用于造纸废水生物处理的漆酶、编码基因及其表达与应用

摘要

本发明涉及生物技术领域，公开了一种用于造纸废水生物处理的漆酶、编码基因及其在造纸废水生物处理中的应用。该漆酶基因核苷酸序列如SEQIDNO:2所示；含有该基因编码的漆酶，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。能够在酵母菌中组成型高效表达，克服了传统纯培养技术及诱导表达的不足，本发明漆酶基因可提高漆酶的表达活力，对于促进漆酶在造纸废水生物处理中的应用具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及了一种用于造纸废水生物处理的漆酶、编码基因及其在造纸废水生物处理中的应用。

背景技术

我国造纸工业年废水排放量大，处理难度高，加上《制浆造纸工业水污染物排放标准》（GB3544-2008）的颁布和实施，造纸工业废水的处理难度加大，处理费用大幅增加。随着人们环保意识的增强，法律法规的不断健全及造纸废水的排放指标的不断严格，造纸废水的处理和达标具有重要的现实意义。

目前造纸废水常用的处理方法主要有物理法和化学法，但无法彻底消除废水中较难处理的物质，如纤维素、半纤维素、木质素和酚类化合物等。生物法是处理造纸废水的一种最有效、最安全和最彻底的方法。

漆酶是一种结合多个铜原子的蛋白质，属于铜蓝氧化酶。漆酶作用底物相当广泛，能够对多种污染物如各种酚类染料、取代酚、氯酚、硫酚、双酚、芳香胺等。在漆酶介体( HBT、ABTS等)存在下，漆酶还可以催化降解与木质素相关的二苯基甲烷及二噁英等。

漆酶是近年发现在造纸工业中最具潜力的生物酶，具有催化氧化木素的能力。漆酶能选择性地催化木质素降解，不会产生有毒物质，并且生产在常温、常压的温和条件下进行，节约设备和能耗。因此漆酶在造纸工业废水处理等方面有着非常巨大的应用前景。

从1983 年起人们陆续在生脂固氮螺菌(Azospirillum lipoferum)、交替单胞菌( Alteromonas sp．MMB-1)、大肠杆菌( Escherichia coli )、假单胞菌(Pseudomonas sp． KU03 )、黏质沙雷氏菌( Serratia marcescens)、球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)、极端耐碱芽孢杆菌(B． halodurans)和暗蓝链霉菌( Streptomyces cyaneus )、天蓝色链霉菌( S．coelicolor)及沙链霉菌( S．psammoticus)等一些菌株中均发现有漆酶活性。（汪春蕾等，2011）

由于缺乏再现环境条件的方法和培养基质，造成了绝大多数微生物难以被标准实验室的方法复苏和培养, 称为未培养微生物(uncultured microorganism)。使用标准微生物学培养技术对不同生境微生物可培养性的测定来看，海水中微生物可培养的约为0.001%～0.1%，淡水约为0.25%，土壤约为0.3%，活性污泥为1%～15%左右。也就是说，目前绝大部分自然环境微生物很难或不能通过传统纯培养分离方法得到其纯培养。

因此，利用构建基因文库的分子生物学方法来筛选新的高效漆酶基因，利用毕赤酵母组成型表达来提高漆酶的表达活力，对于促进漆酶在造纸废水生物处理中的应用具有重要意义。

发明内容

本发明提供了一种从造纸污水处理厂的活性污泥中筛选出的新的漆酶基因，该基因能够在酵母细胞中组成型表达。含有新的漆酶基因的酵母表达菌可在造纸废水中繁殖并表达漆酶，从而对造纸废水进行生物增效处理。

为了解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案得以解决：

一种用于处理造纸废水的漆酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，共544个氨基酸。具体的，所述基因核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，全长为1662bp，GC含量为40.07%。

