GnT I蛋白质，而不是包含447 个氨基酸的正常蛋白质。

本发明人已经使用RCA-I分离出更多的CHO突变系(约100个 克隆)。遗传分析表明，它们都缺乏功能性GnT I基因。它们中的许 多带有不同的GnT I基因编码区点突变，表明它们来自于不同的原始 克隆。然而，它们在存在GnT I的情况下都强烈地提高了对重组蛋白 质的唾液酸化。这些其他CHO细胞系的GnT 1基因突变显示于下表 D1中。

因此，本发明人提供了中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，所述细胞与 野生型中国仓鼠卵巢细胞相比在存在功能性GnT 1的情况下能够实 现更高的蛋白质唾液酸化，所述CHO细胞包含GnT 1基因突变。本 发明人还提供了中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或细胞系，所述细胞与 野生型中国仓鼠卵巢细胞相比能够实现更高的蛋白质唾液酸化，所述 CHO细胞可通过以蓖麻凝集素I(RCA-I)选择得到并且包含GnT 1 基因突变。

所述GnT 1基因突变可包含任何点突变、缺失、倒位等。所述 GnT 1基因突变可编码具有部分功能的或无功能的GnT 1多肽。所述 GnT 1基因突变可编码截短的GnT 1多肽。

本发明人提供了包含这些突变CHO细胞系和克隆中每一个的 CHO细胞和细胞系。本发明人提供了由RCA-I选择得到并且与野生 型或天然CHO细胞或者亲本细胞相比能够实现更高的唾液酸化的特 定细胞系。本发明人提供了所述细胞或细胞系中包含的突变CHO核 酸和多肽序列，这在下文中进一步详述。

所述CHO细胞或细胞系可包括JW152细胞系。它可包括JW80 细胞系。它可包括JW36细胞系。它可包括KFC15002细胞系。它可 包括KFC15071细胞系。它可包括KFC5008细胞系。它可包括JW152 细胞系。它可包括KFC5026细胞系。它可包括KFC20011细胞系。 它可包括KFC15047细胞系。

所述CHO细胞或细胞系可以以编码目的蛋白质例如异源或重组 蛋白质的核酸转染。所述蛋白质可包括糖蛋白。所述CHO细胞或细 胞系可以以编码功能性、全长或野生型GnT 1序列的核酸转染或共 转染。

如上文指出的，本发明人提供了所述核酸本身，例如编码突变 GnT 1基因的核酸，或者所述核酸的片段、变体、衍生物或同源物。 所述编码突变GnT 1基因的核酸、其片段、变体、衍生物或同源物 可导致包含它们的CHO细胞与不包含它们的CHO细胞例如野生型 CHO细胞相比能够实现更高的唾液酸化。编码突变GnT 1基因的核 酸可包含如SEQ ID NO:1所示的序列或者其变体、同源物、衍生物 或片段。

SEQ ID NO:1

从CHO JW152细胞分离的N-乙酰葡糖胺转移酶I(Mgat1, GenBank:AF343963)mRNA的编码区。在这些突变细胞中，鉴定出 了在位置1015处C至T的点突变(以黑体显示)：

ATGCTGAAGAAGCAGTCTGCAGGGCTTGTGCTTTGGGGTGCTATCCTCTTTGTGGGCTGGAATGCCCTGCTGCTC CTCTTCTTCTGGACACGCCCAGCCCCTGGCAGGCCCCCCTCAGATAGTGCTATCGATGATGACCCTGCCAGCCTC ACCCGTGAGGTGTTCCGCCTGGCTGAGGACGCTGAGGTGGAGTTGGAGCGGCAGCGGGGGCTGTTGCAGCAAATC AGGGAGCATCATGCTTTGTGGAGACAGAGGTGGAAAGTGCCCACCGTGGCCCCTCCAGCCTGGCCCCGTGTGCCT GCGACCCCCTCACCAGCCGTGATCCCCATCCTGGTCATTGCCTGTGACCGCAGCACTGTCCGGCGCTGCTTGGAT AAGTTGTTGCACTATCGGCCCTCAGCTGAGCATTTCCCCATCATTGTCAGCCAGGACTGCGGGCACGAAGAGACA GCACAGGTCATTGCTTCCTATGGCAGTGCAGTCACACACATCCGGCAGCCAGACCTGAGTAACATCGCTGTGCCC CCAGACCACCCCAAGTTCCAGGGTTACTACAAGATCGCCAGGCACTACCGCTGGGCACTGGGCCAGATCTTCAAC AAGTTCAAGTTCCCAGCAGCTGTGGTAGTGGAGGACGATCTGGAGGTGGCACCAGACTTCTTTGAGTACTTCCAG CCCACCTACCCACTCCTCAGAACAGACCCCTCCCTTTGGTGTGTCTCTGCTTGGAATGACAATGGCAAGGAGCAC ATGGTAGACTCAAGCAAACCTGAGCTGCTCTATCGAACAGACTTTTTTCCTGGCCTTGGCTGGCTGCTGATGGCT GAGCTGTGGACAGAGCTGGAGCCCAAGTGGCCCAAGGCCTTCTGGGATGACTGGATGCGCAGACCTGAGCAGCGG AAGGGGCGGGCCTGTATTCGTCCAGAAATTTCAAGAACGATGACCTTTGGCCGTAAGGGTGTGAGCCATGGGCAG TTCTTTGATCAGCATCTTAAGTTCATCAAGCTGAACCAGAGTTCGTGTCTTTCACCCAGTTGGATTTGTCATAC TTGCAGCGGGAGGCTTATGACCGGGATTTCCTTGCCCGTGTCTATAGTGCCCCCCTGCTACAGGTGGAGAAAGTG AGGACCAATGATCAGAAGGAGCTGGGGGAGGTGCGGGTACAGTACACTAGCAGAGACAGCTTCAAGGCCTTTGCT AAGGCCCTGGGTGTCATGGATGACCTCAAGTCTGGTGTCCCCAGAGCTGGCTACCGGGGCGTTGTCACTTTCCAG TTCAGGGGTCGACGTGTCCACCTGGCACCCCCACAAACCTGGGAAGGCTATGATCCTAGCTGGAATTAG

本发明人还提供了突变GnT 1多肽及其片段、变体、衍生物和同 源物。所述突变GnT 1多肽、片段、变体、衍生物或同源物可导致 包含它们的CHO细胞与不包含它们的CHO细胞例如野生型CHO细 胞相比能够实现更高的唾液酸化。所述突变GnT 1多肽可包括如SEQ  ID NO:2所示的序列或者其变体、同源物、衍生物或片段。

SEQ ID NO:2

由CHO JW152细胞中突变的基因编码的N-乙酰葡糖胺转移酶I (GnT I)蛋白质。所述点突变(C1015T)的结果是，JW152细胞仅 产生只有338个氨基酸的截短形式的GnT I，而不是包含447个氨基 酸的正常蛋白质。黑体的C-末端部分在JW152细胞中不被翻译。

