猪口蹄疫病毒O型广谱多表位重组抗原及其应用

摘要

本发明公开了一种猪口蹄疫病毒O型广谱多表位重组抗原及其应用，属于生物疫苗领域。本发明采用“抗原化抗体”策略，将猪口蹄疫病毒O型的多个毒株的主要抗原表位进行合理串联后，与猪IgG重链恒定区偶联构建得到一种猪口蹄疫病毒O型广谱多表位重组抗原，经Bio-Rad蛋白定量试剂盒定量后与重组口蹄疫病毒3D蛋白配伍制备疫苗，动物免疫试验结果显示，该疫苗单独使用或与重组口蹄疫病毒3D蛋白配伍后都能够刺激机体产生高效价的保护性抗体，抗体水平高于国家标准，具有良好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一种猪口蹄疫病毒重组抗原及其应用，特别涉及一种猪口蹄疫病毒 O型广谱多表位重组抗原及其应用，还涉及由该抗原制备得到的疫苗，属于生物疫 苗领域。

背景技术

口蹄疫作为感染主要经济畜种猪、牛和羊的重大动物疫病不仅严重威胁畜牧业 的健康发展，而且涉及动物源性食品安全以及其外贸出口。一旦发生疫情损失惨重， 影响恶劣。灭活疫苗作为主要防控物质在控制FMD疫情中发挥着十分重要的作用， 但由于生产此类疫苗需要建设防止病原体逃逸的高级别生物安全生产车间，而且需 要区分疫苗免疫和自然感染动物。更为严重的是病毒灭活不完全有引起疫苗毒株流 行的危险。为此，1991年后欧盟成员国禁止使用灭活疫苗进行疫情防控，美国也禁 止在其本国生产和使用灭活疫苗。2001年英国口蹄疫大流行造成的经济损失和影响 引起了全世界对口蹄疫防控策略的新讨论。研发安全高效的新型FMD疫苗成为热 点问题，而免疫效力低下及免疫持续期短仍然是制约新型疫苗发展的技术瓶颈。因 此，如何提升新型疫苗的免疫效力也是当前要解决的主要问题。

现代免疫学、基因组学、分子生物学和生物信息学技术的快速发展，抗原表位 的筛获及其免疫原性的证实为研制新型分子疫苗奠定了基础，利用反向疫苗研究技 术研制新型疫苗已经成为未来疫苗发展的趋势。传统灭活疫苗生物安全的不确定性 加速了研究口蹄疫新型疫苗的进程。但以小分子靶标抗原为基础的疫苗组装体系以 及最大化模拟自然感染免疫的能力依然是制约小分子表位疫苗研究的技术瓶颈。上 世纪80年代初，研究者发现口蹄疫病毒VP1结构蛋白能够诱导机体产生免疫应答， 并能抵抗同源病毒攻击。1982年，Bittle等首次证实了口蹄疫病毒VP1蛋白的140-160 氨基酸合成肽免疫动物后能够产生口蹄疫病毒中和抗体，揭开了口蹄疫病毒小分子 疫苗研究的序幕。此后，研究者纷纷采用化学合成肽或基因工程技术研究分子疫苗。 研究最为广泛的是用口蹄疫病毒VP1结构蛋白的主要抗原表位(140-160和200-213 氨基酸序列)构建基因工程亚单位疫苗和DNA疫苗及合成肽，所有其他分子疫苗 虽然能诱导小动物模型(小鼠、豚鼠)及部分本动物产生保护性抗体，保护动物抵 抗病毒攻击。但大规模本动物试验均以失败告终(攻毒保护率达不到国家标准)， 主要是由于研制的小分子抗原不能刺激机体产生保护水平的中和抗体，有些即使能 产生一定水平的保护性抗体，但持续时间短，不能满足疫病防控的需要。另外，研 制的病毒颗粒样衣壳蛋白能够诱导机体产生高效价的保护性抗体，免疫动物能够抵 抗同源病毒的攻击，但该抗原的低产量和高成本限制了该疫苗的应用。近来，人们 通过增加T细胞表位和外源载体蛋白以加强抗原递呈能力、增加分子量、促进B细 胞成熟分化等手段来提高疫苗的免疫原性，增强免疫应答能力、提升外周血循环抗 体的水平和持续时间，虽然在一定程度上改善了抗原的免疫原性，但多次免疫后产 生抗外源载体蛋白抗体，反而影响了靶标抗原的免疫效果；另外，由于研究者采用 的T细胞表位不是通用性表位，即不能被所有宿主动物的主要组织相容性复合物 (MHC-I和II)识别，故并不能诱导所有动物产生免疫应答。近年来，以主要免疫因 子如IFN-γ、IL-2等与抗原表位小分子偶联构建的表位疫苗成为表位疫苗研究的新 突破点，但对本动物的免疫效果并不理想。