本发明涉及的漆酶基因，是一种新的基因，与同类基因没有同源性。其编码的漆酶是一种新的漆酶，与其他已报道的漆酶氨基酸序列相比，相似性小于40%。应当指出的是，对本发明的漆酶基因所编码的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸替换、插入或缺失所得到的功能类似物均属于本发明的保护范围。在已知本发明漆酶基因的情况下，本发明普通技术人员可按本领域常规方法构建载体、转化、表达，获得所述漆酶。

本发明还涉及含有所述漆酶基因的宿主菌。

本发明还涉及含有所述基因的重组载体，将含有所述基因的重组载体转化至宿主菌（通常为酵母菌）中，进行表达，即可获得本发明漆酶。

本发明还涉及所述基因在制备重组漆酶中的应用。

本发明还涉及所述的漆酶在造纸废水生物处理中的应用，本发明的漆酶的最适温度是30-40℃，最适pH为5-6。将基因工程菌进行扩大培养后，按0.05%的添加量添加到曝气池中进行处理。

本发明由于采用了以上技术方案，具有显著的技术效果：

本发明提供了一种新的漆酶基因，能够在酵母菌中组成型高效表达，克服了传统纯培养技术及诱导表达的不足，可提高漆酶的表达活力，对于促进漆酶在造纸废水生物处理中的应用具有重要意义。

附图说明

图1为漆酶的最适pH曲线；

图2为漆酶的最适温度曲线。

具体实施方式

下面结合附图1至附图2与实施例对本发明作进一步详细描述：

实施例1： 活性污泥DNA文库的构建

1、活性污泥DNA的提取

从某造纸废水污水处理厂采集污泥，经过适当稀释作为样品进行DNA的提取。12000 r·min^-1离心5 min收集样品，TE重悬洗涤一次后，加溶菌酶至终浓度为100 μg·ml^-1，37 ℃水浴2小时。加5 M NaCl调整终浓度至0.5 M，混匀后加入40 μl 蛋白酶K和20 % SDS（终浓度为0.5~1 %），37 ℃过夜或者50 ℃水浴3 h 至溶液粘稠澄清。加1/3体积的饱和NaCl剧烈振荡15 s后，12000 r·min^-1 离心5 min，收集上清至一灭菌离心管中，加入0.6 V异丙醇混匀后沉淀，12000 r·min^-1 离心收集沉淀，用70 %乙醇洗涤，吹干后溶于400 μl 灭菌去离子水中。

2、DNA文库的构建

（1）DNA的酶切

用Sau3AⅠ部分酶切活性污泥总DNA，先用检测型反应体系进行酶切，确定最适酶切浓度及时间，最终进行制备型部分酶切。检测型酶切反应体系（10 μL）：总DNA 2 μL，Sau3AI 适量，缓冲液1 μL，加ddH₂O至终体积10 μL。制备型酶切反应体系（100 μL）：总DNA 20 μL，Sau3AI适量，缓冲液10 μL，加ddH₂O至终体积100 μL。其中所加Sau3AI酶量根据酶切浓度及时间进行摸索，切胶回收2~4 kb条带的DNA片段，作为外源片段。

（2）脱磷载体的制备

提取puc18质粒，用BamHI进行单酶切，回收1.8kb大小的线性片段进行去磷酸化反应。在微量离心管中建立以下的反应体系：线性化puc18载体 28ul，10×碱性磷酸酯酶缓冲液5 μl，CIAP（16 U/μl TAKARA）0.5ul，加ddH₂O至终体积50 μl。50 ℃反应30 min，加1/10体积 0.5M的EDTA 终止反应；合并四管用ddH₂O补足至500ul；加400ul酚/氯仿抽提1次，吸出上清；加1/10V的3M NaAc，2V预冷的乙醇，在-20度沉淀60min；离心收集沉淀，用200 μl 70 %乙醇洗涤后吹干，用20 μlTE溶解。电泳定量，50~100ng/管分装保存于终浓度为50%的灭菌甘油中，备用。

