串联液相色谱-质谱法测定食品中刚果红的方法及应用

摘要

本发明属于食品检测技术领域。具体涉及应用快速液相串联质谱法测定了食品中非法添加的刚果红工业染料。均质后的样品经乙腈与正己烷按体积比1:1混合的溶剂提取，乙腈提取层过滤后直接上机测试。使用AgilentXDBC18色谱柱，以乙腈和10mmol/L甲酸铵水溶液为流动相梯度洗脱，采用多反应监测（MRM）负离子模式检测，m/z325.0/416.0及m/z651.0/152.0分别作为定量离子对与定性离子对，外标法定量。

说明书

一．技术领域

本发明属于食品检测技术领域，具体涉及应用串联液相色谱质谱联用技术对各种食品中非法添加的刚果红染料进行准确测定的方法及其应用。

二．背景技术

刚果红(Congo Red，Direct Red 28，CAS 573-58-0)又名直接大红28，属于联苯胺为母体的红色偶氮染料，一般用于临床诊断，指示剂、生物染色剂及化学指示剂等。它对各种动物机体为可疑致癌物与诱变剂，并对胎儿性腺发育产生不良影响，同时，在特定条件下，刚果红可降解释放出联苯胺类物质。由于对人体健康的危害很大，在很多国家已经成为禁用偶氮染料。

近年来食品安全事件频繁发生，其中添加非食用甚至有毒物质的情况尤为突出，基于价格便宜、着色强、稳定性强等特点，非食用工业染料被应用到食品加工中。不法食品加工商为使肉制品色泽鲜艳，从外观上吸引顾客，随意使用有毒的工业染料代替食用色素加以使用，对广大群众的身体健康造成极大的危害。本机构在食品风险监测过程中发现肉制品中被非法添加一种红色未知染料，经确证为致癌偶氮染料刚果红。刚果红不是食品添加剂，而是一种有毒的非食用物质，在食品中添加非食用物质是严重威胁人民群众饮食安全的犯罪行为，同时也是阻碍我国食品行业健康发展、破坏社会主义市场经济秩序的违法犯罪行为。因此有必要建立一种灵敏、准确、快速的肉制品中刚果红的检测方法。

国内外有关食品中刚果红染料的测定未见报道，侍芳采用液相色谱单级质谱（LC-MS）测定了环境水样中刚果红的含量，该方法由于样品基质及仪器设备的限制，不适用于食品中刚果红的准确测定。由于食品基质比较复杂，加上食品中非法添加的工业染料多为水溶性盐类，前处理多采用固相萃取（SPE）、液液萃取（LLE）以及基质固相分散（MSPD）等技术去除样品中的大量杂质，而后采用液相色谱及液相色谱质谱联用法对其进行测定。

三．发明内容

本发明需要解决的问题是采用串联液相色谱质谱联用法准确测定食品中刚果红的方法及应用。首先，如何从食品中快速有效的将非法添加的刚果红染料快速提取出来，同时最大限度减低基质干扰。经过大量的试验筛选，本发明最终选择乙腈-正己烷按体积比1:1混合的溶剂作为样品的提取溶剂，考虑到乙腈会溶解一部分正己烷，因此乙腈要预先用正己烷溶液饱和，这样定量计算时不至于产生误差。刚果红非常容易溶解于乙腈等强极性溶剂，而几乎不溶于正己烷，且正己烷是一种油脂的良好溶剂，可以有效的去除油脂。样品经混合溶剂提取后，刚果红富集于乙腈层中，弃去的正己烷中含有大量的低极性杂质，这样简单快速的前处理步骤是非常有效的。其次，如何选择最优的色谱及质谱条件，使得在尽可能短的时间内对样品中的刚果红染料进行分析，并产生最高的灵敏度。本发明在对刚果红染料性质进行详细了解的前提下，不断优化仪器条件，最终选定的液相条件为采用10 mmol甲酸铵水溶液-乙腈为流动相梯度洗脱，质谱采集m/z 651.0/152.0及m/z 325.0/416.0离子信号，分别作为定量离子对与定性离子对进行分析，使用外标法定量。

本发明的技术方案包括：

1. 质谱参数的选择与优化  

在实验前采用系统的autotune功能对质谱系统各参数进行快速优化。刚果红分子量为696.69，选择扫描范围m/z100-1000，断开色谱柱，进样器将标准溶液直接进质谱分析，同时采集正负离子信号，发现目标物在负离子模式下的响应值远大于正离子模式，该现象和刚果红带两个磺酸结构有关。刚果红的一级质谱在ESI负离子化模式下产生m/z 651.0[M-2Na+H]-及m/z 325.0[M-2Na]2-两个离子信号，符合文献报道的联苯胺偶氮染料电喷雾质谱特征。选择m/z651.0进行子离子扫描，生成的主要碎片离子为m/z 152.0，其为母离子失掉两侧偶氮苯磺酸结构后剩余的联苯基团（图1.C），改变碰撞电压没有其他明显离子出现。再选择m/z325.0进行子离子扫描，生成的主要碎片离子为m/z416.0，其为母离子一侧的偶氮N=N键断裂后剩余的碎片基团（图1.C），因刚果红为对称结构，它的丰度较前者要高，适合作为定量离子，同时改变碰撞电压也没有其他明显离子出现。将相关联的离子对中丰度较大的一对即325.0/416.0作为定量离子对，651.0/152.0作为定性离子对。最后对其裂解电压参数及碰撞电压进行优化，选择本发明中具体实施方案2中规定的质谱条件进行检测。

