一种改善植物钾素吸收效率,对抗缺钾胁迫的方法及其中使用的重组表达载体

摘要

本发明公开了一种改善植物钾素吸收效率，对抗缺钾胁迫的方法及其使用中的重组表达载体在水稻上的应用。用特异地响应缺钾信号的启动子调控植物根发育相关基因表达的重组表达载体转化到植物中获得转基因植物，在钾素供应充足时，转基因植物即具有旺盛生长的根系；在钾素养分缺乏时，启动子特异的在根部驱动根发育基因的过量表达，增强转基因植物的根系生长，根系生物量和根系活力均显著提高，从而增加对钾素等营养元素的吸收利用，提高对缺钾胁迫的适应继而显著增加产量，达到直接通过根系构型的改变来提高植物钾素养分吸收的目的。本发明方法可特异且直接的改善植物的根系生长，在田间钾素养分供应缺乏的环境下，高效的提高钾素吸收，缓解低钾对植物生长的不利影响，从而减少钾肥的施用以提高经济效益。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种改善植物钾素吸收效率，对抗缺钾胁迫的方法及其中使用的 重组表达载体。

背景技术

钾是植物生长发育过程中非常重要的大量矿质营养元素之一，占到了植物干重的10％[1‐3]。钾对维持 离子稳态、渗透调节、蛋白代谢、酶活、膜极化和繁多的代谢过程有关键的作用[4‐6]。此外，植物体中重 要的生理过程：光合、光呼吸以及生长，都受到可利用钾的影响[7,8]。土壤中钾浓度范围在0.1‐1mM，由于 局部耗竭，在植物根际土壤中的钾浓度会显著低于上述水平[9]。钾可用性受到植物生长环境的限制，钾缺 乏会导致植物体内总钾量降低，尤其在根部快速发生[10‐14]。长期缺钾，植物会呈现生长抑制和黄化病， 尤其在老叶中首先出现[15]。在农艺生产上，发展中国家经常采取施用化肥来提高作物的产量和质量，然而 大量使用化肥，不仅不会提高产量，反而会导致土壤中营养元素的流失并造成环境污染。与此相反，在很 多资源有限的国家，不充分的施肥限制了作物的最优产量[16]。因此通过有效的生物技术手段，提高植物自 身对土壤中有效钾的利用，减少与完善钾肥的使用与管理，对于生态环境的保护和资源的可持续利用有重 要意义。

随着生物技术的迅速发展，植物体中参与钾吸收和转运的分子机制以及对有效钾不同程度上的分子响 应机制越来越多的被研究发现。基于目前的研究进展，植物采取4大策略来提高对钾的利用效率：(1)增加 根系体积；(2)提高土壤中钾的吸收效率和在植物体内的转运；(3)增加土壤中钾的可移动性；(4)通过对与钾 利用有关的数量性状的研究，用分子标记辅助的分子遗传育种手段创建钾高效利用的新品种[17]。缺钾不仅 影响植物侧根的发生和发育[18]，也抑制了主根的生长[19‐21]。在拟南芥中，低钾胁迫对侧根和主根的生长 有拮抗作用[22]。在水稻中，钾饥饿降低了植株的根冠比[23]。因此，改善根系生长是植物提高对缺钾胁迫 的适应最直接和有效途径。

KT/HAK/KUP基因家族在众多植物中先后被发现，该家族中的很多基因，例如AtHAK5,CaHAK1,HvHAK1, LeHAK5,ThHAK5在缺钾胁迫时显著诱导表达[24‐27]。在水稻的27个HAK基因中，OsHAK1,OsHAK5,OsHAK7 和OsHAK16在钾饥饿胁迫下，根系中的表达量显著上调[28‐31]

WUSCHEL相关的同源异形盒基因WOX是发育的调控的因子[32]。WOX基因家族在拟南芥和水稻中至少 分别有15和13个成员组成，它们中的一些参与了调控植物根系发育过程中细胞的分裂和分化过程[33‐35]。 例如，在拟南芥中，WOX2和WOX8调控了胚根形成过程中细胞的分化[36]。WOX5对茎顶端分生细胞的维 持有重要作用[37]。WOX9参与了根尖早期的胚性生长[38]。在水稻中，WOX3A对侧根和根毛的发育都起作 用[33，34]。WOX11通过直接抑制不定根原基中A型细胞分裂素相应因子RR2的表达，对不定根的发生和 生长起关键作用[39]。将根发育相关基因在植物根系中特异受缺钾胁迫诱导表达，使植物在钾饥饿逆境条件 下通过增加根系生长来提高钾的吸收利用效率的应用研究鲜有报道。

1.Adams,E.and Shin,R.(2014)Transport,signaling,and homeostasis of potassium and sodium in plants.J.Integr. Plant Biol.56,231‐249.

2.Leigh,R.A.and Wyn Jones,R.G.(1984)A hypothesis relating critical potassium concentrations for growth to the  distribution and function of this ion in the plant cell.New Phytol.97,1‐13.

3.Walker,D.J.,Leigh,R.A.and Miller,A.J.(1996)Potassium homeostasis in vacuolate plant cells.Proc.Natl.Acad. Sci.USA 93,10510‐10514.

4.Amtmann,A.,Hammond,J.P.,Armengaud,P.and White,P.J.(2006)Nutrient sensing and signalling in plants: Potassium and phosphorus.Adv.Bot.Res.43,209‐257.

5.Hastings,D.F.and Gutknecht,J.(1978)Potassium and turgor pressure in plants.J.Theor.Biol.73,363‐366.

6.Schachtman,D.P.and Shin,R.(2007)Nutrient sensing and signaling:NPKS.Annu.Rev.Plant Biol.58,47‐69.

7.Gattward,J.N.,Almeida,A.A.,Souza,J.O.,Jr.,Gomes,F.P.and Kronzucker,H.J.(2012)Sodium‐potassium  synergism in Theobroma cacao:stimulation of photosynthesis,water‐use efficiency and mineral nutrition. Physiol.Plant.146,350‐362.

8.Pettogrew,W.T.(2008)Potassium influences on yield and quality production for maize,wheat,soybean and  cotton.Physiol.Plant.133,670‐681.

9.Jungk,A.and Claassen,N.(1986)Availability of phosphate and potassium as a result of interactions between  root and soil in the rhizosphere.Zeitschrift für und Bodenkunde 149,411–427.

10.Drew,M.C.,Saker,L.R.,Barber,S.A.and Jenkins,W.(1984)Changes in kinetics of phosphate and potassium  absorption in nutrient‐deficient barley roots measured by a solution‐depletion technique.Planta 160, 490–499.

11.Pilot,G.,Gaymard,F.,Mouline,K.,Chérel,I.and Sentenac,H.(2003)Regulated expression of Arabidopsis  shaker K⁺channel genes involved in K⁺uptake and distribution in the plant.Plant Mol.Biol.51,773–787.

12.Gierth,M.,P.and Schroeder,J.I.(2005)The potassium transporter AtHAK5functions in K⁺deprivation‐induced high‐affinity K⁺uptake and AKT1K⁺channel contribution to K⁺uptake kinetics in  Arabidopsis roots.Plant Physiol.137,1105–1114.

13.Nieves‐Cordones,M.,Martinez‐Cordero,M.A.,Martinez,V.and Rubio,F.(2007)An NH4⁺‐sensitive component  dominates high‐affinity K⁺uptake in tomato plants.Plant Sci.172,273–280.

14.Ma,T.L.,Wu,W.H.and Wang,Y.(2012)Transcriptome analysis of rice root responses to potassium deficiency. BMC Plant Biol.12,161.

15.Armengaud,P.,Breitling,R.and Amtmann,A.(2004)The potassium‐dependent transcriptome of Arabidopsis  reveals a prominent role of jasmonic acid in nutrient signaling.Plant Physiol.136,2556–2576.

16.Food and Agriculture Organization of the United Nations(2006)Fertilizer use by crop.FAO publications,Rome, Italy.