MLKKQSAGLVLWGAILFVGWNALLLLFFWTRPAPGRPPSDSAIDDDPASLTREVFRLAEDAEVELERQRGLLQQI REHHALWRQRWKVPTVAPPAWPRVPATPSPAVIPILVIACDRSTVRRCLDKLLHYRPSAEHFPIIVSQDCGHEET AQVIASYGSAVTHIRQPDLSNIAVPPDHRKFQGYYKIARHYRWALGQIFNKFKFPAAVVVEDDLEVAPDFFEYFQ ATYPLLRTDPSLWCVSAWNDNGKEQMVDSSKPELLYRTDFFPGLGWLLMAELWTELEPKWPKAFWDDWMRRPEQR KGRACIRPEISRTMTFGRKGVSHGQFFDQHLKFIKLNQ

已使图2中所示的JW152-pEIG稳定细胞系中的数个细胞系适应 悬浮培养并且在无血清培养基中生长。无血清培养基中产生的EPO 保持了高度唾液酸化。本发明人因此提供了由RCA-I选择得到的突 变CHO细胞和细胞系，已使所述细胞和细胞系适应悬浮培养或者在 半固体培养基上生长。

总之，本发明人已经开发了从CHO细胞分离糖基化突变细胞的 新方法。RCA-I处理存活的所有CHO细胞均具有非常类似的特性。 首先，它们都缺乏功能性GnT I基因。其次，它们在存在GnT I的 情况下对它们的重组蛋白质的唾液酸化比野生型CHO细胞更好。该 特征在短暂转染和稳定转染的细胞中都同样得以保持。

以RCA-I分离的CHO糖基化突变细胞例如JW152细胞可以产 生高度唾液酸化的重组糖蛋白，条件是存在GnT I。该方法可用于产 生其中唾液酸含量对效力重要的重组糖蛋白。这些蛋白质包括EPO、 IEF-γ、因子VIII等。

CHO细胞和细胞系

本文描述的CHO细胞和细胞系可以通过任何合适的方式制备。 例如，所述CHO细胞和细胞系可以通过使用合适凝集剂例如凝集素 I的选择产生。所述凝集素可包括任何合适的凝集素，例如蓖麻凝集 素I(RCA-I)。

本发明人因此提供了提供CHO细胞或细胞系的方法，所述方法 包括在存在蓖麻凝集素I(RCA-I)的情况下培养CHO细胞，并选择 培养中存活的细胞。

本发明描述的CHO细胞和细胞系可以通过以蓖麻凝集素I (RCA-I)处理起始或亲本细胞并选择所述处理下存活的细胞来制 备。可以将所述存活的细胞进一步克隆并制成细胞系。所选择的细胞 和细胞系可包含如本文中所述的较高的唾液酸化活性。如本文所述， 所选择的细胞和细胞系可包含突变GnT 1基因和多肽。

例如，本文描述的CHO细胞或细胞系可以通过将亲本细胞系暴 露于合适浓度的蓖麻凝集素I(RCA-I)合适时间来选择。

RCA-I浓度可以为0.1μg/ml至100μg/ml,例如上至50μg/ml或 上至20μg/ml。具体浓度的实例包括10μg/ml和5μg/ml。

孵育或暴露于RCA-I的时间可以为从1小时、数小时(例如2、 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12小时)、过夜至数日，例如2天或 3天。

通常，可以调节所述时间和浓度以消除大部分CHO细胞，但使 少部分抗RCA-I的细胞能够存活并形成集落。在这之中，暴露和选 择的浓度和时间可以不同，但通常而言，RCA-I的浓度越高，需要的 暴露时间越短，反之亦然。

所述选择可以在任何合适的起始细胞或细胞系上进行，但它通常 是CHO细胞或细胞系。任何已知的CHO细胞或细胞系均可用作起 点或亲本细胞，包括CHO-K1。其他合适的起始细胞可以包括但不限 于如下(括号中是ECACC登记号)：CHO(85050302)、CHO (PROTEIN FREE)(00102307)、CHO-K1(85051005)、CHO-K1/SF (93061607)、CHO/dhFr-(94060607)、CHO/dhFr-AC-free (05011002)、RR-CHOKI(92052129)。

在选择后，使存活的细胞生长并形成集落，在形成集落后可以挑 取它们。进行该步骤的时间可不同，但通常足够长以使集落生长成可 挑取的大小。所述时间的实例有5天、7天、9天、11天、13天、1 周、2周、3周或更长。

所述挑取可以手工进行，或者可以通过使用机器人例如 CLONEPIX(Genetix,New Milton,Hampshire,UK)自动进行。还可 以将所挑取的集落进一步克隆、进一步筛选、表征、培养等。

可以对所选择的细胞进行进一步测试。例如，可以使用RCA-I 对它们进行凝集试验以确认所述突变细胞不再与RCA-I反应。

作为具体实例(其不意欲进行限制)，可以在例如6-孔板中将 CHO-K1细胞培养至汇合。可以将培养基换成无血清DMEM。可以 向所述培养基中加入蓖麻凝集素I(RCA-I,EY Laboratories)至终浓 度10μg/gml。它可以与细胞孵育过夜。可以例如以含10％FBS的新 鲜DMEM代替含RCA-I的无血清DMEM。9天后，可以将RCA-I 处理下存活的CHO细胞的集落挑取并例如在24孔板中培养。

可以对这些细胞进行进一步测试例如使用RCA-I的凝集试验以 确认所述突变细胞不再与RCA-I反应。本发明人因此提供了提供 CHO细胞或细胞系的方法，所述方法包括在存在蓖麻凝集素I (RCA-I)的情况下培养CHO细胞，选择在培养中存活且在凝集试 验中不与RCA-I反应的细胞。

通过例如表达目的蛋白质并确定唾液酸化程度，可以对RCA-I 选择的CHO细胞和CHO细胞系测试其唾液酸化表现。这可以通过 下文“唾液酸化”中描述的方法进行。

本发明人因此提供了提供CHO细胞或细胞系的方法，所述方法 包括在存在蓖麻凝集素I(RCA-I)的情况下培养CHO细胞，选择在 培养中存活的细胞并且选择那些表现出高唾液酸化表现(例如所表达 蛋白质的高Z值或低pI)的细胞或细胞系。

使用现有技术中已知的方法，可以将所述选择的细胞中的GnT 1 基因克隆并测序。所述GnT 1基因可包括本文所述的突变GnT 1基 因。

本发明人因此提供了提供CHO细胞或细胞系的方法，所述方法 包括在存在蓖麻凝集素I(RCA-I)的情况下培养CHO细胞，选择在 培养中存活的细胞并且选择那些包含本文所述的突变GnT 1基因的 细胞或细胞系。

突变CHO细胞和细胞系

如上文所述，本发明人提供了由RCA-I选择得到的CHO细胞或 细胞系。所述细胞系可包括JW152细胞系或者下文表D1中列出的任 何细胞系，包括JW80细胞系、JW36细胞系、KFC15002细胞系、 KFC15071细胞系、KFC5008细胞系、JW152细胞系、KFC5026细 胞系、KFC20011细胞系或KFC15047细胞系。

蛋白表达

本文所述的CHO细胞可用作表达任何目的蛋白质的宿主细胞。 这可以通过本领域中已知的方式进行。

CHO细胞和细胞系中的蛋白表达详细记载于文献中，本领域技 术人员使用本文描述的CHO细胞和细胞系作为蛋白表达的宿主几乎 没有困难。因此，例如，可以通过本领域中已知的方式以能够表达目 的蛋白质的表达载体来转染所述CHO细胞和细胞系。