 

2. 色谱条件的优化  

在纯甲醇-水或乙腈-水流动相体系中，刚果红的响应非常低，完全不能满足分析的要求。在负离子模式下有机相选择甲醇、乙腈，水相选择甲酸铵、乙酸铵、氨水的水溶液等常见体系，发现刚果红在乙腈-甲酸铵体系下响应值最大，接着对甲酸铵的浓度进行了优化，其浓度分别选择5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L及30 mmol/L，发现在10 mmol/L的浓度下待测离子响应值最高，因此最终选择乙腈-10mmol/L甲酸铵溶液作为本发明的流动相。

一个合格的液质联用分析方法必须要良好的色谱分析条件为前提。刚果红在反相色谱柱上的保留较弱，且本实验前处理过程较为简单，需要较好的色谱分离条件作为补充。本实验采用梯度洗脱的方式不仅能使目标物与干扰组分完全分离，降低了基质影响，同时避免了连续进样过程中强保留物质的堆积效应。同时本次实验选择了填料粒径仅为1.8 mm高分离度色谱柱，如果不冲洗彻底很容易造成堵塞，降低色谱柱的寿命。

在实验中把RRLC的管路调整为低延迟状态主要通过断开阻尼器与溶剂混合器来降低系统的死体积，这在低流量做梯度洗脱时非常有用。

 

3. 前处理条件的优化

刚果红易溶于水及极性较强的有机溶剂，如甲醇、乙腈，但其在乙醚、正己烷等非极性溶剂中的溶解度极小。本实验采用正己烷与乙腈1：1的混合溶液对肉制品中的目标物进行提取主要基于以下考虑：首先正己烷能去除样品中脂肪以及其他大量非极性物质，尽可能减少其在反相C18柱上的残留。以脂肪含量高达35%的香肠样品为例，实验证明5 g样品中经10 ml正己烷提取一次后，脂肪含量降为5%以下，因此采用10 ml正己烷去除脂肪的方案是可行的；其次食品中含有大量的氯化钠及谷氨酸钠等物质，这些不挥发盐类在富有机溶剂中溶解度较小，使用乙腈提取刚果红不仅极大降低不挥发盐类对质谱仪器的影响，同时乙腈具有沉淀蛋白的作用，可有效的提取目标物，降低基质效应。

在提取方式上，比较了超声、涡旋及手振摇的方式，发现超声及涡旋方式在相同的提取时间内提取效率不如手工振摇，但在振摇过程中应注意选择密封性良好的离心管，否则易造成损失。在振摇次数上依次选择50、100、200、300进行试验，发现100次以上回收率水平趋于平稳，因此选择振摇100次为最优化条件。

实验证明，采用正己烷和乙腈混合溶剂手动振摇提取的方法快速，高效，结果准确，非常适用于食品安全监管中的快速检测。

本发明的有益效果是：高分辨快速液相-串联质谱法（RRLC-MS/MS）具有高灵敏度、高分离度的特点，在痕量物质分析、食品非法添加物检测领域具有独特的优势。本发明首次建立了肉制品中刚果红工业染料的RRLC-MS/MS快速检测方法，该方法快速、准确、有效，可操性强，可作为食品安全监管的有力手段推广使用。该方法的建立将在很大程度上有效打击刚果红的非法添加使用，保证广大群众的食品安全。本发明准确、科学、有效，在实际工作中具有很大意义，同时填补了国内外空白。

四.附图说明

图1 加标样品多反应监测(MRM)色谱图(A)、选择监测离子对(B)与裂解途径(C)

五.具体实施方式

1.样品提取与净化。准确称取5 g均化后的样品于50 ml离心管中，加入10 ml正己烷及10 ml乙腈，拧紧盖子，剧烈上下震摇100次后于离心机中以5000 r/min离心10 min，取下层乙腈溶液1ml于离心机中以15000r/min离心10min，取上清液上机测试。乙腈层颜色较深的样品可适当稀释，使其浓度在线性范围之内。

2．色谱与质谱条件

色谱条件  

色谱柱为Agilent XDB C18柱（2.1×50 mm，1.8 mm）；柱温35 ℃，进样量1 μL；流动相A为10 mmol甲酸铵水溶液，流动相B为乙腈，流速0.3 mL/min，RRLC系统管路调节为低延迟体积模式。流动相梯度洗脱程序为：B在5 min内由20%线性升至80% ，再于1 min后回到20%，保持2 min，单次分析时间为8 min。在此条件下，刚果红保留时间为2.7 min，加标样品测试谱图见附图1.A。  

质谱条件

电离模式：ESI(-)；毛细管电压4000 v；干燥气温度：320 ℃；干燥气流速9.0 L/min；雾化气压力40 psi；其余参数通过仪器自动调谐至最优化。选择多反应监测模式（MRM），定性离子对与定量离子对分别为m/z 651.0/152.0及m/z 325.0/416.0，见图1.B。碎裂电压分别为70 v及130 v，碰撞气分别为39 v及13 v，驻留时间均为100 ms。

3．标准曲线的建立

将刚果红标准物质溶液用空白基质溶液稀释成0.1、0.5、2.0、5.0、10.0 mg/ml五个不同浓度的标准工作液，将标准工作液上机测试，外标法定量，建立响应值与浓度的线性拟合方程。