17.Shin,R.(2014)Strategies for improving potassium use efficiency in plants.Mol.Cells,37,435‐502.

18.Shin,R.and Schachtman,D.P.(2004)Hydrogen peroxide mediates plant root cell response to nutrient  deprivation.Proc.Natl Acad.Sci.USA,101,8827‐8832.

19.Jung,J.Y.,Shin,R.and Schachtman,D.P.(2009)Ethylene mediates response and tolerance to potassium  deprivation in Arabidopsis.Plant Cell,21,607–621.

20.Kim,M.J.,Ciani,S.and Schachtman,D.P.(2010)A peroxidase contributes to ROS production during  Arabidopsis root response to potassium deficiency.Mol.Plant,3,420‐427.

21.Gruber,B.D.,Giehl,R.F.,Friedel,S.and von Wirén,N.(2013)Plasticity of the Arabidopsis root system under  nutrient deficiencies.Plant Physiol.163,161‐179.

22.Kellermeier,F.,Chardon,F.and Amtmann,A.(2013)Natural variation of Arabidopsis root architecture reveals  complementing adaptive strategies to potassium starvation.Plant Physiol.161,1421–1432.

23.Cai,J.,Chen,L.,Qu,H.,Lian,J.,Liu,W.,Hu,Y.and Xu,G.(2012)Alteration of nutrient allocation and  transporter genes expression in rice under N,P,K,and Mg deficiencies.Acta Physiol.Plant.34,939‐946.

24.Wang,Y.H.,Garvin,D.F.and Kochian,L.V.(2002)Rapid induction of regulatory and transporter genes in  response to phosphorus,potassium,and iron deficiencies in tomato roots.Evidence for cross talk and  root/rhizosphere‐mediated signals.Plant Physiol.130,1361‐1370.

25.Fulgenzi,F.R.,Peralta,M.L.,Mangano,S.,Danna,C.H.,Vallejo,A.J.,Puigdomenech,P.and Santa‐María,G.E. (2008)The ionic environment controls the contribution of the barley HvHAK1transporter to potassium  acquisition.Plant Physiol.147,252‐262.

26.Qi,Z.,Hampton,C.R.,Shin,R.,Barkla,B.J.,White,P.J.and Schachtman,D.P.(2008)The high affinity K⁺transporter AtHAK5plays a physiological role in planta at very low K+concentrations and provides a  caesium uptake pathway in Arabidopsis.J.Exp.Bot.59,595‐607.

27.Alemán,F.,Nieves‐Cordones,M.,Martínez,V.and Rubio,F.(2009)Differential regulation of the HAK5genes  encoding the high‐affinity K⁺transporters of Thellungiella halophila and Arabidopsis thaliana.Environ.Exp. Bot.65,263‐269.

28.M.A.,Garciadeblas,B.,Cubero,B.and ‐Navarro,A.(2002)Inventory and functional  characterization of the HAK potassium transporters of rice.Plant Physiol.130,784‐795.

29.Okada,T.,Nakayama,H.,Shinmyo,A.and Yoshida,K.(2008)Expression of OsHAK genes encoding potassium  ion transporters in rice.Plant Biotech.25,241‐245.

30.Horie,T.,Sugawara,M.,Okada,T.,Taira,K.,Kaothien‐Nakayama,P.,Katsuhara,M.,Shinmyo,A.and Nakayama, H.(2011)Rice sodium‐insensitive potassium transporter,OsHAK5,confers increased salt tolerance in  tobacco BY2cells.J.Biosci.Bioeng.111,346‐356.

31.Yang,T.,Zhang,S.,Hu,Y.,Wu,F.,Hu,Q.,Chen,G.,Cai J.,Wu T.,Moran,N.,Yu,L.and Xu,G.(2014)The role of  OsHAK5in potassium acquisition and transport from roots to shoots in rice at low potassium supply levels. Plant Physiol.online.

32.Wang,W.,Li,G.,Zhao,J.,Chu,H.,Lin,W.,Zhang,D.,Wang,Z.and Liang,W.(2014)DWARF TILLER1,a  WUSCHEL‐related homeobox transcription factor,is required for tiller growth in rice.PLOS Genet.10, e1004154.

33.Cho,S.H.,Yoo,S.C.,Zhang,H.,Pandeya,D.,Koh,H.J.,Hwang,J.Y.,Kim,G.T.and Paek,N.C.(2013)The rice  narrow leaf2and narrow leaf3loci encode WUSCHEL‐related homeobox 3A(OsWOX3A)and function in  leaf,spikelet,tiller and lateral root development.New Phytol.198,1071‐1084.

34.Yoo,S.C.,Cho,S.H.and Paek,N.C.(2013)Rice WUSCHEL‐related homeobox 3A(OsWOX3A)modulates  auxin‐transport gene expression in lateral root and root hair development.Plant Signal.Behav.8,e25929.

35.Cheng,S.,Huang,Y.,Zhu,N.and Zhao,Y.(2014)The rice WUSCHEL‐related homeobox genes are involved in  reproductive organ development,hormone signaling and abiotic stress response.Gene.549,266‐274.

36.Breuninger,H.,Rikirsch,E.,Hermann,M.,Ueda,M.and Laux,T.(2008)Differential expression of WOX genes  mediates apical‐basal axis formation in the Arabidopsis embryo.Dev.Cell,14,867‐876.

37.Stahl,Y.,Wink,R.H.,Ingram,G.C.and Simon,R.(2009)A signaling module controlling the stem cell niche in  Arabidopsis root meristem.Curr.Biol.19,909–914.

38.Wu,X.,Dabi,T.and Weigel,D.(2005)Requirement of homeobox gene STIMPY/WOX9for Arabidopsis meristem  growth and maintenance.Curr.Biol.15,436‐440.

39.Zhao,Y.,Hu,Y.,Dai,M.,Huang,L.and Zhou,D.X.(2009)The WUSCHEL‐related homeobox gene WOX11is  required to activate shoot‐borne crown root development in rice.Plant Cell,21,736‐748.

发明内容

本发明的目的是通过特异诱导表达根发育相关基因，针对低钾胁迫逆境，提供一种植物直接改善钾素 吸收效率的方法。

本发明的另一目的是提供水稻高亲和钾离子转运蛋白基因OsHAK16启动子特异调控根发育基因WOX11 的植物表达载体。

本发明的技术问题可通过如下技术方案解决：

一种改善植物钾素吸收效率，对抗缺钾胁迫的方法，即使植物在缺钾胁迫下，提高其根系生长。用特 异的在根系中响应缺钾信号的启动子调控植物根发育相关基因表达的重组表达载体转化到植物中获得转基 因植物，在钾素养分缺乏时，响应缺钾信号的启动子特异的驱动根发育基因的过量表达，提高转基因植物 根系生长，从而达到提高钾素吸收利用的目的。

一种改善植物钾素吸收效率，对抗缺钾胁迫的方法，优选将水稻高亲和钾离子转运蛋白基因OsHAK16 启动子(为较特异的根系响应缺钾信号的启动子)特异调控根发育基因WOX11的植物表达载体转化到植物中 获得转基因植物，在钾素缺乏时水稻高亲和钾离子转运蛋白基因OsHAK16启动子特异地驱动根发育基因 WOX11在植物根系中过量表达，使转基因植物根系大量生长，从而达到提高钾素吸收利用的目的。

其中，所述的水稻高亲和钾离子转运蛋白基因OsHAK16启动子特异调控根发育基因WOX11的植物表 达载体为重组表达载体优选pTCK303-OsHAK16-WOX11，是将OsHAK16启动子和WOX11基因分别插入 到pTCK303表达载体的HindⅢ,BamHI和BamHI,SacI位点所得。