所述CHO细胞和细胞系还可能能够表达野生型或功能性GnT 1，例如GenBank登记号AF343963中列出的序列。这可以通过以编 码GnT 1的表达载体转染所述CHO细胞和细胞系来进行。这可以在 与包含编码目的蛋白质的核酸的载体相同或不同的载体上进行。

使用本文描述的CHO细胞作为宿主细胞可以表达任何合适的蛋 白质。所述蛋白质可包括异源蛋白质。所述蛋白质可包括重组蛋白质。 所述蛋白质可包括基因工程蛋白质。所述蛋白质可包括糖蛋白。

实例包括治疗或药理学上感兴趣的异源蛋白质。可以表达的蛋白 质包括anti-EGFR mAb、α-葡萄糖苷酶、α-L-艾杜糖醛酸酶 (laronidase)、Ig-CTLA4融合物、N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶、促黄 体激素、anti-VEGF mAb、第VIII因子、anti-lgE mAb、anti-CD11a  mAb、α-半乳糖苷酶、干扰素-β、anti-TNFαmAb、促红细胞生成素、 anti-CD52mAb、第VIII因子、组织型纤溶酶原激活物、anti-HER2 mAb、TNFα、受体融合物、第IX因子、促卵泡刺激素、anti-CD20mAb、 干扰素-β、β-葡糖脑苷脂酶、脱氧核糖核酸I等。

例如，本发明人描述了以本文描述的CHO细胞和细胞系表达促 红细胞生成素(EPO)、干扰素-γ和第VIII因子。本发明人还描述 了从本文描述的CHO细胞和细胞系表达的高度唾液酸化形式或同工 型的促红细胞生成素(EPO)、干扰素-γ和第VIII因子。

唾液酸

术语“唾液酸”意欲指代9碳羧化糖家族的任何成员。

唾液酸家族最常见的成员是N-乙酰神经氨酸(2-酮-5-乙酰胺基 -3,5-二脱氧-D-甘油-D-半乳壬酮吡喃糖-1-酮酸(2-keto-5-acetamido-3, 5-dideoxy-D-glycero-D-galactononulopyranos-1-onic acid)，经常简写 为Neu5Ac、NeuAc或NANA)。该家族的第二个成员是N-羟乙酰基 -神经氨酸(Neu5Gc或NeuGc)，其中NeuAc的N-乙酰基团被羟基 化。第三个唾液酸家族成员是2-酮基-3-脱氧壬酮糖酸 (2-keto-3-deoxy-nonulosonic acid)(KDN)。

还包括9位取代的唾液酸例如9-O-C1-C6-酰基-Neu5Ac(如9-O- 乳酰基-Neu5Ac、9-O-乙酰基-Neu5Ac、9-脱氧-9-氟代-Neu5Ac和9- 叠氮基-9-脱氧-Neu5Ac)。唾液酸家族综述参见例如Varki； Glycobiology 21992；25-40；Sialic acids:Chemistry,Metabolism and  Function,R.Schauer,Ed.。

唾液酸化

蛋白质的唾液酸化程度可以通过多种方式测量，例如使用Z值或 表示所述蛋白质的等电点。

本发明人因此提供了使用本文描述的CHO细胞和细胞系进行的 蛋白表达，所述蛋白表达包括目的蛋白质的高度唾液酸化形式或同工 型。本文描述的CHO细胞和CHO细胞系的蛋白表达能够产生蛋白 质例如糖蛋白，例如促红细胞生成素(EPO)、干扰素-γ和第VIII 因子，其具有高Z值或低pI，或者这两个条件同时满足。

Z值

参数Z值提供糖蛋白中碳水化合物部分有多少个突出物带有荷 电残基例如唾液酸的量度。

为了确定Z值，将所述碳水化合物部分如上述从所述肽释放，如 果需要并进行标记。然后，将所述混合物通过离子交换色谱分离，使 得物质可基于电荷分离。可以如上述借助标记物或者可以通过其他某 些方法例如质谱法来显示所洗脱的峰。

然后，通过对单电荷、二电荷、三电荷和四电荷的碳水化合物种 类相关峰进行积分来分析色谱图。然后，可以使用每个种类占总碳水 化合物的百分数来依照下式计算Z值：Z＝P'单+2P'二+3P'三+4P' 四，其中Z为Z值，P'单、P'二、P'三和4P'四分别是单电荷、二电 荷、三电荷和四电荷的碳水化合物占总碳水化合物的百分数。

高Z值表示大量突出物带有荷电残基，因此所述糖蛋白应是高荷 电的，并且在唾液酸残基的情况下是酸性的。

本文描述的CHO细胞能够表达高度唾液酸化的蛋白质。因此， 例如，所述CHO细胞表达的蛋白质可以具有高的Z值，例如大于150， 例如大于160，大于170，大于180，例如大于190，大于200，大于 210，例如大于220，大于230等。

等电点

蛋白质的等电点(pI)也可以用作其唾液酸化的量度。唾液酸化 程度越高，其酸性越强并且其pI越低。

由本文描述的CHO细胞表达的蛋白质与它们的正常对应物例如 天然蛋白质或者由野生型CHO细胞表达的对应蛋白质相比具有明显 更低的pI谱。例如，由本文描述的CHO细胞和细胞系表达的蛋白质 可以具有低pI，例如其pI为4.5或更小，例如4.3或更小，4.1或更 小，4.0或更小，3.8或更小，3.6或更小，3.4或更小，3.2或更小， 3.0或更小，2.8或更小，2.6或更小等。所述pI可以是各种蛋白分子 的pI，或者是一批或一部分蛋白分子的pI，或者所表达的许多蛋白 质的平均pI。

可以使用本领域技术人员已知的许多方法从同工型混合物中分 离所表达的蛋白质。例如，可使用等电聚焦、色谱聚焦或离子交换色 谱来基于pI分离所述同工型。可以对所述不同级分分析唾液酸含量， 并选择需要的级分使用。

突变GNT 1序列

本发明人公开了突变GnT 1序列，包括突变GnT 1氨基酸序列 和突变GnT1核酸序列。

示例性突变GnT 1氨基酸序列包括如SEQ ID NO:2所示的序 列，以及包含下表D1第3列所列突变的序列。

示例性突变GnT 1核酸序列包括如SEQ ID NO:1所示的序列， 以及包含下表D1第2列所列突变的序列。

如在下文实施例中所述，表D1显示了以RCA-I选择分离出的克 隆的GnT 1序列中的突变。

将相应突变列表，并排显示各种核苷酸和氨基酸突变，以及在二 级结构/相互作用遭到破坏的可能位置，或在终止密码子突变情况下 导致的氨基酸丢失。

对最少4个细菌集落进行测序以确保存在的突变不是由于PCR 错误。

表D1.来自于由RCA-I筛查(下文实施例10)得到的克隆的 GnT1突变体中存在的突变列表。具有不同的GnT1基因突变的9个 CHO糖基化突变体。导致功能丧失的点突变存在于4个细胞系 (JW80、JW36、KFC15002和KFC15071)。导致终止密码子生成 的点插入存在于KFC 5008。产生提前终止密码子的突变存在于另外 4个细胞系(JW152、KFC5026、KFC20011、KFC15047)。