（3）转化

将外源片段和载体按比例进行过夜酶连。取E.coli DH5α高效感受态细胞（每管约200 μl）于冰浴中融化，每管加2 μl酶连产物，轻轻旋转以混匀内容物，冰浴中放置30 min，将离心管放入42 ℃的循环水浴中，热激90 s，不要摇动离心管。快速将离心管移到冰浴中使细胞冷却1~2min后每管加800 μl 预热至37 ℃的LB培养基，混匀后在37 ℃摇床中，150 r·min^-1温育45 min使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性基因。涂布复苏后的转化液到加氨苄青霉素（100 μg·ml^-1）的新鲜LB平板上，待菌液被完全吸收后，倒置平板于37 ℃培养，12～16 h后出现菌落。

（4）文库的检查与保存

挑取150个阳性克隆接种于抗生素平板上，37 ℃培养至菌落长出后，随机挑取部分转化子进行质粒提取，检查外源片段插入情況，并将培养好的平板于4 ℃保存备用。检测后的平板用无菌水将菌落洗下后加甘油至终浓度15%，于-70℃保存备用。

实施例2 ：漆酶基因的筛选和序列分析

将DNA文库中克隆子分别培养保存，进行阳性克隆子和高效产漆酶转化子的筛选。

初筛培养基

Bavendamm 氏反应培养基: 在PDA 固体培养基中加入鞣酸使其终浓度为0. 4 mmo l/ L;

氧化带测定培养基: 在PDA 固体培养基中加入愈创木酚使其终浓度为0. 04%。

复筛培养基

马铃薯200 g , 葡萄糖20 g , 磷酸二氢钾3 g , 七水硫酸镁1. 5 g, 酵母浸膏1 g , 蒸馏水1 000 mL, 煮沸过滤, 冷却后分装至250 mL 三角瓶, 每瓶装入50 mL 培养基。

产酶基础培养基

葡萄糖30 g , 硝酸钠2 g, 七水硫酸镁0. 5 g , 三水磷酸氢二钾1 g , 七水硫酸亚铁0. 01 g , 氯化钾0. 5 g , 蒸馏水1 000 mL, 自然pH。

高产菌株的初筛：

Bavendamm 氏反应培养基常规灭菌倒平板, 取培养好的直径12 mm、7 d 菌龄待测菌塞2 片接种于初筛平板, 28℃ 生化培养箱培养, 挑选菌丝生长良好, 使鞣酸、愈创木酚二者变色能力强、变色速度快的平板, 并接种于PDA 斜面, 一并于4 ℃ 保存。

高产菌株的复筛：

在无菌条件下, 用打孔器于初筛所得菌的平板上打孔, 制成直径12 mm 菌塞, 接入装有50 mL 产酶培养基的250 mL 三角瓶, 每瓶接种2 片，3 个平行，28 ℃、120 r/ min 振荡培养，每天取样测定漆酶活性，持续10 d，选择漆酶活力高的菌株。

漆酶活力用愈创木酚法测定，一个酶活单位定义为在25℃条件下每分钟使1μmol 的底物转化所需的酶量。

选取漆酶活力最高的的克隆子，提取质粒对插入序列进行测序。漆酶基因命名为LacN，载体命名为puc-LacN。

测序结果在NCBI Genbank数据库进行序列比对，结果表明，在数据库中没有发现和该基因序列同源的序列，其应为一新序列。经过对漆酶基因LacN的分析，预测了该酶可能的编码序列，去除信号肽后，包括起始密码及终止密码在内，共1662个核苷酸（SEQ ID NO:2），编码544个氨基酸（SEQ ID NO:1）。

实施例3 ：漆酶基因在酵母细胞中的表达

1、表达载体的构建

将puc-LacN用 EcoRⅠ/NotⅠ双酶切，回收外源片段，以正确的阅读框插入到同样双酶切的毕赤酵母组成型表达载体pGAPZaA（美国invitrogen公司）连接，转化 E.coli DH5α，获得重组质粒pGAPZaA- LacN。该重组质粒经EcoRⅠ/NotⅠ双酶切验证。