本发明方法中，植物根系生长的变化通过肉眼观测或者根系扫描仪测定。植物中钾含量的测定通过ICP 测定，可溶性糖通过蒽酮比色法测定。

本发明方法中，不论植物生长在生根管、水培还是模拟田间的桶培条件下，植物的生物量和根冠比均显 著提高，K⁺浓度和总量在根系和地上部均显著提高，可溶性糖含量以及糖份由源到库的分配也显著增强，尤 其是当植物生长在模拟田间试验的桶培中，不施钾肥的土壤中的钾浓度为70mg/kg，是中度缺钾土壤，在该 条件下，转基因植物根系和地上部总钾积累量高于对照280％和72％，同时地上部的生物量和产量也分别 提高了16％和24％，说明通过在缺钾条件下特异的提高根系生长，可以有效的提高植物体全生育期的总钾 的积累和糖份的转运，显著提高植物的产量。

一种用于特异诱导根系生长发育的重组表达载体，含有水稻高亲和钾离子转运蛋白基因OsHAK16启动 子以及根发育基因WOX11，且所述的根发育基因WOX11位于水稻高亲和钾离子转运蛋白基因OsHAK16启 动子的下游，受水稻高亲和钾离子转运蛋白基因OsHAK16启动子特异调控。

所述的重组表达载体优选以pTCK303质粒为出发质粒，在HindⅢ,BamHI酶切位点插入所述的水稻磷 酸盐转运蛋白基因OsHAK16启动子，在BamHI,SacI酶切位点位点插入所述的根发育基因WOX11。

所述的植物优选重要粮食作物，进一步优选水稻。

本发明所述的重组表达载体的构建方法，以水稻日本晴基因组DNA为模板，以引物OsHAK16‐303‐F/ OsHAK16‐303‐R克隆得到所述的OsHAK16启动子，以水稻日本晴转录组cDNA为模板，以引物WOX11‐303‐F/ WOX11‐303‐R克隆得到所述的WOX11基因，将其分别插入到克隆载体pMD19‐T上，分别经HindⅢ,BamHI 和BamHI,SacI双酶切后依次连接到pTCK303表达载体进行两次重组反应而得到。

本发明所述的重组表达载体的构建方法，优选包含以下步骤：

分别提取水稻日本晴基因组DNA和转录组cDNA，设计引物扩增水稻OsHAK16启动子和WOX11基因片 段，

OsHAK16启动子上游引物：

OsHAK16‐303‐F：5'‐CCCAAGCTTCCCACGATGTCCTCCAGTA‐3'(SEQ ID NO.1)

OsHAK16启动子下游引物：

OsHAK16‐303‐R：5'‐TATGGATCCGCTAGGTACGCTCACCACC‐3'(SEQ ID NO.2)

WOX11基因上游引物：

WOX11‐303‐F：5'‐TATGGATCCCACCGAACAAGGCAGCTA‐3'(SEQ ID NO.3)

WOX11基因下游引物：

WOX11‐303‐R：5'‐TTCGAGCTCCGAGAACGGGATACATACAAG‐3'(SEQ ID NO.4)

以水稻日本晴基因组DNA和转录组cDNA为模板进行聚合酶链式PCR反应，产物连接到pMD19‐T载体， 得到OsHAK16‐T和WOX11‐T中间载体，转化入大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性克隆对其质粒进行商业化测 序，OsHAK16启动子序列如SEQ ID NO.5所示，WOX11基因片段序列如SEQ ID NO.6所示。

测序验证无误后，用HindⅢ/BamHI对OsHAK16-T和pTCK303载体分别进行双酶切，通过T4DNA 连接酶定向连接，转化到大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性克隆质粒，得到pTCK303-OsHAK16重组表达载 体；再用BamHI/SacI对WOX11-T和pTCK303-OsHAK16表达载体分别进行双酶切，通过T4DNA连接 酶定向连接，转化到大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性克隆质粒，得到所述的重组表达载体，命名为pTCK303- OsHAK16-WOX11。

本发明所述的重组表达载体在通过改善根系生长来提高钾素吸收效率中应用。

本发明的有益效果：

1、本发明在水稻中大量筛选响应植物缺钾信号的启动子和根发育相关基因，现有技术中虽然公开了 OsHAK16的序列信息，但尚未见该基因功能的任何报道。发明人通过研究发现来源于水稻的OsHAK16为 缺钾响应启动子，其对缺钾的响应具有根系特异性和诱导高效性；筛选到水稻的调控根系发育相关转录因 子关键基因WOX11为调控根系生长基因，其超表达及沉默对水稻根系的发生和发育具有显著调控功能。基 于上述研究成果，本发明创造性的使用新发现的缺钾响应启动子调控水稻的调控根系发育相关转录因子关 键基因WOX11构建重组表达载体，并进而将其转染到粮食作物中，通过改善根系生长来提高钾素吸收效率。

2、本发明筛选到的OsHAK16启动子和WOX11基因均来自于水稻，不是外源基因，因此具有生物安 全性。同时，OsHAK16启动子具有表达组织特异性和缺钾诱导高效性，WOX11基因被详细研究在水稻中 对不定根的形成具有核心关键作用，两者一起能够保证WOX11能在特定的缺钾胁迫环境下在根系中特异表 达，从而增强根系的生长以提高缺钾胁迫的适应性，达到钾素高效利用的目的。

3、本发明所构建的水稻高亲和钾离子转运蛋白基因OsHAK16启动子特异调控根发育基因WOX11的 植物表达载体为首次报道，可直接用于农杆菌介导的植物遗传转化，获得缺钾特异表达WOX11基因的新种 质。

4、对野生型和转基因水稻进行缺钾养分处理，在不同培养介质以及不同水稻生育期，与野生型相比， 转基因水稻均能够产生大量的不定根，根冠比显著增加，根系和地上部的总价量显著提高，在各培养介质 中均达到钾高效吸收的目的。

5、在HAK16p:WOX11转基因水稻中，发现与细胞分裂素响应相关的A型RR基因：RR1、RR4、RR6、 RR7、RR8均显著下调，与细胞分裂素相应相关的AUX/IAA基因：IAA11、IAA13、IAA23、IAA31均显 著上调，同时生长素外运蛋白基因的表达有显著提高或抑制，具体PIN2和PIN10a显著上调，PIN5a和PIN9 显著下调，这些基因的显著变化表明，HAK16p:WOX11转基因水稻具有的特异表型与细胞分裂素、生长素 在水稻体内的信号响应和运输变化紧密相关。

6、在HAK16p:WOX11转基因水稻中，可溶性糖含量在缺钾胁迫条件下，成熟叶片(光合碳水化合物 合成源器官)以外，在碳水化合物(糖份)主要利用库器官：根系和发育中的叶片，以及糖份主要运输器 官：茎秆和叶鞘中均显著高于野生型水稻。转基因水稻在缺钾胁迫下，体内显著积累的钾离子有利于植株 糖份从源到库的转运，糖份的高效转运更有利于根系的快速生长。进一步研究发现，在源器官(成熟叶片) 中，水稻长距离转运蛋白基因SUT1和SUT4表达显著高于野生型，而在库器官(根系)中，单糖转运蛋白 基因MST1、MST3、MST4、MST5的表达也显著高于野生型，糖转运蛋白基因的大量表达促进可溶性糖在 转基因水稻中从源到库的转运。

7、HAK16p:WOX11转基因水稻不仅表现出具有大量不定根的表型，同时桶培生长后期，转基因水稻 地上部生物量和有效分蘖在缺钾胁迫下也高于野生型16％和37％，均达到显著性差异，地上部株型的变化 与体内总K积累和糖份高效转运一起，使转基因水稻在缺钾桶培条件下，产量增加了24％。

附图说明

图1植物表达载体pTCK303‐OsHAK16‐WOX11构建方法示意图。

图2OsHAK16组织定位和表达模式分析，A‐F：OsHAK16启动子启动GUS报告基因的转基因水稻缺钾培养 不同部位的GUS染色，A：根尖；B：距根尖前1cm；C：距根尖前4cm；D：侧根发生区树脂切片；E：放 大的D图；F：叶片，G：野生型水稻中HAK16在正常供钾(1mM K)缺钾处理(0.1mM K)下的相对表达 量。