突变GNT 1多肽

所述CHO细胞和细胞系包含突变GnT 1多肽。

因此，本发明人主要提供了突变GnT 1多肽以及其片段、同源物、 变体和衍生物。这些多肽序列可包括本文公开的多肽序列，特别是序 列表中的序列。

所述突变GnT 1多肽与野生型GnT 1序列相比可包含一个或多 个改变。这种突变可以由引入到所述编码核酸序列中的终止密码子及 由此带来的GnT 1mRNA翻译的提前终止引起。

所述突变GnT 1多肽可短于野生型GnT 1多肽。它可以是截短 形式的野生型GnT 1多肽。突变GnT 1多肽的长度可以是野生型序 列的90％或更小，80％或更小，70％或更小等。

例如，突变GnT 1多肽与全长或野生型GnT 1多肽相比可以缺 少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、 80、85、90、95、100或更多个C-末端残基。

所述突变GnT 1多肽可以包括例如SEQ ID NO:2中列出的序 列。这是来自细胞系JW152的突变GnT 1多肽序列。所述突变GnT 1多肽可包括包含上表D1第3列所列突变的GnT 1序列。

应理解，本文公开的突变GnT 1多肽序列不限于序列表中列出的 具体序列或其片段，或者从突变GnT 1蛋白质得到的序列，而是如 果情况允许还包括任何来源的同源序列，例如相关的细胞同源物、来 自其他物种的同源物，及其变体或衍生物，条件是它们具有突变GnT 1的至少一种生物活性。

本公开因此涵盖序列表中列出的氨基酸序列的变体、同源物或衍 生物，以及由本文公开的核苷酸序列编码的氨基酸序列的变体、同源 物或衍生物。所述序列通常称为“突变GnT 1序列”。

突变GnT 1多肽的长度可以是相应野生型序列的90％或更小， 80％或更小，70％或更小等。

例如，突变GnT 1核酸可编码缺失5、10、15、20、25、30、35、 40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个 C-末端残基的突变GnT 1多肽。

生物活性

在一些实施方案中，如果情况允许，所述序列包含突变GnT 1 的至少一种生物活性。所述生物活性可包括与野生型GnT 1相比更 高的表达较高唾液酸化的蛋白质的能力。

同源物

所公开的多肽包括从任何来源得到的同源序列，所述任何来源例 如相关的病毒蛋白/细菌蛋白、细胞同源物和合成多肽，及其变体或 衍生物。

在本文的上下文中，如果情况允许，同源序列或同源物被认为包 括这样的氨基酸序列，即该氨基酸序列与GnT 1——例如本文序列表 中列出的序列——在至少30例如50、70、90或100个氨基酸的氨基 酸水平上是至少60、70、80或90％相同的，例如是至少95或98％ 相同的。在本文的上下文中，同源序列被认为包括这样的氨基酸序列， 即该氨基酸序列与GnT 1的序列在例如至少15、25、35、50或100， 例如200、300、400或500个氨基酸的氨基酸水平上是至少15、20、 25、30、40、50、60、70、80或90％相同的，例如是至少95或98％ 相同的。

虽然也可以就相似性(即具有相似化学性质/功能的氨基酸残基) 考虑同源性，但在本文的上下文中，以序列同一性表示同源性是可能 的。例如，在一些实施方案中，序列同一性可针对相关序列的全长即 针对相关基因的全长或全长序列确定。

同源性比较可通过肉眼进行，或者更通常借助容易获得的序列比 较程序进行。这些市售的计算机程序可计算两个或多个序列之间的同 源性百分数。

可以对连续序列计算同源性百分数，即将一个序列与另一个序列 进行比对，并将一个序列中的每个氨基酸直接与另一个序列的对应氨 基酸进行比较，每次比较一个残基。这称作“无缺口”比对。一般，所 述无缺口比对只针对相对少数目的残基(例如少于50个连续氨基酸) 进行。

虽然这是非常简单且可靠的方法，但它没有考虑到以下问题，例 如，在原本相同的一对序列中，一个插入或缺失将使后面的氨基酸残 基比对出局，从而有可能在整体比对时造成同源性百分数大大降低。 因此，大多数序列比较方法被设计来产生这样的最佳比对，即所述比 对考虑到可能的插入和缺失，而不过度处罚整体同源性得分。这一点 可通过在序列对比中插入“缺口”以试图使局部同源性最大化实现。

然而，这些更复杂的方法给存在于比对中的每个缺口分配“缺口 罚分”，从而对于相同数目的相同氨基酸，具有尽可能少的缺口的序 列比对——反映两个比较序列之间有更高相关性——较具有许多缺 口的比对，将获得更高的分值。通常使用“仿射缺口分值(affine gap  cost)”，它对缺口的存在扣除较高的分值，并对该缺口中的每个后续 残基处以较低的罚分。这是最常用的缺口评分体系。高缺口罚分理所 当然将产生具有较少缺口的优化比对。大多数比对程序允许修改缺口 罚分。然而，在利用这种软件进行序列比较时，可以使用缺省值。例 如，在利用GCG Wisconsin Bestfit软件包(见下文)时，氨基酸序 列的缺省缺口罚分是一个缺口-12分及每个延伸-4分。

对最大同源性百分数的计算因此首先需要在考虑缺口罚分的情 况下产生最佳比对。适于实施这种比对的计算机程序是GCG  Wisconsin Bestfit软件包(University of Wisconsin,U.S.A.；Devereux  et al.,1984,Nucleic Acids Research 12:387)。能实施序列比较的其他 软件的实例包括但不限于BLAST软件包(见Ausubel et al.,1999ibid- Chapter 18)、FASTA(Atschul et al.,1990,J.Mol.Biol.,403-410) 和GENEWORKS的比较工具套件。BLAST和FASTA都能进行脱机 和在线搜索(见Ausubel et al.,1999ibid,第7-58至7-60页)。

虽然最终的同源性百分数可就同一性进行测量，但比对过程本身 通常并不是基于全或无配对比较。实际上，通常使用尺度相似得分矩 阵(scaled similarity score matrix)，它基于化学相似性或进化距离 给每个成对比较分配得分。所述矩阵的常用实例是BLOSUM62矩 阵——BLAST程序套件的缺省矩阵。GCG Wisconsin程序通常使用 公用的缺省值或定制符号比较表(如果提供的话)(更多详情参见用 户手册)。对于GCG程序包，可使用公用缺省值；而对于其他软件， 可使用缺省矩阵，例如BLOSUM62。

一旦该软件产生了最佳比对，就可计算同源性百分数例如序列同 一性百分数。该软件通常将此作为序列比较的一部分，并产生数字化 的结果。

变体和衍生物

术语“变体”或“衍生物”在涉及本文所述的氨基酸序列时包括一 个(或多个)氨基酸对所述序列的任何置换、变异、修饰、替代，从 所述序列的任何缺失或者向所述序列的任何添加。例如，所产生的氨 基酸序列可基本保持与未改变序列相同的活性，例如具有至少与显示 于序列表中的突变GnT 1多肽相同的活性。

具有显示于实施例中的氨基酸序列的多肽或其片段或同源物可 被修饰以用于本文所述的方法和组合物。一般地，进行保持所述序列 的生物学活性的修饰。可进行氨基酸置换，例如从1、2或3至10、 20或30个置换，条件是被修饰的序列保持未修饰序列的生物学活性。 氨基酸置换可包括非天然类似物的使用，例如为了提高治疗性给予的 多肽的血浆半衰期。