2、电转化感受态的制备

在含 5 ml YPD 的 50 ml 离心管中，培养酵母细胞，30度过夜；取30~50 ul 过夜培养物，接种含 50 ml 新鲜培养基的 250 ml 摇瓶，过夜生长至 OD600＝1.3~1.5；在4 度，1500 g离心 5 min收集细胞,用 50 ml预冷的灭菌水悬浮细胞；如上离心，用25 ml预冷的灭菌水悬浮细胞；如上离心，用2 ml预冷的 1M山梨醇悬浮细胞；如上离心，用100 ul预冷的1M山梨醇悬浮细胞。

3、电转化

将pGAPZaA- LacN用Bgl II酶切线性化，将5~10ug线性化 DNA与80 uL 电转化细胞混匀，转移到0.1 cm电转化杯，冰浴5 min。电转化参数：0.75kV，25uF，200Ω。电击后立即加入1mL预冷的1M山梨醇。复苏1h后取150ul涂布含有Zeocin抗性的YPD平板上培养。在30 度孵育平板至克隆产生。

4、产漆酶转化子的筛选 

将转化子平板上的单菌落分别培养保存，进行阳性克隆子和高效产漆酶转化子的筛选。筛选方法同实施例2。

实施例4 ：漆酶的特性研究

1、pH值对漆酶活性的影响

将漆酶加入不同pH值的缓冲液体系中测定酶活力，pH设置从2.0到10.0，每隔0.5取点测定。酶活性测定反应在25℃进行，反应时间为15 min。结果如图1所示，漆酶的最适pH值为5~6，在pH4.0-6.5范围内，漆酶活能保持在50%以上。

 2、温度对漆酶活性的影响

   漆酶的最适反应温度测定在最适pH值下进行，反应时间为15 min，温度设置从15 ℃到75℃，每隔5℃取点测定。结果如图2示，漆酶的最适温度为30~40℃，20~50 ℃时的酶活能保持60%以上。

实施例5 ：漆酶基因工程菌在造纸废水处理中的应用

由于基因工程菌中漆酶为组成型表达，因此可将基因工程菌进行扩大培养后，按0.05%的添加量添加到某造纸废水处理厂SBR工艺（序列间歇式活性污泥法）曝气池中进行处理。与对照组相比，漆酶基因工程菌可将造纸废水处理效率提高15%左右，在未来的造纸废水处理中有重要的应用意义。

总之，以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所作的均等变化与修饰，皆应属本发明专利的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