图3转基因水稻分子鉴定和表型照片，A：转基因水稻拷贝数鉴定；B：转基因水稻与野生型相比WOX11 在根系和地上部的相对表达量；C‐D：转基因水稻与野生型在正常供钾(1mM K)和缺钾胁迫(0.1mM K) 下的表型照片。

图4转基因和野生型水稻生根管不同K浓度处理下的根系生长情况，A：14天苗龄转基因水稻和野生型水 稻在不同钾浓度下根系生物量；B：14天苗龄转基因水稻和野生型水稻在不同钾浓度下不定根数；C：14天 苗龄转基因水稻和野生型水稻在不同钾浓度下总根长；D：14天苗龄转基因水稻和野生型水稻在不同钾浓度 下根系活力。

图5转基因和野生型水稻生根管不同K浓度处理下的K浓度和K积累量，A：14天苗龄转基因水稻和野生 型水稻在不同钾浓度下根系K浓度；B：14天苗龄转基因水稻和野生型水稻在不同钾浓度下地上部K浓度； C：14天苗龄转基因水稻和野生型水稻在不同钾浓度下根系K总量；D：14天苗龄转基因水稻和野生型水稻 在不同钾浓度下地上部K总量。

图6转基因和野生型水稻细胞分裂素A型响应基因(RR基因)、生长素响应基因(IAA基因)和生长素外运 蛋白基因(PIN基因)在正常供钾和缺钾条件下的相对表达量比较分析。A，C，E：正常供钾(1mM K)下 转基因和野生型水稻RR基因(A)、IAA基因(C)和PIN基因(E)的相对表达量；B，D，F：缺钾(0.1mM  K)处理下转基因和野生型水稻RR基因(B)、IAA基因(D)和PIN基因(F)的相对表达量；G：WOX11调 控根系发生的信号转导通路。

图7转基因和野生型水稻在正常和缺钾水培处理下根系生长、K浓度和K总量比较分析，A：转基因水稻和 野生型水稻在不同钾浓度下根系生物量；B：转基因水稻和野生型水稻在不同钾浓度下根冠干重比；C‐D： 转基因水稻和野生型水稻在正常(1mM K，C)和缺钾(0.1mM K，D)处理下不同部位K浓度；E‐F：转基 因水稻和野生型水稻在正常(1mM K，E)和缺钾(0.1mM K，F)处理下根系和地上部K总量。

图8转基因和野生型水稻在正常和缺钾水培处理下不同部位可溶性糖浓度和糖转运相关基因SUT、MST的表 达量分析，A‐B：转基因水稻和野生型水稻在正常(1mM K，A)和缺钾(0.1mM K，B)处理下不同部位可 溶性糖浓度；C‐D：转基因水稻和野生型水稻在正常(1mM K，C)和缺钾(0.1mM K，D)处理下源叶中SUT 基因表达量比较，E‐F：转基因水稻和野生型水稻在正常(1mM K，E)和缺钾(0.1mM K，F)处理下库根中 MST基因表达量比较。

图9转基因和野生型水稻在缺钾(水稻土不额外施加钾肥)和正常钾(额外施加200mg/kg钾肥)桶培处理 下地上部、根系表型，根系生长比较分析，A‐B：转基因和野生型水稻在正常钾(额外施加200mg/kg钾肥A) 和缺钾(水稻土不额外施加钾肥B)桶培处理下成熟期地上部表型照片。C‐F：转基因和野生型水稻在缺钾 (水稻土不额外施加钾肥)桶培处理下分蘖盛期根系表型照片。G：转基因水稻和野生型水稻在不同钾桶 培处理下分蘖期根系生物量；H：转基因水稻和野生型水稻在不同钾桶培处理下分蘖期根冠干重比。

图10转基因和野生型水稻在缺钾(水稻土不额外施加钾肥)和正常钾(额外施加200mg/kg钾肥)桶培处 理下成熟期不同部位K浓度、K总量和可溶性糖含量，A‐B：转基因和野生型水稻在正常钾(额外施加200mg/kg 钾肥A)和缺钾(水稻土不额外施加钾肥B)桶培处理下成熟期不同部位K浓度；C‐D：转基因和野生型水 稻在正常钾(额外施加200mg/kg钾肥C)和缺钾(水稻土不额外施加钾肥D)桶培处理下成熟期根系和地 上部K总量；E‐F：转基因和野生型水稻在正常钾(额外施加200mg/kg钾肥E)和缺钾(水稻土不额外施 加钾肥F)桶培处理下成熟期不同部位可溶性糖浓度。

具体实施方式

实施例1.OsHAK16启动子和WOX11基因的克隆：

1)提取自然条件下正常生长的日本晴水稻叶片基因组DNA，以此作为下一步PCR扩增的模板；

2)PCR引物设计与扩增用软件Primer 5.0设计引物序列，在OsHAK16启动子引物两端分别加上酶 切位点HindⅢ(AAGCTT)和BamHI(GGATCC)，在WOX11基因引物两端分别加上酶切位点BamHI (GGATCC)和SacI(GAGCTC)。

OsHAK16启动子上游引物：

OsHAK16-303-F：5'-CCCAAGCTTCCCACGATGTCCTCCAGTA-3'(SEQ ID NO.1)

OsHAK16启动子下游引物：

OsHAK16-303-R：5'-TATGGATCCGCTAGGTACGCTCACCACC-3'(SEQ ID NO.2)

WOX11基因上游引物：

WOX11-303-F：5'-TATGGATCCCACCGAACAAGGCAGCTA-3'(SEQ ID NO.3)

WOX11基因下游引物：

WOX11-303-R：5'-TTCGAGCTCCGAGAACGGGATACATACAAG-3'(SEQ ID NO.4)

PCR反应体系均为25μl：PCR Buffer 2.5μl，dNTP Mix 2μl，上下游引物各1μl，模板1μl,Taq酶0.5μl， 双蒸水17μl。

PCR程序如下：94℃预变性3min，94℃变性30s，58℃复性延伸2min，30个循环后，72℃10min，10℃ 保持。

扩增的PCR产物通过质量比1％琼脂糖凝胶电泳检测，OsHAK16启动子大小为1828bp，序列如SEQ ID  NO.5所示；WOX11基因大小为1257bp，序列如SEQ ID NO.6所示。

实施例2.植物表达载体pTCK303‐OsHAK16‐WOX11的构建：

1)OsHAK16启动子和WOX11基因中间载体的构建将OsHAK16启动子和WOX11基因的PCR产物 经琼脂糖电泳分离后切胶回收，将回收的片段分别与pMD19-T载体连接，酶连体系总体积10μl，包含5μl 连接液，1μl的pMD19-T载体，3-4μl的PCR纯化产物，用水补足10μl，然后16℃连接过夜；再转入大 肠杆菌DH5α感受态细胞中涂在含有100μg/mL安苄的LB固体培养基上生长12h-14h后，挑取阳性菌落进 行DNA测序。将测序正确的菌液加入等体积体积比30％甘油于-70℃保存备用，分别获得含有OsHAK16 启动子序列和WOX11基因全长序列的重组质粒，命名为OsHAK16-T和WOX11-T。

2)OsHAK16基因启动子特异调控WOX11基因植物表达载体的构建用HindⅢ和BamHI双酶切 OsHAK16-T，将OsHAK16启动子片段从中间载体切下，回收片段。同时用HindⅢ和BamHI双酶切表达 载体pTCK303(Eamens A L,Blanchard C L,Dennis E S,et al.A bidirectional gene trap construct suitable for T‐ DNA and Ds‐mediated insertional mutagenesis in rice(Oryza sativa L.)[J].Plant biotechnology journal,2004, 2(5):367-380.)，回收剩余的线性片段，与从中间载体上切下的OsHAK16启动子片段通过T4DNA连接酶 定向连接。连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂在含有50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上 生长12h后，挑取阳性克隆，经HindⅢ和BamHI酶切验证片段大小无误后，保存阳性克隆，构建的重组 表达载体命名为pTCK303-OsHAK16。同样的，用BamHI和SacI双酶切WOX11-T，将WOX11基因片段 从中间载体切下，回收片段。同时用BamHI和SacI双酶切重组表达载体pTCK303-OsHAK16，回收剩余 的线性片段，与从中间载体上切下的WOX11基因片段通过T4DNA连接酶定向连接。连接产物转化到大肠 杆菌DH5α感受态细胞中，涂在含有50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上生长12h后，挑取阳性克隆， 经BamHI和SacI酶切验证片段大小无误后，保存阳性克隆，构建的二次重组表达载体命名为pTCK303- OsHAK16-WOX11(图1)。