目前，尽管上海复旦大学郑赵鑫教授研制的猪口蹄疫病毒O型重组疫苗申获了 专利，并获得农业部颁布的“一类新兽药证书”，但是由于多种原因该产品迟迟没有 实现商品化。我国猪O型口蹄疫防疫仍然使用灭活疫苗，UBI合成肽疫苗由于免疫 效果不理想，市场前景黯淡，本发明人之前申请了羊和牛Asia 1型多表位疫苗的专 利，目前正在审核阶段。以此为基础，本发明采用分子生物学技术以及先进的设计 理念，设计并合成了涵盖我国分离的猪口蹄疫病毒O型毒株的主要抗原表位序列， 即广谱多表位重组疫苗，从根本上解决目前表位疫苗和合成肽疫苗免疫效力低，抗 原谱窄的问题，最大可能避免由于疫苗抗原谱单一造成免疫失败和免疫逃逸现象的 发生，对于控制和净化我国猪O型口蹄疫具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种猪口蹄疫病毒O型广谱多表位重组抗原，该抗 原涵盖了我国分离的猪口蹄疫病毒O型毒株的主要抗原表位序列；

本发明的目的之二在于提供所述重组抗原在制备猪口蹄疫病毒O型广谱多表位 疫苗中的应用；

本发明的目的之三在于提供一种猪口蹄疫病毒O型广谱多表位疫苗，其含有本 发明所述的重组抗原。

为了达到所述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明用DNAStar生物软件对我国分离的三株猪口蹄疫病毒O型代表毒株 (O/China/99，O/Miandian/98，O/ZK/93)进行序列分析，确定了优势抗原表位为 O/China/99，O/ZK/93以及O/Miandian/98病毒株的第135-160位的氨基酸区段，并 确定以O/China/99的第200-213位氨基酸区段为另外一个B抗原表位。为了防止在 构建基因时出现新表位，通过在相邻两表位之间引入能保证各个表位结构正确展示 的间隔子序列GGSSGG，从而构建得到多表位基因的串联序列，多表位基因的串联 顺序为O/China/99(135-160)-O/Miandian/98(135-160)-O/ZK/93(135-160) -O/China/99(200-213)，为了达到更好的免疫效果，进一步的将该串联序列重复 串联后与猪IgG重链恒定区基因(PIgG)进行连接，得到了两次串联重复多表位基 因与猪IgG连接基因序列连接后的完整核苷酸序列。

本发明的一种猪口蹄疫病毒O型广谱多表位重组抗原，其特征在于所述的重组 抗原是将猪口蹄疫病毒O型的多个毒株的主要抗原表位进行串联后，与猪IgG重链 恒定区偶联构建得到，所述的重组抗原含有以下(a)或(b)所示的氨基酸序列：

(a)SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列；或

(b)将SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸残基的替换、 缺失或插入而获得的仍具有抗原表位功能的蛋白衍生物。

在本发明的一个具体实施例中，所述的重组抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO： 8所示。

本发明还提供了编码所述重组抗原的核苷酸序列，其特征在于具有以下(a)、 (b)或(c)所示的核苷酸序列：

(a)具有SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列；或

(b)编码SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的核苷酸序列；或

(c)编码具有抗原表位功能的蛋白衍生物的核苷酸序列，该蛋白衍生物通过 将SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的一个或多个氨基酸残基替换、缺失或插入而 获得。

在本发明的一个具体实施例中，所述的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。

进一步的，本发明还提供了一种重组表达载体，其特征在于含有以上所述的核 苷酸序列。

更进一步的，本发明还提供了含有所述的重组表达载体的宿主细胞。

再进一步的，本发明提供了所述的重组抗原在制备预防猪口蹄疫疫苗中的应 用。以及

所述的核苷酸序列在制备预防猪口蹄疫疫苗中的应用。

本发明的一种猪口蹄疫病毒O型广谱多表位疫苗，其特征在于含有本发明所述 的多表位重组抗原。

更优选的，其特征在于还含有口蹄疫病毒3D蛋白的全长氨基酸序列或其片段， 所述的口蹄疫病毒3D蛋白的全长氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示，口蹄疫病毒 3D蛋白片段选自如SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：16所示的 氨基酸序列中的至少一种。