 <110>  浙江商达环保有限公司

 <120>  一种用于造纸废水生物处理的漆酶、编码基因及其表达与应用

 <130> 

 <160>  2    

 <170>  PatentIn version 3.4

 <210>  1

<211>  554

<212>  PRT

<213>  Unknown

 <220>

<223>  人工序列

 <400>  1

1     Met Ile Ala Glu Gly Asn Val Ser Gly Leu Glu Met Ile Asp Leu   15

16    Leu Lys Pro Arg Gln Gln Tyr Ile Glu Ser Thr Tyr His Asp Leu   30

31    Leu Met Arg Glu Tyr Ile Gln Leu Ser Tyr Arg Asn Leu Leu Pro   45

46    Thr Glu Cys Trp Ser Gln Asp Gly Leu Phe Leu Gly Pro Tyr Leu   60

61    Glu Met Pro Lys Asp Val Asn Leu Tyr Val Arg Val Met Asn Ser   75

76    Met Pro Leu Pro His Leu Asn Pro Ile Val His Thr Thr Tyr Ile   90

91    Ser Ala Tyr Gln Gln Gly Glu Pro Lys Val Lys Tyr Val Val Lys   105

106   Ser His Gly Gly Asp Thr Pro Asp Asp Ala Ser Ile Ser Pro Ser   120

121   Ala Gln Phe Ser Met Asp Phe Gln Glu Thr Asp Pro Tyr Phe Arg   135

136   Arg Glu Val Ile His Tyr Ala Ile Gln Leu Arg Gly Ala Lys Leu   150

151   Trp Asp Asp Asp Gln Ser Met Ala Leu Thr Arg Met Asn Val Thr   165

166   Ala Gly Tyr Val Ser Ala Asn Ile Ile Gln Tyr Pro Lys Ser Lys   180

181   Arg Cys Arg Leu His Pro Asp Val Asp Asp Val Ser Ser Leu Tyr   195

196   Thr Asp Asn Ser Ile Ser Thr Asp Gly Ile Leu Leu Val Pro Thr   210

211   Ala Lys Ala Asn Thr Ser Pro Ser Asp Pro Arg Leu Ala Ile Ser   225

226   Gln Ala Phe Ile Gly Asp Ser Ile Leu Val Asp Gly Lys Cys Trp   240

241   Pro Thr Leu Glu Ala Ile Pro Asn Glu Tyr Ser Thr Arg Val Thr   255

256   Asn Ala Cys His Thr Lys His Tyr Asn Tyr Ala Leu Glu Leu Gly   270

271   Glu Asp Phe Ile Leu Leu Gly Ala Tyr Gly Gly Trp Leu Pro Ile   285

286   Ser Val Asn Lys Asn Ser Lys Ser Leu Gly Ser Ala Asp Ser Tyr   300

301   Asp Ile Ile Ile Asn Phe Thr Gly Tyr Glu Gly Ser Ser Ile Leu   315

316   Thr Ala Ile Ser Ala Glu Ser Gly Gly Arg Val Asn Leu Gln Thr   330

331   Asp Asp His Ile Leu Lys Phe Arg Glu Pro Lys Leu Met Ala Gln   345

346   Gly Asp Asp Tyr Arg Lys His Lys Ala Pro Ala Ser Ala Pro Ser   360

361   Gly Gln His Glu Leu Phe Gln Asn Leu Arg Thr Ser Lys Leu Asp   375

376   Arg Thr Gln Asp Glu Tyr Gly Arg Pro Val Leu Leu Leu Asn Asn   390

391   Lys Arg Trp His Asp Pro Val Thr Thr Thr Pro Phe Val Gly Thr   405

406   Thr Gly Met Ala Ser Ile Asn Tyr Pro Thr Thr Gly Ala His Pro   420

421   Ile Leu Leu His Phe Ile Ser Phe Ser Val Leu Ser Leu Arg Thr   435

436   Ser Asp Ile Ile Arg Thr Tyr Glu Ser Asp Gln Leu Tyr Val Thr   450

451   Val Lys Ala Val Pro Trp Pro Leu Ser Glu Asn Thr Trp Lys Arg   465

466   Thr Ile Gln Ala His Ala Glu Glu Val Tyr Arg Ile Ala Phe Thr   480

481   Phe Glu Thr Tyr Ser His Arg Gly Gly Trp His Thr His Ile Ser   495

496   Gln His Glu Ile Tyr Asp Ser Met Arg Gln Arg Asp Met Ala Asp   510

511   Pro Asn Lys Leu Pro Leu Ile Pro Ser Pro Glu Phe His Tyr Gly   525

526   Lys Cys Tyr Leu Ser Thr Ala Asp Ser Tyr Tyr Gln Glu Asn Tyr   540

541   Leu Gly Pro Cys Leu Gly Ser Gln His Cys Ser Thr Pro End  554

 

 

<210>  2

<211>  1662

<212>  DNA

<213>  Unknown

 <220>

<223>  人工序列

 <400>  2

atgattgctg aaggtaatgt ttcgggattg gagatgatag atttactgaa gcctagacaa  60

cagtatatag aaagcactta ccatgatctt ctaatgaggg agtatataca actatcgtat  120

aggaatttgc tcccaactga atgttggtcc caggacggtt tgttcctagg tccatacctt  180

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gaaagtggtg gccgagttaa cctgcaaact gatgatcaca ttttgaaatt tagagaacct  1020

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gattccatga gacagaggga tatggccgat ccaaacaagt taccacttat accttcgcca  1560

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ctgggaccat gcttgggatc tcaacactgt agcactccct aa  1662