突变GnT 1的天然变体可能包含保守性氨基酸置换。保守性置换 可例如根据下表定义。在第二列同一格中的氨基酸以及在第三列同一 行中的氨基酸可以互相置换：

片段

本文公开并用作标记物的多肽还包括上述全长多肽及其变体的 片段，包括序列表中所列序列的片段。

多肽还包括突变GnT 1多肽全长序列的片段。所述片段可包含至 少一个表位。鉴定表位的方法是本领域中公知的。片段一般包含至少 6个氨基酸，例如至少10、20、30、50或100个氨基酸。

包括这样的片段，即所述片段包含突变GnT 1氨基酸序列的5、 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、 22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、 37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、 52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、 67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、 82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、 97、98、99、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、 150或更多个残基，例如由其组成。

所述突变GnT 1蛋白质及其等位基因变体和物种变体的多肽片 段可包含一个或多个(例如5、10、15或20个)置换、缺失或插入， 包括保守性置换。如果例如在不同物种中发生置换、缺失和/或插入， 那么例如少于50％、40％或20％的序列表所示氨基酸残基被改变。

可通过重组的方式制备突变GnT 1及片段、同源物、变体和衍生 物。然而，也可以使用本领域技术人员公知的技术例如固相合成通过 合成方式制备它们。所述蛋白还可以融合蛋白的形式产生，例如为了 帮助提取和纯化。融合蛋白伴侣的实例包括谷胱甘肽-S-转移酶 (GST)、6×His、GAL4(DNA结合和/或转录激活域)和β-半乳糖 苷酶。还可方便地使所述融合蛋白伴侣和目的蛋白序列之间包括蛋白 水解切割位点，以使得融合蛋白序列可被去除。所述融合蛋白可以是 这样的，即它不阻碍目的序列的蛋白的功能。蛋白质还可以通过纯化 动物细胞的细胞提取物而得到。

本文公开的突变GnT 1多肽、变体、同源物、片段和衍生物可以 是基本分离的形式。需理解的是，所述多肽可与不干扰所述蛋白的预 定目的的载体或稀释剂混合，并且这样的多肽仍被认为是基本分离 的。突变GnT 1多肽变体、同源物、片段或衍生物还可以是基本纯 化的形式，在这种情况下一般会使所述蛋白包含在制剂中，所述制剂 中大于90％例如95％、98％或99％是所述蛋白。

本文公开的突变GnT 1多肽、变体、同源物、片段和衍生物可以 以显示标记物标记。所述显示标记物可以是使所述多肽等可被检测的 任何合适的标记物。合适的标记物包括放射性同位素例如125I、酶、 抗体、多核苷酸和连接子(linker)例如生物素。标记的多肽可用于诊 断方法例如免疫测定中，以确定样品中多肽的量。还可使用标准方案 将多肽或标记多肽用于血清学免疫测定或细胞介导的免疫测定中，以 检测动物和人中对所述多肽的免疫反应性。

本文公开的突变GnT 1多肽、变体、同源物、片段和衍生物(任 选被标记的)还可被固定于固相物，例如免疫测定孔或浸量尺 (dipstick)的表面。可将所述标记的和/或固定的多肽与合适的试剂、 对照物、说明书等在合适的容器中包装成试剂盒。所述多肽和试剂盒 可用于通过免疫测定检测所述多肽或其等位基因变体或物种变体的 抗体的方法中。

免疫测定方法是本领域中公知的，并通常包括：(a)提供包含 可被所述蛋白的抗体结合的表位的多肽；(b)将生物样品与所述多 肽在可形成抗体-抗原复合物的条件下孵育；及(c)确定包含所述多 肽的抗体-抗原复合物是否形成。

本文公开的突变GnT 1多肽、变体、同源物、片段和衍生物可用 于体外或体内细胞培养体系中，以研究它们对应的基因及其同源物在 细胞功能(包括它们在疾病中的功能)中的作用。例如，可将截短的 或修饰的多肽导入细胞，以破坏在所述细胞中出现的正常功能。可通 过由重组表达载体原位表达所述多肽而将所述多肽导入所述细胞(见 下文)。所述表达载体任选地带有可诱导的启动子，以控制所述多肽 的表达。

预计使用合适的宿主细胞例如昆虫细胞或哺乳动物细胞可提供 对赋予重组表达产物最佳的生物活性可能需要的翻译后修饰(例如肉 豆蔻酰化、糖基化、截短、脂质化(lapidation)及酪氨酸、丝氨酸 或苏氨酸的磷酸化)。表达本文公开的突变GnT 1多肽、变体、同 源物、片段和衍生物的细胞培养体系可用于测定体系，以鉴定在所述 细胞中干扰或增强所述多肽的功能的候选物质。

突变GNT 1核酸

所述CHO细胞和细胞系包含突变GnT 1核酸。

本发明人因此主要提供了突变GnT 1核酸，以及其片段、同源物、 变体和衍生物。这些核酸序列可以编码本文公开的多肽序列，特别是 序列表中的多肽序列。

所述多核苷酸可包括突变GnT 1核酸。所述突变GnT 1核酸可 在野生型GnT 1序列中包含一个或多个点突变。所述突变可以导致 氨基酸序列的相应改变，或者引入终止密码子并提前结束GnT 1 mRNA的翻译。

所述突变GnT 1核酸可包含产生终止密码子的突变，所述突变导 致突变GnT 1多肽短于野生型GnT 1多肽。突变GnT 1多肽的长度 可以是野生型序列的90％或更少，80％或更少，70％或更少等。

例如，突变GnT 1核酸可以编码缺失5、10、15、20、25、30、 35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更 多个C-末端残基的突变GnT 1多肽。

所述突变GnT 1核酸可以包括例如SEQ ID NO:1中列出的序 列。这是来自细胞系JW152的突变GnT 1核酸序列。所述突变GnT 1核酸可包括包含上表D1第二列所列突变的GnT 1序列。

具体而言，本发明人提供了编码本文公开的任何GnT 1多肽的核 酸或多核苷酸。因此，术语“GnT 1序列”应作相应解释。然而，所述 核酸或多核苷酸可包括SEQ ID NO:1中列出的序列或编码相应多肽 的序列，以及所述核酸的片段、同源物、变体或衍生物。上述术语因 此可被认为是指这些序列。

本文中使用的术语“多核苷酸”、“核苷酸”和核酸意欲互为同义词。 “多核苷酸”通常是指任何多核糖核酸或者多脱氧核糖核酸，可以是未 修饰的RNA或DNA或者修饰的RNA或DNA。“多核苷酸”包括且不 限于单链DNA、双链DNA、单链和双链区混合的DNA、单链RNA、 双链RNA、单链和双链区混合的RNA、包含DNA和RNA的杂合分 子，所述杂合分子可以是单链，或者更一般是双链或单链和双链区的 混合体。此外，“多核苷酸”还指包含RNA或DNA或者包含RNA和 DNA两者的三链区。术语多核苷酸还包括含有一个或多个修饰碱基的 DNA或RNA，以及为了稳定性或其他原因而对主链进行修饰的DNA 或RNA。“修饰”碱基包括例如三苯甲基化的碱基和不常见碱基如肌 苷。已经对DNA和RNA进行了多种修饰；因此，“多核苷酸”涵盖经 化学、酶学或代谢修饰形式的通常存在于自然界的多核苷酸，还包括 化学形式的病毒和细胞特征的DNA和RNA。“多核苷酸”还涵盖较短 的多核苷酸，通常称作寡核苷酸。