本发明采用“抗原化抗体”策略，即将目前我国流行的猪口蹄疫病毒O型的多个 毒株的主要抗原表位进行合理的串联后，与猪IgG免疫刺激片断(IgG重链恒定区) 偶联，克隆入原核表达质粒如pET-30a(+)构建重组表达质粒，转化BL21(DE3) 表达重组抗原并采用Ni-NAT层析柱纯化后，经Bio-Rad蛋白定量试剂盒定量后与 重组口蹄疫病毒3D蛋白配伍制备疫苗，动物免疫试验结果显示，该疫苗配伍能够 刺激机体产生高效价的保护性抗体，抗体水平高于国家标准，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为3D蛋白不同片段与重组抗原联合免疫小鼠血清抗体效价测定；

图2为重组表位抗原单独或与3D全长蛋白联合免疫猪体效力试验结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述 而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本 领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方 案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1重组抗原(EoIgG)的制备

1、O型口蹄疫病毒VP1基因的生物信息学分析：

口蹄疫病毒结构蛋白VP1是病毒的优势抗原，无论是分离纯化的天然VP1蛋 白还是重组表达产物都能诱导机体产生保护性中和抗体，具有型特异性。口蹄疫病 毒VP1基因全长由639个核苷酸组成，编码一条具有213个氨基酸的蛋白，其主要 抗原表位集中在第140-160位的氨基酸和第200-213位的氨基酸区段。本发明用 DNAStar生物软件对我国分离的三株猪口蹄疫病毒O型代表毒株(O/China/99， O/Miandian/98，O/ZK/93)进行序列分析，确定了优势抗原表位为第135-160位的 氨基酸区段，并确定以O/China/99的第200-213位的氨基酸区段为另外一个B抗原 表位。

2、基因克隆及其蛋白表达，纯化

多表位基因的设计及其合成：

为了防止在构建基因时出现新表位，在相邻两表位之间引入能保证各个表位结 构正确展示的间隔子序列GGSSGG，多表位基因的串联顺序为O/China/99(135-160) -O/Miandian/98(135-160)-O/ZK/93(135-160)-O/China/99(200-213)，并在 基因的5′-端和3′-端分别引入特异性酶切位点如EcoRI和HindIII，多表位基因的核 苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其所编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，多表 位基因的核苷酸序列委托大连宝生物公司合成。同时针对多表位基因设计了一条特 异性引物扩增合成以进行重复串联，引物为：3PU-BamHI 5-cccggatccAAGTATGACGAGAGCCCCGT-3，3PL-EcoRI 5-cccgaattcggtggctctagcggcggtCAAAAGCTGTTTCACAGGCG-3。将合成的多表位基 因和原核表达载体分别用EcoRI和HindIII酶切，纯化回收后插入用相应酶线性化 pET-30a(+)载体(Novagen)，构建重组表达质粒p3FOEN，转化JM109感受态进 行阳性筛选，通过序列测定确定阳性重组子。用上述特异性引物以重组表达质粒 p3FOEN为模板经PCR扩增多表位基因，扩增的目的基因经BamHI/EcoRI双酶切， 纯化回收后插入用相应酶线性化的p3FOEN重组质粒，构建所有表位2次重复的多 表位重复表达质粒p3FOEN2，其中两次串联重复多表位基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，其所编码的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，。

猪IgG重链恒定区基因(PIgG)的PCR扩增：

用primer5.0引物软件设计扩增猪IgG重链恒定区基因全长的特异性引物，正链 引物：5-AAGACGGCCCCATCGGT-3，负链引物：5-TTTACCCGGAGTCTTGGA-3， 获得全长为987kb的目的基因，然后用带有酶切位点的特异性引物pIgG HindIII 5-gctggtggctctagcggcggtGGGCCCTCGGTCTTCATC-3，pIgG xhoI 5-cctcaTTTACCCGGAGTCTTGG A-3对目的基因进行扩增、纯化、回收，其 中猪IgG重链恒定区核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，其所编码的氨基酸序列如 SEQ ID No.6所示，用HindIII/xhoI双酶切后，插入相应酶切线性化的重组表达质粒 p3FOEN2构建重组表达质粒p3FOEN2-PIgG，该质粒经酶切、PCR及序列测定为阳 性后-20℃保存备用，两次串联重复多表位基因与猪IgG连接基因序列连接后的完整 核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。