最后通过电击法将pTCK303-OsHAK16-WOX11质粒转化至农杆菌EHA105的感受态细胞中，涂在含 有卡那霉素和链霉素均为50μg/ml的YEP固体培养基上生长48h后，挑取阳性菌落，提取质粒，经Hind  Ⅲ/BamHI和BamHI/SacI两个酶切体系验证无误后，菌液加入等体积30％甘油于-70℃保存，转基因备用。

3)转基因水稻的获得将以上获得的转有pTCK303-OsHAK16-WOX11质粒的农杆菌，侵染水稻愈伤 组织，共培养2.5天后洗菌，将晾干的愈伤转入含500mg/L羧苄青霉素和50mg/L潮霉素的选择培养基上进 行第一轮选择，28℃光照培养2周，将长有抗性愈伤的初始愈伤转到含500mg/L羧苄青霉素和80mg/L潮 霉素的选择培养基上进行第二轮选择，28℃光照培养，直到长出颗粒性的抗性愈伤组织。挑取同一愈伤来 的颜色鲜黄的抗性愈伤转入装有分化培养基的塑料广口瓶中分化培养，等待分化成苗(25-30d)，待苗长至 2-3cm左右，放入生根培养基中壮苗。将苗根部和茎叶分化得较完好的生根管挑出，加入适量无菌水，炼苗 3d至一周左右，洗去琼脂，移栽到水稻营养液中生长并检测，阳性苗转入营养土中培养至收获，得到T1 代转基因种子。

3.1)各类常用培养基配方(1L)

注：上述2种培养基均用双蒸水定溶到1L,配成固体时需另加琼脂15‐20g/L。高压灭菌20min后备用。

3.2)激素及常用抗生素配制方法

3.3)水稻组培培养基母液配方

3.4)粳稻成熟胚愈伤组织诱导培养基(1L用量)

3.5)粳稻成熟胚愈伤组织继代培养基(1L用量)

3.6)粳稻共培养培养基(1L用量)

3.7)愈伤选择培养基(1L用量)

3.8)粳稻分化培养基(1L用量)

3.9)粳稻生根培养基(1L用量)

3.10)悬浮农杆菌侵染愈伤组织的培养基(AAM感菌液，1L用量)

4)转基因水稻拷贝数鉴定分别采用2种核酸限制性内切酶HindⅢ、BamHI，对转基因水稻DNA样 品进行以下操作：ⅰ基因组DNA的消化：在标记好的1.5ml离心管中加入100μg DNA，用灭菌双蒸水调 整体积至100μl。在1.5ml离心管中制备酶消化反应液，根据所用的内切酶说明书进行，取15μl消化反应 液，与样品混匀后37℃反应过夜。ⅱ在1.0％琼脂糖凝胶上分离消化产物：制备1.0％琼脂糖凝胶，加10μl 10x loading buffer到100μl的酶消化产物中，上样并电泳，60～70V，4℃约1h，从上样孔计染料前沿约 10～12cm，在500ml水中加入25μl 10mg/ml EB，染色，照相记录。ⅲSouthern印迹：依次用下列溶液 处理凝胶，并轻微摇动：变性溶液处理30分钟，倾去溶液；用水清洗2～3次，倾去溶液；中和溶液两次， 每次处理15分钟。用玻板搭建转膜平台，用一张20x SSC饱和的3M滤纸铺在玻板上，大小要比胶大，滤 纸两侧浸于20x SSC中，将胶置于滤纸上，滤纸左右边缘应各留出2～3cm的边，滤纸和胶之间要注意避 免气泡。剪一张正电荷尼龙膜，大小与胶相当，铺在胶上，膜和胶之间要注意避免气泡。将2～3层3M滤 纸用20x SSC湿润，置尼龙膜上，注意每层滤纸之间不要有气泡。在滤纸上加一叠吸水纸，再盖上一块玻 璃板，玻板上加一0.75～1kg的重物，转移过夜。转膜完成后，用铅笔在膜上作好记号，将膜在2x SSC中 洗涤20秒钟，置于滤纸上风干。在紫外交联仪中用能量在1200～1300J/cm2的UV交联2min固定膜上的 DNA。ⅳ预杂交和杂交：将5～10ml Hyb高效杂交液加入装有膜的杂交管中，42℃预杂交30min，弃去 预杂交液。将25ng/ml Dig标记的探针在100℃变性10分钟，然后快速在冰浴中冷却5分钟。将探针加到 5～10ml 42℃预热的Hyb高效杂交液中，混匀，加入杂交管中，42℃杂交炉中杂交过夜。倒去杂交液，进 行洗膜。ⅴ洗膜：室温下，30ml 2x SSC/0.1SDS洗涤2x 5分钟。65℃，1x SSC/0.1％SDS洗涤2x 15分钟。 ⅵ检测杂交信号：检测过程在室温下进行，并轻微摇动。A，封闭：准备一些大小适当的干净容器，加入 30ml封闭液，用镊子小心地将膜从杂交管中取出放入容器内，在室温下封闭30分钟。B，抗地高辛-AP抗 体的制备：将1×封闭液和抗地高辛-AP抗体按1:5000的比例配制合适的体积，混匀后加入到步骤1的容器 中，室温孵育30分钟。C，洗膜：除去抗体/封闭液，用40ml洗涤液洗(washing buffer)2次，每次洗15 分钟。D，信号检测：加15ml 1×检测缓冲液(detection buffer)，室温孵育2次，每次5分钟(确保缓冲 液均匀分布在膜上)，去掉1×检测缓冲液。ⅶ显色法检测：在10mL检测缓冲液中加入200μl的 NBT/BCIP，混匀，将膜置入显色液中，显色过夜，约16小时(中间避免震荡，可适时取出观察显色情况)。 用灭菌的双蒸水反复冲洗3～5次终止显色。在成像系统上拍照记录结果(图3A)。鉴定出的T1代单拷贝 转基因水稻扩繁后，T2代用于后续表型观测和生理指标的测定。

5)野生型和T2代转基因水稻培养将野生型和T2代转基因水稻种子(去颖壳)放入50ml无菌离心管 中，加30％次氯酸钠溶液浸泡10min；倒去次氯酸钠溶液，无菌水清洗4-5遍，最后一遍浸泡30min。将 种子小心转移到无菌滤纸上吸干，用无菌的镊子将种子小心地置入灭菌的正常和缺钾IRRI固体培养基上 (0.4％phytagel)，在组培室中28℃培养2周。

5.1)水稻营养液(IRRI)配方

微量元素营养液(μM)

缺钾处理：正常IRRI营养液中不加K₂SO₄，0.3mM KH₂PO₄换成0.2mM NaH₂PO₄和0.1mM K H₂PO₄， pH调至5.5左右。使用固体培养基时，将调好pH的营养液中加入0.4％的phytagel(100mL加0.4g)

6)正常、缺钾条件下野生型和转基因水稻WOX11基因的表达鉴定

6.1)总RNA的提取取正常、缺钾处理14天的野生型和转基因根系和地上部迅速置于液氮中冷冻保 存，按照常规方法提取总RNA，用质量比为1.7％的琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，并用分光光度计检测 总RNA的浓度和纯度。