本领域技术人员应理解，多种不同的多核苷酸和核酸由于遗传密 码子的简并性可以编码相同的多肽。此外还应理解，本领域技术人员 可以使用常规技术进行核苷酸替换以反映任何表达所述多肽的宿主生 物的密码子使用情况，所述核苷酸替换不影响本文所述的多核苷酸编 码的多肽序列。

突变GnT 1变体、衍生物和同源物

本文描述的突变GnT 1多核苷酸可以包括DNA或RNA。它们可 以是单链或双链。它们也可以是内部含有合成核苷酸或修饰核苷酸的 多核苷酸。对寡核苷酸的多种不同类型的修饰在本领域中是已知的。 这些修饰包括甲基膦酸酯和硫代磷酸酯主链，在寡核苷酸分子的3’端 和/或5’末端加吖啶或多赖氨酸链。出于本文的目的，应理解本文描述 的多核苷酸可以用现有技术中可用的任何方法修饰。可以进行这些修 饰，目的是提高多核苷酸在体内的活性或寿命。

在多核苷酸是双链的情况下，本文描述的方法和组合物涵盖所述 双链体分离或结合形式的的全部两条链。在多核酸是单链的情况下， 应理解还包括该多核苷酸的互补序列。

术语“变体”、“同源物”或“衍生物”在涉及核苷酸序列时包括一个 (或多个)氨基酸对所述序列的任何置换、变异、修饰、替代，从所 述序列的任何缺失或者向所述序列的任何添加。所生成的序列可能能 够编码在CHO细胞中能够介导更高唾液酸化的多肽。

如上文指出的，就序列同一性而言，“同源物”与序列表中显示的 相关序列具有例如至少5％的同一性、至少10％的同一性、至少15％ 的同一性、至少20％的同一性、至少25％的同一性、至少30％的同 一性、至少35％的同一性、至少40％的同一性、至少45％的同一性、 至少50％的同一性、至少55％的同一性、至少60％的同一性、至少 65％的同一性、至少70％的同一性、至少75％的同一性、至少80％ 的同一性、至少85％的同一性、至少90％的同一性或至少95％的同 一性。

可具有至少95％的同一性，例如至少96％的同一性，例如至少 97％的同一性，例如至少98％的同一性，例如至少99％的同一性。 可如上所述进行核苷酸同源性比较。一个可用的序列比较程序为上文 所述的GCG Wisconsin Bestfit程序。所述缺省得分矩阵给予每个相 同核苷酸的匹配分值为10，给予每个错配的分值为-9。对于每个核苷 酸而言，缺省缺口形成罚分为-50，缺省缺口延伸罚分为-3。

在一些实施方案中，突变GnT 1多核苷酸与如SEQ ID NO:1所 示的序列具有至少90％或更高的序列同一性。突变GnT 1多核苷酸 与如SEQ ID NO:1所示的序列可具有60％或更高，例如65％或更高， 70％或更高，75％或更高，80％或更高，85％或更高，90％或更高， 95％或更高，97％或更高，或者98％或更高的序列同一性。

杂交

本发明人进一步描述这样的突变GnT 1核苷酸序列，即所述突变 GnT 1核酸序列能够与本文给出的任何序列或者其任何变体、片段或 衍生物选择性杂交，或者与上述任何一种的互补序列选择性杂交。核 苷酸序列的长度是例如至少15个核苷酸，例如至少20、30、40或50 个核苷酸。

本文使用的术语“杂交”应包括这样的过程，即“借助该过程核酸链 通过碱基配对与互补链结合”，以及在聚合酶链式反应技术中进行的扩 增过程。

能与本文给出的核苷酸序列或者其互补序列选择性杂交的多核苷 酸通常与本文给出的相应核苷酸序列一般在至少20，例如至少25或 30，例如至少40、60、100或更多个连续核苷酸的区域上具有至少70％， 例如至少80％或90％，例如至少95％或98％的同源性。

术语“可选择性杂交”是指用作探针的多核苷酸在靶多核苷酸以 显著高于背景的水平与所述探针杂交的条件下使用。背景杂交可因存 在于例如被筛选的cDNA或基因组DNA文库中的其他多核苷酸而出 现。在该事件中，背景表示由所述探针和所述文库的非特异性DNA 成员之间的相互作用产生的信号水平，该水平比用靶DNA所观察到 的特异性相互作用的强度小10倍，例如小100倍。例如，可通过例 如用32P放射性标记所述探针来测量相互作用的强度。

杂交条件基于核酸结合复合体的解链温度(Tm)，这在Berger and  Kimmel(1987,Guide to Molecular Cloning Techniques,Methods in  Enzymology,Vol 152,Academic Press,San Diego CA)中有教导，并给 出如下文解释的明确的“严格度”。

最大严格度一般出现在约Tm-5℃(比探针的Tm低5℃)；高 严格度出现在Tm下约5℃-10℃；中等严格度出现在Tm下约10℃ 到20℃；并且低严格度在Tm下约20℃到25℃。如本领域技术人员 会理解的，最大严格度杂交可用于鉴定或检测相同的多核苷酸序列， 而中等(或低)严格度杂交可用于鉴定或检测相似或相关的多核苷酸 序列。

在一个方面中，本发明人公开了在严格条件(例如65℃和 0.1×SSC{1×SSC＝0.15M NaCl、0.015M柠檬酸三钠，pH 7.0})下 可与突变GnT 1核酸或者其片段、同源物、变体或衍生物杂交的核 苷酸序列。

如果多核苷酸是双链，那么所述双链体分离或结合形式的全部两 条链均被本公开所涵盖。如果所述多核苷酸是单链，应理解该多核苷 酸的互补序列也被公开和涵盖。

与本文所公开序列非100％同源但落入本公开范围内的多核苷酸 可以通过多种方式获得。本文描述的序列的其他变体可以例如通过以 下方式获得：探测从一系列个体例如来自于不同群体的个体制得的 DNA文库。另外，还可得到其他病毒/细菌同源物或细胞同源物特别 是存在于哺乳动物细胞(例如大鼠、小鼠、牛和灵长类细胞)的细胞 同源物，并且所述同源物及其片段通常能够与本发明序列表中所示的 序列选择性杂交。所述序列可通过如下方式得到：探测从其他动物物 种制得的cDNA文库或基因组DNA文库，并在中至高严格度下以包 含SEQ ID NO:1的全部或一部分的探针来探测所述文库。类似的考 虑适用于获得突变GnT 1的物种同源物和等位基因变体。

本文描述的多核苷酸可用于产生引物例如PCR引物、其他扩增 反应的引物以及例如使用放射性或非放射性标记物通过常规方式以 显示标记物标记的探针，或者，可将所述多核苷酸克隆至载体中。所 述引物、探针和其他片段的长度为至少15，例如至少20，例如至少 25、30或40个核苷酸，并且也被本文中使用的术语多核苷酸所涵盖。 片段的长度可少于500、200、100、50或20个核苷酸。