重组蛋白的表达及其生物活性鉴定：

将阳性重组表达质粒转化BL21(DE3)(Novagen)，挑选单克隆接种LB培养 液(Kan+)经IPTG诱导表达及表达形式鉴定后，大规模化表达重组蛋白，即从LAB 平板上挑单菌落接种5ml含卡那霉素的LB培养液，于37℃培养箱220rpm过夜培 养，将过夜培养物按1％加入新制备的无菌LB培养液中(kan+)，于37℃培养箱 220rpm培养至OD600≈0.4～0.6时，于超净台无菌条件下加入0.4mM的IPTG诱导 表达4～6小时，2000rpm离心30min收获培养物，按原培养物体积的20％加入蛋白 裂解液，冰浴条件下进行超声破碎处理(30min)，20000g离心20min收集沉淀(4℃)， 弃上清。按照Ni-NTA组氨酸纯化柱(Novagen)说明书纯化蛋白，纯化蛋白经 SDS-PAGE电泳及Western blotting分析，重组蛋白3FOEN2-PIgG大小与预期相符， 能与FMDV(O型)感染血清及辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG发生免疫反应， 说明表达的重组蛋白具有生物活性，表达的重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.8 所示。

实施例2口蹄疫病毒3D蛋白不同片段的制备

1、口蹄疫病毒3D蛋白基因的生物信息学分析：

口蹄疫病毒非结构蛋白3D是病毒RNA聚合酶，在口蹄疫病毒七个血清型中高 度保守，蛋白能与七个血清型病毒感染血清发生免疫反应。3D基因全长1410核苷 酸，编码一条长为470个氨基酸的蛋白，用DNAStar生物软件对获得的七个血清型 46个代表毒株序列分析及GenBank数据库比对，结果显示核苷酸同源性高于90％， 氨基酸同源性高于97％，高度保守。本研究采用Asia1型FMD病毒JS/China/05毒 株的3D序列作为参考序列设计引物扩增目的基因片段，并表达蛋白。

2、基因克隆及其蛋白表达，纯化

用3D蛋白特异性引物扩增3D蛋白基因全长及其3个片段，口蹄疫病毒3D蛋 白基因全长核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，其所编码的氨基酸序列如SEQ ID No. 10所示，扩增3D蛋白基因全长引物，正链引物为 5-GGATTGATAGTTGACACCAGAGA-3，负链引物为5-TGCGTCACCG  CACACGGCGTTC-3。编码N端片段(以3D1表示)的核苷酸序列如SEQ ID No.11 所示，其所编码的氨基酸序列如SEQ ID No.12所示，用于扩增N端片段的引物： 正链引物3D-1U/BamHI5′-CCCGGATCCGGATTGATAGTTGACACCAG-3′，负链引 物3D-1L/HindIII5′-CCCAAGCTTTCATTTCTCCATGAGCTCTAAGGC-3′；编码中 间片段(以3D2表示)的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示，其所编码的氨基酸序 列如SEQ ID No.14所示，用于扩增中间片段的引物：3D-2U/EcoRI5′-CCCG  AATTCGCCTTAGAGCTCATGGAGAAA-3′，3D-2L/HindIII5′-CCCAAGCTTTCA  GATGCTTGTTGCGGAACAACCA-3′；编码C端片段(以3D3表示)的核苷酸序列 如SEQ ID No.15所示，其所编码的氨基酸序列如SEQ ID No.16所示，用于扩增C 端片段的引物：3D-3U/BamHI5′-CCCGGATCCGGTTGTTCCGCAACAAGCATC-3′， 3D-3L/1HindIII5′-CCCAAGCTTTCATGCGTCACCGCAC ACGGCGTT-3′。将获得的 目的基因分别插入用相应酶HindIII及BamHI线性化的表达质粒pET-30a(+) (Novagen)中，分别构建相应的重组表达质粒p3DN(含有编码N端片段的核苷 酸序列)、p3DM(含有编码中间片段的核苷酸序列)和p3DC(含有编码C端片段 的核苷酸序列)。重组表达质粒经测序鉴定后转化BL21(DE3)(Novagen)，挑选单 克隆接种LB培养液(kan+)经IPTG诱导表达及表达形式鉴定后，大规模化表达 重组蛋白，即从LAB平板上挑单菌落接种5ml含卡那霉素的LB培养液，于37℃ 培养箱220rpm过夜培养，将过夜培养物按1％加入新制备的无菌LB培养液中 (kan+)，于37℃培养箱220rpm培养至QD600≈0.4～0.6时，于超净台无菌条件下加 入0.4mM的IPTG诱导表达4～6小时，2000rpm离心30min收获培养物，按原培养 物体积的20％加入蛋白裂解液，冰浴条件下进行超声破碎处理(30min)，20000g 离心20min收集沉淀(4℃)，弃上清。按照Ni-NTA组氨酸纯化柱(Novagen)说 明书纯化蛋白，纯化蛋白经SDS-PAGE电泳及Westem blotting分析，结果显示表达 得到的N端片段(3D1)、中间片段(3D2)、C端片段(3D3)大小均与预期相符。 除了3D蛋白N端蛋白片段外，其余蛋白均能与FMDV感染性血清发生免疫反应； 所有蛋白均能与抗组氨酸单抗发生免疫反应，说明表达的重组蛋白具有生物活性。 其中，表达得到的N端片段(3D1)的氨基酸序列如SEQ ID No.12所示，中间片 段(3D2)的氨基酸序列如SEQ ID No.14所示，C端片段(3D3)的氨基酸序列如 SEQ ID No.16所示。