6.2)利用上一步提取的总RNA反转录合成总cDNA，反转录试剂盒购自Fermentas公司，Canada。

6.3)qPCR分别以反转录出来的不同钾处理下野生型和转基因水稻的根系、地上部cDNA为模板，设计 特异性水稻内参和WOX11基因引物，引物序列见表1。按表2组份配制PCR反应液(冰上配制反应液)。

表1水稻内参和根发育基因WOX11的定量PCR引物

表2

PCR反应条件如下：

在正常、缺钾处理14天以后，转基因水稻根系中WOX11的相对表达量较野生型显著增加，尤其是在 缺钾条件下，而地上部在正常、缺钾处理下与野生型无明显差异，证明WOX11在转基因水稻中，被OSHAK16 启动子较特异的在根系中诱导表达，尤其是在低钾胁迫下(图3B)。WOX11在转基因水稻中的特异诱导表 达，使植株的不定根数量显著增加，根系生物量较野生型显著提高，低钾处理下，野生型水稻根系较正常 钾处理生长显著受到抑制，而转基因水稻根系在WOX11高表达的调控下，低钾处理增加了其生物量，使转 基因水稻根系生物量较正常钾处理下，更为显著的大于野生型根系(图3C-D)。转pTCK303-OsHAK16- WOX11基因水稻具有预期的能够在缺钾条件下显著增加根系生长的特点。

实施例3.转基因水稻对不同钾浓度处理根系生长的响应

1)野生型和T2代转基因水稻培养将野生型和T2代转基因水稻种子(去颖壳)放入50ml无菌离心管 中，加30％次氯酸钠溶液浸泡10min；倒去次氯酸钠溶液，无菌水清洗4-5遍，最后一遍浸泡30min。将 种子小心转移到无菌滤纸上吸干，用无菌的镊子将种子小心地置入灭菌的含不同K浓度的IRRI固体培养基 上(0.1mM K，0.5mM K，1mM K，0.4％phytagel)，以磷酸二氢钠补足磷源，具体实验步骤参照实施例 2，在组培室中28℃培养2周。

2)根系形态测定2周不同K处理之后，记录不定根数，用加拿大产的根系分析仪(Mac/WinRHIZO^TMs) 测定总根长，将植株分为根系、地上部两部分，烘干植物样品称干重得到根系生物量(干重)。

在不同浓度钾处理下，转基因水稻和野生型之间根系生长表型趋势明显不同，野生型水稻随着供钾浓 度的逐渐下降，根系生物量逐渐下降，不定根数逐渐减少，总根长也逐渐减少，而转基因水稻根系在正常 供钾条件下，各项根系生长指标都较野生型显著提高，并且随着供钾水平的逐渐降低，根系生物量、不定 根数和总根长都明显增加，在0.1mM K处理下，转基因水稻根系较野生型达到最大显著差异(图4A-C)， 说明转基因水稻在低钾胁迫下，能够显著改善根系生长。

3)根系活力的测定2周不同K处理之后，转基因和野生型水稻通过甲烯蓝吸附实验测定根系活力， 具体实验方法如下：将0.0002mol/L的甲烯蓝溶液(每毫升中含0.075mg甲烯蓝)分别倒入3个小烧杯中，编 好号码，每个烧杯中溶液体约10倍于根系体积(排水法：将根系洗净控干后，放在装有一定体积水的量筒里)。 准确记下每个烧杯中的溶液量。将冲洗干净的待测根系，用吸水纸小心吸干(慎勿伤根)，然后依次浸入盛有 甲烯蓝溶液的烧杯中，在每杯中浸1.5min，注意每次取出时都要使甲烯蓝溶液能从根上流回到原杯中去。 从3个小烧杯中各吸取甲烯蓝溶液1mL，用去离子水稀释10倍后，660nm处比色测OD，在标准曲线上求 得各杯中所剩甲烯蓝毫克数，再根据杯中原有的甲烯蓝毫克数，求出每杯中为根系所吸收的甲烯蓝毫克数。 依照下列公式求出根的吸收面积：总吸收面积(m²)＝(第一杯中被吸收的甲烯蓝毫克数+第二杯中被吸收的甲 烯蓝毫克数)×1.1m²，活跃吸收面积(m²)＝第三杯中被吸收的甲烯蓝毫克数×1.1m²，活跃吸收面积％＝根系 活跃吸收面积(m²)/根系总吸收面积(m²)*100％

在不同浓度钾处理下，转基因水稻和野生型之间根系活力的变化趋势与根系生长表型趋势明显一致， 野生型水稻随着供钾浓度的逐渐下降，根系活力逐渐下降，而转基因水稻根系活力在正常供钾条件下，较 野生型显著提高，并且随着供钾水平的逐渐降低，根系活力明显增加，在0.1mM K处理下，转基因水稻根 系活力较野生型达到最大显著差异(图4D)，说明转基因水稻在低钾胁迫下，不仅能够显著改善根系生长， 而且能够提高根系的活力。

实施例4.转基因水稻对不同钾浓度处理K吸收和积累的响应

1)野生型和T2代转基因水稻培养具体实验步骤参照实施例3。

2)转基因和野生型水稻根系、地上部K浓度的测定2周不同K处理之后，将植株分为地上部和根系 两个部分，烘干植物样品，分别称取获得地上部和根系总干重。将烘干样品磨细后称取0.05g至于消化管中， 加入少量蒸馏水润湿样品，加入5mL浓硫酸摇匀后消化过夜，之后在200℃消煮炉消煮半小时左右，待消 化管烟雾上升到管口时，调高温度到280℃消煮半小时，加入双氧水，摇匀，直至消化管中液体变透明后再 煮10min，冷却定容。K浓度用电感耦合等离子发射光谱仪ICP(Optima 2100DV,PerkinElmer,USA)测定。

3)转基因和野生型水稻根系、地上部总K含量的测定用ICP获得植株根系和地上部的K浓度以后， 将浓度乘以对应的根系和地上部总干重，即得到根系和地上部K总量。

在不同浓度钾处理下，转基因水稻和野生型之间根系和地上部K浓度和K总量变化趋势与根系生长表 型趋势明显一致，野生型水稻随着供钾浓度的逐渐下降，根系和地上部K浓度和K总量逐渐下降，而转基 因水稻根系和地上部K浓度和K总量在正常供钾条件下，较野生型显著提高，并且随着供钾水平的逐渐降 低，根系和地上部K浓度和K总量明显增加，在0.1mM K处理下，转基因水稻根系和地上部K浓度和K 总量较野生型达到最大显著差异(图5A-D)，说明转基因水稻在低钾胁迫下，能够通过显著改善根系生长 情况来显著增加植株K的获得和积累。

实施例5.转基因水稻对正常和缺钾处理细胞分裂素响应因子基因(RR基因)、生长素响应因子基因(IAA 基因)和生长素外运蛋白基因(PIN基因)的表达影响

1)野生型和T2代转基因水稻培养具体实验步骤参照实施例3。

2)野生型和T2代转基因水稻正常、缺钾处理下RR基因、IAA基因和PIN基因的表达特征不同钾处 理结束后，将水稻苗取出，两不同钾处理下的苗均取其根系，分别提RNA，反转录cDNA，定量PCR鉴定 在正常、缺钾处理下RR基因、IAA基因和PIN基因的表达，验证转基因水稻表型是否是受细胞分裂素和 生长素的响应及其转运发生的变化而调控，具体实验细节步骤参照实施例2。内参和相关基因的定量引物参 见表3。