多核苷酸例如DNA多核苷酸和探针可重组地、合成地或者通过 本领域技术人员可用的任何方式产生。它们还可通过标准技术进行克 隆。

引物通常通过合成方式产生，包括每次一个核苷酸逐步产生所需 核酸序列。使用自动化技术实现这一点的技术在本领域中容易获得。

更长的多核苷酸通常使用重组方式产生，例如使用PCR(聚合酶 链式反应)克隆技术。这包括，制备需要克隆的序列区侧翼的引物对 (例如具有约15-30个核苷酸)；将所述引物与从动物细胞或人细 胞得到的mRNA或cDNA接触；在引起所需区域扩增的条件下进行 聚合酶链式反应；分离扩增片段(例如通过在琼脂糖凝胶上纯化所述 反应混合物)；以及回收所扩增的DNA。可将所述引物设计为包含 合适的限制酶识别位点，从而可将所扩增的DNA克隆至合适的克隆 载体中。

实施例

实施例1.细胞培养

中国仓鼠卵巢-K1(CHO-K1)细胞最初获自Donald K. MacCallum博士(University of Michigan Medical Scholl,Ann Arbor, MI)。

在含5％CO₂的湿润培养箱中，将亲本细胞和包括JW152细胞 在内的突变CHO细胞在37℃下培养于添加10％胎牛血清(FBS) 的Dulbecco's Modified Eagle Media(DMEM)中。

Lec 1.3细胞(Lec 1细胞)由P.Stanley博士(Albert Einstein  College of Medicine,NY)馈赠，培养在添加脯氨酸(40mg/L) (Invitrogen/Gibco)和10％FBS的α-MEM(Gibco)中。

实施例2.分离RCA-I抗性CHO细胞

将CHO-K1细胞在6-孔板中培养至汇合，然后将培养基换为无 血清DMEM。向所述培养基中加入蓖麻凝集素I(RCA-I,EY  Laboratories)至终浓度为10μg/ml并与细胞孵育过夜。

然后，将包含RCA-I的无血清DMEM更换成含10％FBS的新 鲜DMEM。9天后，挑取RCA-I处理下存活的CHO细胞集落并在 24孔板中培养。

然后使用RCA-I对这些细胞进行凝集试验以确认所述突变细胞 不再与RCA-I反应。

实施例3.表达构建体

将人促红细胞生成素(EPO)和数个糖基化相关基因的编码区克 隆至pcDNA3.1载体(Invitrogen)中。

还将这样的DNA片段克隆至pcDNA3.1：即它依次包含人EPO 的开放阅读框、脑炎心肌炎病毒(EMCV)的内核糖体进入位点 (IRES)和中国仓鼠N-乙酰葡糖胺转移酶I(EPO-IRES-GnT I或者 缩写为EIG)的编码区。所产生的表达EPO和GnT I二者的载体称 为pEIG。为了确保有效翻译，在每种构建体中均将Kozak共有序列 (GCCACC)置于翻译起始密码子ATG的上游。

实施例4.重组人EPO在亲本和突变CHO细胞系中的短暂表达

除非说明，否则依照制造商的方案，使用Lipofectamine (Invitrogen)将1μg表达EPO的DNA构建体和1μg表达GnT I 或另一种糖基化相关基因的DNA构建体共转染至野生型或JW-152 突变细胞。

在转染后2天，从所述转染的细胞收集条件化的培养基。使用 EPO ELISA试剂盒(Roche)通过标准ELISA确定每个转染样品中 重组EPO的浓度。

实施例5.对野生型CHO细胞和JW-152CHO细胞产生的EPO 的等电聚焦(IEF)分析

按照之前的记载(Schriebl et al.2007,Electrophoresis 28:2100-7)，通过IEF继而通过蛋白质印迹来分析不同样品中EPO 的唾液酸化模式。IEF的pH范围是3至10。

实施例6.对RCA-I抗性CHO细胞中的GnT I cDNA的分子克 隆和测序分析

对于每个细胞系，使1×10⁷细胞沉淀并在PBS中冲洗。使用 RNAqueous试剂盒(Ambion)从所述沉淀提取总RNA。然后，使用 莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶(Promega)，依照制造商 的推荐通过反转录合成cDNA。

使用PFX(Invitrogen)，通过聚合酶链式反应(PCR)获得每个 细胞系cDNA的GnT I扩增子。然后，将它克隆至pcDNA 3.1表达 载体中并测序。每个突变细胞系最少有四个克隆被测序。所有质粒纯 化都使用Promega的微量或中量制备试剂盒进行。在以Big Dye 3.1 (Applied Biosystems)进行循环测序后，使用ABI Prism 3100Genetic  Analyzer(Applied Biosystems)对构建体进行测序。

结果显示在上表D1中。

实施例7.分离稳定转染的CHO细胞系

将CHO-K1细胞以仅表达EPO的构建体转染，而将突变JW152 细胞以表达EPO和GnT I二者的pEIG转染。以G418(0.8mg/ml) 对经转染的细胞选择2周。

使用有限稀释将来自所述转染细胞池的稳定转染的细胞在96孔 中培养。使用斑点印记分析来选择源自表达EPO的单转染细胞的稳 定细胞系，并且以等电聚焦来分析由每个细胞系表达的重组EPO的 唾液酸化模式。

实施例8.结果：RCA-I抗性突变CHO细胞系的分离和表征

使用已知对糖蛋白或糖脂上的β-键半乳糖残基特异的植物凝集 素RCA-I来从CHO K1细胞选择糖基化突变体。在孵育过夜后大多 数CHO细胞被RCA-I杀死。

9-10天后，RCA-I处理下存活的细胞已经生长成单克隆。挑取这 些克隆并在24孔板中培养。将所述克隆之一命名为JW152。

为了表征该细胞系的遗传缺陷，以表达人EPO的构建体转染 JW152细胞。以内切糖苷酶H(Endo H)处理由JW 152细胞产生的 重组EPO。

结果显示于图1。图1示出，JW152表达的EPO对Endo H处理 敏感，表明存在于所述EPO分子上的聚糖结构(N-聚糖)为高甘露 糖类型。因此怀疑所述糖基化通路的早期部分的基因有缺陷。

基于该现象，进行了补偿试验。在该试验中，除EPO构建体外， 还以N-糖基化通路上的几个基因共转染JW152细胞。这些基因包括 葡萄糖苷酶I、葡萄糖苷酶II、甘露糖苷酶IA、甘露糖苷酶IB、甘 露糖苷酶IC、甘露糖苷酶II、GnT I和GnT II。通过等电聚焦(IEF) 继而通过蛋白质印迹来分析这些共转染实验中由JW152细胞产生的 EPO样品。

结果显示于图2。最左侧的道(CHO WT)示出作为对照的由野 生型CHO细胞表达的EPO。CHO-JW152下的道示出JW152细胞产 生的EPO，显示EPO的不完全糖基化。其余的道示出被所标明的不 同糖基化相关基因共转染的JW152细胞中产生的EPO。

在所测试的基因中，仅GnT I能够恢复JW152细胞中产生的EPO 的唾液酸化模式。这些结果表明JW152细胞缺乏功能性GnT I基因。

从该IEF/蛋白质印迹测定观察到的另一重要现象是，在存在GnT I的情况下，JW152细胞比野生型细胞对EPO的唾液酸化好得多(与 由野生型细胞产生的EPO比较)。