实施例3、疫苗制备及免疫效力实验：

1、疫苗的制备

实施例1制备得到的纯化后的重组抗原以及实施例2制备得到的纯化后的3D 蛋白全长或其不同片段(3D1\3D2\3D3)分别经Bio-Rad定量试剂盒定量后稀释成 适当的浓度，纯化的3D蛋白片段分别与重组抗原按1∶2(V/V)配置后，加入等 体积的油佐剂ISA206(France)乳化成疫苗制剂，按1ml/管分装，其中含重组抗原 200μg，3D蛋白全长或其片段100μg。

2、免疫效力试验：

用制备的疫苗，按每头份1ml经肌肉途径接种猪(200μg抗原+100μg3D蛋 白全长或其片段)，免疫实验结果显示，无论是重组抗原单独还是与3D蛋白联合免 疫猪均能刺激机体产生高效价的FMDV保护性抗体，而且添加3D蛋白全长或其3 个片段任一后能显著增强抗体效价，加强免疫后14天，血清抗体效价明显升高， 85％的免疫动物血清抗体效价超过1∶720(LBP-ELISA)，70％的免疫动物血清抗体 效价高于1：1024提示具有良好的免疫效果结果如图1及图2所示。另外从重组表 位抗原单独或与3D全长蛋白(3DC)或其片段(3D1\3D2\3D3)联合免疫猪体效力 试验结果中可以看出，第一次免疫后28天添加3D全长蛋白或其片段(3D1\3D2\3D3) 的疫苗较表位抗原单独免疫效果好，但是加强免疫后表位抗原单独免疫效果较好， 结果如图2所示。

3、攻毒试验

按照我国口蹄疫疫苗免疫效力试验标准对免疫猪进行攻毒保护试验，即用 1000ID50/2ml同源病毒(如O型毒株O/China/99)对加强免疫后14天的动物进行 攻击，持续观察10天，结果显示，除了PBS对照动物出现典型的口蹄疫临床症状 外(发烧，嘴唇，蹄踵以及鼻镜出现水泡)，所有的免疫动物均未观察到任何临床 症状，获得100％保护。说明本发明研制的广谱疫苗具有良好的免疫效力，结果如 表1所示。

其中O型毒株O/China/99为现有技术中已公开的毒株，该毒株已记载在2009 年第01期《病毒学报》题为口蹄疫病毒泛亚型O/CHINA/99株全长cDNA分子克 隆构建和感染性鉴定一文中，作者为吕建亮等。现由中国农业科学院兰州兽医研究 所保存。

表1猪O型广谱多表位疫苗免疫猪体后攻毒保护试验结果

无论是重组抗原单独还是与3D蛋白全长或3D蛋白片段联合免疫免疫动物注射 部位没有出现红肿、发热等现象，也没有出现接种不良反应，食欲正常，精神状态 良好，提示本发明制备的猪口蹄疫病毒O型多表位疫苗具有良好的免疫原性，免疫 猪体后能够产生高水平的保护性抗体，接种后对免疫动物安全无害，是一种具有广 阔前景的新型疫苗，将对我国猪O型口蹄疫防控提供物质储备也技术支撑，具有重 要的意义。