表3水稻内参和RR、IAA、PIN基因的定量PCR引物

A型细胞分裂素响应因子基因响应细胞分裂素信号，而细胞分裂素信号在根系中对根系的生长发育起 负调控作用，在转基因水稻根系中，被测定的6个RR基因在正常和缺钾条件下较野生型均显著下调，尤其 是RR2和RR8两个基因(图6A-B)，在低钾胁迫下被抑制的更为显著，RR基因被抑制，造成转基因水稻 根系对细胞分裂素信号响应不敏感，相反，生长素对根系的生长起正调控作用，而生长素响应因子IAA基 因，在转基因水稻根系中显著上调(图6C-D)，证明转基因水稻显著增强了对生长素信号的响应。除了生 长素和细胞分裂素的信号响应以外，生长素外运蛋白植物中对生长素地上部和根系中的转运起关键作用， 实验证明，不同的生长素外运蛋白基因在转基因水稻中的响应并不一致，PIN2和PIN10a是显著上调，而 PIN5a和PIN9是显著下调(图6E-F)，说明不同的PIN基因在水稻中对生长素的转运调控的机制并不一致， 而WOX11的特异诱导表达，影响细胞分裂素信号和生长素信号在水稻中的响应以及生长素在植株中的分 配，从而造成转基因水稻根系较野生型具有显著增强的根系表型。对WOX11基因调控细胞分裂素和生长素 响应和转运的信号转导通路进行补充和完善，详见图6G。

实施例6.转基因水稻苗期水培对不同钾浓度处理根系生长、K吸收和积累的响应

1)野生型和T2代转基因水稻水培培养转基因T2代水稻株系和野生型植株播种于光照培养箱进行发 芽2～3d后转入含有潮霉素(25mg/L)的清水中筛选1周，挑选长势一致的苗分别移栽。5L塑料圆桶作培 养盆钵，每盆8穴。一株为一穴，用海棉固定在塑料泡沫板的孔中，塑料板与圆桶的外径大小接近，放在 圆桶上。开始一天用自来水培养，一天后用1/4营养液培养三天，再换1/2营养液培养三天，随后全营养液 处理两周，所用的营养液配方参照实施例2。之后进行正常、缺钾处理，设置钾水平分别为1mM K和0.1mM K，以磷酸二氢钠补足磷源，具体实验步骤参照实施例2。处理时间持续三周，在持续时间内每2d换一次 营养液，每天下午调节营养液pH到5.5～5.8，每2d换营养液的同时交换盆钵的位置，保证在处理的过程 中材料的位置的条件相对一致，特别是相同处理的超表达和野生型植株的条件严格控制一致。每个处理重 复三次。

2)转基因和野生型水稻根系生长情况测定3周不同K处理之后，将植株分为地上部和根系两个部分， 烘干植物样品，分别称取获得地上部和根系总干重。根系总干重除以地上部总干重得到根冠比。

转基因水稻在正常和低钾处理下，根系生物量和根冠比均显著高于野生型水稻，尤其在低钾处理下， 根系生物量和根冠比分别高于野生型水稻150％和130％(图7A-B)，证明转基因水稻在水培条件下，依然 如幼苗期一样，保持显著增强的根系生长。

3)转基因和野生型水稻分部位K浓度的测定将转基因和野生型水稻植株分为根系、茎秆和叶鞘、成 熟叶片、发育中的叶片(单个分蘖最上面的两片新叶)四个部分，分别烘干称干重后，将烘干样品磨碎， 消煮后用ICP分别测定其钾浓度，具体实验步骤参照实施例4。

正常和缺钾水培处理的转基因水稻，根系、茎秆和叶鞘、成熟叶片、发育中的叶片中K浓度均显著高于野 生型，尤其是在低价胁迫下(图7C-D)，说明由于转基因水稻根系在低钾水培处理下的显著提高的长势， 促使植株各个部位的钾浓度都有所提高。

4)转基因和野生型水稻根系、地上部总K含量的测定用ICP获得植株根系、茎秆和叶鞘、成熟中叶 片、发育中叶片的K浓度以后，将浓度乘以对应的部位总干重，即得到各部位K总量，地上部钾总量是茎 秆和叶鞘、成熟中叶片、发育中叶片三个部位K总量之和。

在正常钾水培条件下，转基因水稻根系和地上部总K含量分别高于野生型140％和25％，而在低钾胁迫 处理下，上述值分别增加到350％和77％(图7E-F)，说明转基因水稻总K的积聚在根系和地上部都显著 高于野生型，尤其是根系当中，主要是因为根系生物量以及浓度均显著高于野生型所致，在水培低钾处理 下，转基因水稻达到预期的通过增强根系生长而提高植株对K的积累的目的。

实施例7.转基因水稻苗期水培对不同钾浓度处理可溶性糖浓度和糖转运的影响

1)野生型和T2代转基因水稻水培培养具体实验步骤参照实施例6。

2)转基因和野生型水稻分部位可溶性糖浓度的测定将转基因和野生型水稻植株分为根系、茎秆和叶 鞘、成熟叶片、发育中的叶片(单个分蘖最上面的两片新叶)四个部分，分别烘干称干重后，将烘干样品 磨碎，根据蒽酮比色法测定各部位的可溶性糖含量，具体步骤如下：称取0.1g粉碎的烘干样品于10mL离 心管中，加入4mL80％的乙醇，在80℃水浴中提取30min，取出离心(3000rpm)5min，收集上清液，重复 提取两次，收集三次上清液合并于烧杯中，至于85℃恒温水浴，使乙醇蒸发至2-3mL，转移到10mL离心 管中并用去离子水定容到10mL。取0.1-1mL提取上清液(根据糖含量的多少来定)于10mL离心管中，加 入0.9-0mL的去离子水和5mL0.1％的蒽酮试剂(质量体积比，用80％的H₂SO₄配制)，将离心管至于沸水 浴中10min，冷却后，用酶标仪于620nm处测定吸光值，根据标准曲线(100μg/mL标准葡糖溶液)最终算 出样品中可溶性糖浓度。

正常水培处理的转基因水稻，库器官(根系、发育中的叶片)中可溶性糖浓度显著高于野生型，而转 运器官(茎秆和叶鞘)及源器官(成熟的叶片)中可溶性糖浓度较野生型稍高但未达到显著水平，在缺钾 水培处理下，转基因水稻库器官较野生型可溶性糖浓度更为显著的提高，转运器官也显著高于野生型，而 源器官可溶性糖浓度较野生型低，这些数据直接说明了转基因水稻中可溶性糖从源到库的转运效率显著高 于野生型，尤其是在低钾胁迫下(图8A-B)。转基因水稻体内的高钾积累可能是其体内糖转运效率显著增 加的重要原因之一，另一个原因可能是转基因水稻具有更大的库容(根系生物量较大)，较大的库容使转 基因水稻根系有较大的糖份需求量，这一驱动力促使糖份由源到库的转运增强。

3)转基因和野生型水稻正常、缺钾处理下蔗糖转运蛋白基因SUT，单糖转运蛋白基因MST的表达特 征不用钾处理结束后，分别取水稻的根系(库器官)和成熟叶片(源器官)，分别提RNA，反转录cDNA， 定量PCR鉴定在正常、缺钾处理下成熟叶片中SUT基因的表达情况和根系中MST基因的表达情况，验证 转基因水稻糖转运的增强是否是通过改变这糖转运蛋白和单糖转运蛋白的表达来实现，具体实验细节步骤 参照实施例2。内参和相关基因的定量引物参见表4。

表4水稻内参和SUT、MST基因的定量PCR引物

SUT1和SUT4在植物中已经被证实具有长距离转运蔗糖的功能，在转基因水稻成熟叶片(源器官)中， SUT1和SUT4的表达均显著高于野生型(图8C)，缺钾胁迫下，SUT1和SUT4在野生型成熟叶片中的表 达量显著下调，而在转基因水稻中轻微下调，造成两基因在缺钾胁迫条件下的表达量更为显著高于野生型 (图8D)。单糖转运蛋白家族MST被证实在与库器官中的作用是转运被胞壁转化酶CIN分解成的单糖， 并将单糖转运到所需细胞中以利用，因此，MST转运蛋白具有将蔗糖卸载到库器官的功能，在正常水培条 件下，4个MST基因在转基因水稻根中均显著高于野生型(图8E)，与SUT的表达趋势相似，缺钾胁迫 显著下调MST基因在野生型根中的表达，而在转基因水稻根中下调不明显，造成转基因水稻在缺钾胁迫下 的更为显著的差异(图8F)。SUT和MST基因在转基因水稻中的显著高表达，说明转基因水稻糖转运效 率高的另一个重要原因是提高了SUT在源叶中的表达，使在叶片中合成的糖份及时转运出去，而MST在 库根中的表达，使蔗糖更高效的卸载到根中，造成转基因水稻体内高效的糖份转运，尤其是在低钾胁迫下， 糖份的高效转运为植株根系的生长提供必需的碳源，是植株提高缺钾胁迫适应的重要策略之一。