为了确认该差异是由于JW152细胞的独特特征所致，而非GnT I 过表达的结果，通过以GnT I构建体共转染3个CHO细胞系来分析 这些细胞系。收集条件化培养基中的重组EPO，并通过IEF进行分 析。

结果显示于图3。GnT I未提高野生CHO细胞中的EPO唾液酸 化(比较CHO-WT道和CHO-WT+GnT I道)。共表达GnT I和不 共表达GnT I的CHO-K1的EPO唾液酸化模式似乎相同，因此GnT  I的过表达不是造成标记为CHO-K1+GnT1的道中所见的唾液酸化提 高的原因。

GnT I强烈提高了JW152细胞中EPO的唾液酸化(JW152+GnT  I道)。在存在GnT I的情况下，JW152细胞比野生型CHO细胞对 EPO的唾液酸化好得多(比较CHO-WT道和CHO-JW152+GnT I 道)。

图3示出，在存在GnT I的情况下，JW152细胞比野生型细胞 对重组蛋白质的唾液酸化好得多。以神经氨酸酶——其可切掉唾液 酸——处理样品可导致酸性区中的EPO带在切掉唾液酸后缩减至碱 性区，表明更高唾液酸化形式的EPO的确集中在所述凝胶的酸性区 中。

Lec 1细胞以前已经被P.Stanley分离，已知它们缺乏GnT I活 性。由Lec1细胞(Lec1)产生的EPO的IEF模式类似于JW152产 生的EPO的IEF模式。由被GnT I共转染的Lec1细胞产生的EPO 与由野生型CHO细胞产生的EPO显示类似的唾液酸化模式。

这显示于图4。因此，图4示出，在存在功能性GnT I的情况下， 以前公开的具有GnT I缺陷的Lec 1突变体的EPO表达也是高度唾 液酸化的。

实施例9.结果：在存在GnT I的情况下，JW152细胞中重组EPO 的稳定表达

图2和图3中呈现的数据都来自短暂转染的细胞。为了揭示由稳 定转染的细胞产生的EPO的唾液酸化模式，以pEIG转染JW152细 胞，并以G418进行选择。

在选择2周后，挑取单克隆并在24孔板中在G418的选择压力 下再培养2周。通过IEF来分析由10个所述随机挑取的稳定转染的 克隆产生的EPO。

如图10中所示，由不同克隆产生的所有EPO样品都是高度唾液 酸化的。所述唾液酸化模式与图3中所示的由短暂转染细胞产生的 EPO的唾液酸化模式非常类似。

图11中显示的结果可表明，由不同的稳定的克隆产生的所有样 品EPO的总体唾液酸化都不同，但总的说来，其唾液酸化不及图10 中的EPO样品。

实施例10.结果：RCA-I处理下存活的所有CHO细胞都具有功 能异常的GnT I基因，并且在被GnT I共转染时对其蛋白质的唾液 酸均更好

已知RCA-I会特异性结合β-Gal残基。在理论上，只要细胞不将 β-Gal表达为其表面糖蛋白上的末端糖，它们就应在RCA-I处理下存 活并作为突变克隆被分离。

本发明人使用RCA-I分离了超过100个突变CHO克隆，希望它 们能带有不同基因的基因突变。意外地，在进行图2中所述的补偿试 验时，RCA-I处理下存活的所有克隆均被确认具有功能异常的GnT I 基因。

再者，如图9中所示，当以GnT I共转染时，这些克隆中产生的 EPO都是高度唾液酸化的。从所述突变细胞系中的一些分离mRNA 并反转录成cDNA。使用所述cDNA作为模板通过PCR扩增GnT I 的编码区，并克隆至pcDNA3.1中。

测序分析揭示，在这些突变细胞系的GnT I基因中有9个不同的 点突变，表明它们来自不同的原始突变细胞(参见上表D1)。它们 中的一些例如JW152带有产生提前终止密码子的点突变。其余带有 改变氨基酸残基的GnT I编码区突变。将9个突变细胞系(每一个均 具有不同的GnT I基因突变)以pEIG转染。在通过IEF进行分析时， 由所有9个细胞系产生的EPO都是高度唾液酸化的(数据未显示)。

实施例10.JW152和其他CHO GnT1突变体中的唾液酸化模式

如图5中所示，在以RCA凝集素选择的9个CHO糖基化突变 体中均观察到了EPO的不完全唾液酸化，每一所述突变体都带有不 同的导致GnT1功能丧失(与CHO野生型相比)的GnT1基因突变。

如图6中所示，由9个CHO糖基化突变体产生的EPO(每一个 都带有不同的GnT1基因突变)在恢复后都具有优于CHO野生型的 唾液酸化模式。

图7示出以一种不同的糖蛋白分子EPO-Fc(实际上是一种促红 细胞生成素融合蛋白质)的等电聚焦样品进行实验的结果。所述实验 以上文对EPO表达和IEF分析所列出的方案进行，不同之处仅在于 使用具有不同编码序列的表达载体。

左侧道示出以包含EPO-Fc编码序列的表达载体转染的CHO-K1 细胞中的EPO-Fc表达。中间道示出以包含EPO-Fc编码序列的表达 载体转染的JW152细胞中的EPO-Fc表达。右侧道示出以包含 EPO-Fc编码序列的表达载体和包含功能性GnT1编码序列的表达载 体共转染的JW152细胞中的EPO-Fc表达。如图7中所示，即使用 不同的模型糖蛋白，经恢复的JW152仍保持了较优的唾液酸化。

这些结果表明，即使用不同的模型糖蛋白，经恢复的JW152仍 保持了较优的唾液酸化。

图12示出在贴壁培养中的稳定JW152细胞系中观察到的唾液酸 化模式在悬浮培养中得以保持。

总之，本发明人已经开发了分离新CHO糖基化突变细胞的方法。 只要使用RCA-I处理CHO细胞，存活细胞的GnT I基因就会具有遗 传缺陷。在以GnT I共转染时，这些RCA-I抗性CHO细胞会表达具 有高度唾液酸化的N-聚糖的重组糖蛋白。

实施例11.HPAEC色谱图

图8的照片显示，HPAEC色谱图显示从在共表达功能性GnT I 的JW152细胞中表达的EPO-Fc上切下的更好地唾液酸化的聚糖。 使用亲和纯化通过蛋白A结合的色谱柱来纯化在CHO-K1中和在以 GnT I共转染的JW152中短暂表达的EPO-Fc。通过以肽:N-糖苷酶 F(PNGase F)处理将等量EPO-Fc上的聚糖切下，并依照附着于所 述聚糖的唾液酸数目使用高pH阴离子交换色谱(HPAEC)分离。

所述色谱清楚地显示，当与CHO-K1样品比较时，JW152样品 在4S基团的峰更高，在1S基团的峰更低。

参考文献

Weikert et al.(1999)Engineering Chinese hamster ovary cells to  maximize sialic acid content of recombinant glycoproteins.Nature  Biotechnology 17:1116.

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在不偏离本发明的范围和主旨的情况下，本发明所述方法和系统 的多种修改和变化对本领域技术人员是显而易见的。虽然本发明是结 合具体优选的实施方案来描述的，但应理解所要求保护的发明不应被 不适当地局限于这些具体的实施方案。事实上，对分子生物学或相关 领域的技术人员显而易见的对所述用于实施本发明的模式的多种修 改意欲在权利要求的范围内。