实施例8.转基因水稻桶培对不同施钾处理地上部和根系生长的响应

1)野生型和T2代转基因水稻桶培培养为了研究转基因水稻生育后期与野生型之间的差异，模拟田间 试验的桶培实验在南京农业大学牌楼基地的温室中进行，桶培所用土壤取自南京市地区的酸性黄棕壤，经 测定其pH为5.08，用1M的NH₄OAc浸提法测定土壤中包含70mg/kg的可交换钾，每桶装土7.5kg，不外 源施加钾肥的土壤作为-K处理，外源施加0.2g/kg的KCl的土壤作为+K处理，IRRI培养4周大的苗(具体 培养步骤参照实施例7)挑选长势一致的单株移栽，每桶一株苗，单个处理每个株系各10颗苗(10个重复)， 直至培养到成熟收获，期间分蘖盛期取其中的5颗苗(5个重复)研究其根系生长情况、不同部位(与实例 7-8中所分的水稻部位相同)K浓度和可溶性糖浓度，研究转基因水稻与野生型的表型差异及与水培培养进 行比较分析，看趋势是否一致，分蘖盛期水稻分部位K浓度、K总量和可溶性糖浓度三项主要指标转基因 与野生型水稻差异趋势与水培一致(数据未给出)。表明桶培培养至分蘖盛期，转基因水稻依旧保持高效 根系生长、K积累和可溶性糖的转运，尤其是在-K处理下，表型和生理指标的差异更为显著。

2)转基因和野生型水稻桶培地上部生长情况观测转基因和野生型水稻+K和-K处理直至收获，转基 因水稻地上部株高显著低于野生型，有效分蘖数显著多于野生型，地上部生物量显著高于野生型(图9A-B)， 具体农艺性状指标参见表1。

3)转基因和野生型水稻桶培根系生长情况测定转基因和野生型水稻+K和-K处理直至分蘖盛期，将 苗从桶中取出，洗净根上所带土壤之后，观测转基因与野生型水稻根系的差异，将植株分为地上部和根系 两个部分，烘干植物样品，分别称取获得地上部和根系总干重。根系总干重除以地上部总干重得到根冠比。 在-K条件下，转基因水稻根系较野生型的生物量显著增加，见图9C-F。根系生物量(干重)和根冠比均显 著高于野生型，尤其是在-K处理下(图9G-H)，桶培模拟田间培养条件，直至分蘖盛期，转基因与野生型 水稻依旧在根系生长上保持显著差异。

实施例9.转基因和野生型水稻桶培不同施钾处理分部位K浓度、K总量和可溶性糖浓度的差异分析

1)野生型和T2代转基因水稻桶培培养具体实验步骤参照实施例8。

2)转基因和野生型水稻分部位K浓度的测定将转基因和野生型水稻植株分为根系、茎秆、叶鞘、叶 片、穗柄和籽粒六个部分，分别烘干称干重后，将烘干样品磨碎，消煮后用ICP分别测定其钾浓度，具体 实验步骤参照实施例4。

在+K桶培条件下，转基因水稻在叶鞘、叶片、穗柄和籽粒中K浓度较野生型无显著差异，而根系和茎秆中 K浓度显著增加，在-K桶培处理下，除穗柄和籽粒中K浓度无显著差异以外，其余四部位K浓度均达到显 著差异(图10A-B)。

3)转基因和野生型水稻根系、地上部总K含量的测定用ICP获得植株根系、茎秆、叶鞘、叶片、穗 柄和籽粒的K浓度以后，将浓度乘以对应的部位总干重，即得到各部位K总量，地上部钾总量是茎秆、叶 鞘、叶片、穗柄和籽粒五个部位K总量之和。

在+K桶培条件下，转基因水稻根系和地上部总K含量分别高于野生型120％和42％，而-K桶培处理下， 上述值分别增加到280％和72％(图10C-D)，说明转基因水稻总K的积聚在根系和地上部直至水稻收获 都显著高于野生型，尤其是根系当中，转基因水稻在全生育期，不论外界培养介质是固体培养基、水培还 是桶培，均达到预期的通过增强根系生长而提高植株对K的积累的目的。

4)转基因和野生型水稻分部位可溶性糖浓度的测定将转基因和野生型水稻植株根系、茎秆、叶鞘、 叶片、穗柄和籽粒六个部分，分别烘干称干重后，将烘干样品磨碎，根据蒽酮比色法测定各部位的可溶性 糖含量，具体步骤参照实施例7。

正常+K桶培处理的转基因水稻，库器官(根系)中可溶性糖浓度显著高于野生型，而转运器官(茎秆) 中的可溶性糖显著低于野生型，源器官(叶片)中可溶性糖浓度较野生型稍低但未达到显著水平，在-K桶 培处理下，转基因水稻库器官较野生型可溶性糖浓度更为显著的提高，转运器官也更显著低于野生型，而 源器官可溶性糖浓度显著低于野生型，库器官籽粒中可溶性糖浓度也高于野生型但未达到显著差异，这些 数据充分说明了转基因水稻在灌浆后期到成熟期，可溶性糖从源(叶片)到库(根系和籽粒)的转运效率 显著高于野生型，尤其是在低钾胁迫下(图10E-F)。在灌浆后期到成熟期，水稻叶片中合成的糖份和茎秆 中转运的糖份以及营养生长期间以淀粉等形式暂时存储在茎秆和叶鞘中的糖份要大量向库器官中转运，向 根中转运主要是为了保持根系生长提供必要的碳源，向籽粒中转运主要是为了籽粒的灌浆，转基因水稻在 全生育期的根系生长均显著高于野生型，K在体内的积累和糖份的转运也显著高于野生型，尤其是在低钾 环境下，最终造成转基因水稻的单株产量的显著增加(表5)。

表5转基因和野生型水稻在缺钾和正常钾桶培处理下成熟期农艺性状统计

缺钾：水稻土不额外施加钾肥；正常钾：额外施加200mg/kg钾肥

实施例10.转基因和野生型水稻桶培不同施钾处理农艺性状统计分析

1)野生型和T2代转基因水稻桶培培养具体实验步骤参照实施例8。

2)转基因和野生型水稻农艺性状统计分析转基因和野生型水稻桶培至收获，观测转基因水稻与野生 型水稻主要田间农艺性状，转基因水稻株高显著低于野生型，有效分蘖显著高于野生型，地上部生物量在-K 桶培显著高于野生型，千粒重无显著差异，单株产量在+K条件下无显著差异，而在-K桶培下显著增加，增 加量达到24％(表5)。转基因水稻单株产量的提高，一方面是因为根系生物量和根系活力的显著提高，使 植株总K积累和体内糖份的转运效率显著提高，营养阶段积累的糖份，更高效的往籽粒中转运，造成单株 产量的增加，另一方面是由于对细胞分裂素、生长素信号的响应以及转运的调控，使转基因水稻的株型发 生显著变化，不仅是根系生物量的显著增加，而且造成地上部有效分蘖的显著增加，有效分蘖的增加是单 株产量提高的主要原因之一。

转pTCK303-OsHAK16-WOX11基因水稻能够在不同外界培养介质下，全生育期在低钾处理下均具有 根系生物量显著增加，体内K总量显著增加和糖转运效率显著提高的优势，证明通过提高根系生物量和根 系活力来达到对养分的高效利用的策略是切实可行的，不仅可以减少过多的施肥对环境造成的污染和破坏， 而且还能在有限的资源条件下最大限度的吸收和利用必要的营养元素以提高作物产量。