用于预防或治疗抑郁症或抑郁状态的油脂组合物

摘要

本发明提供一种对抑郁症或抑郁状态的预防或治疗有效，并且安全性高，即使持续服用也不用担心副作用的油脂组合物。本发明的用于预防或治疗抑郁症或抑郁状态的油脂组合物的特征在于，以甘油三酯的形态含有碳原子数为8～10的中链脂肪酸和碳原子数为12～24的长链脂肪酸，相对于上述中链脂肪酸和上述长链脂肪酸的总量，上述长链脂肪酸的比例为25～90质量％。

说明书

技术领域

本发明涉及用于预防或治疗抑郁症或抑郁状态的油脂组合物，详细而言， 涉及将甘油三酯形态的中链脂肪酸和长链脂肪酸作为有效成分的用于预防或治 疗抑郁症或抑郁状态的油脂组合物。

背景技术

抑郁症是一种情感性精神障碍(mood disorder)，是以抑郁情绪、不安和焦躁、 精神活动降低、食欲下降、失眠症等为特征的精神疾病。根据日本警察厅的统 计，2007年日本自杀者人数连续10年超过3万人，其原因和动机大多为抑郁症， 因此急需寻求其对策。

临床证明抗抑郁药物对抑郁症有效。通常，抗抑郁药物并不一定有速效性， 并且疗效也无法确切地表现出来，因此，必须连续服用。但是，由于抗抑郁药 物具有副作用，因此连续服用时，必须考虑到药效与副作用的平衡。因此，期 望开发出即使连续服用也不必担心副作用的抗抑郁药物。

专利文献1：国际公开第2007/070701号小册子

发明内容

本发明是鉴于上述情况而完成的，其目的在于提供安全性高，即使连续服 用也不用担心副作用的用于预防或治疗抑郁症或抑郁状态的油脂组合物。

本发明人为了解决上述课题进行了反复深入研究，发现通过以甘油三酯的 形态含有一定比例的中链脂肪酸和长链脂肪酸的油脂组合物，能够解决上述课 题，从而完成了本发明。

迄今为止，已知中链脂肪酸甘油三酯能够预防和延迟伴随年龄增长的由认 知障碍所引起的注意力、集中力降低等(参照专利文献1)，但并没有其对抑郁症 有效的报道，更没有甘油三酯形态的中链脂肪酸和长链脂肪酸对抑郁症有效的 报道。

本发明具体提供以下内容。

(1)用于预防或治疗抑郁症或抑郁状态的油脂组合物，其以甘油三酯的形态 含有碳原子数为8～10的中链脂肪酸和碳原子数12～24的长链脂肪酸，并且，相 对于上述中链脂肪酸和上述长链脂肪酸的总量，上述长链脂肪酸的比例为25～90 质量％。

(2)如上述(1)所述的油脂组合物，上述中链脂肪酸为碳原子数8和/或10的 饱和脂肪酸，并且上述长链脂肪酸为碳原子数16～24的饱和脂肪酸和/或不饱和 脂肪酸。

(3)用于预防或治疗应激诱发性抑郁症或抑郁状态的上述(1)或(2)所述的油 脂组合物。

本发明的油脂组合物对抑郁症或抑郁状态具有抑制其发病、改善症状等效 果，因此可以用于预防或治疗抑郁症或抑郁状态。并且，本发明的油脂组合物， 含有甘油三酯形态的中链脂肪酸和长链脂肪酸作为有效成分，因此安全性高， 不用担心副作用，故可放心连续服用。

附图说明

图1是强迫游泳试验中不动时间的测定结果(施加强迫游泳应激(強制水泳に よるストレス負荷)的同时给予MLCT、LCT)的示意图。

图2是慢性轻度应激(chronic mild stress)的时间表的示意图。

图3是强迫游泳试验中不动时间的测定结果(施加慢性轻度应激的同时给予 MLCT、LCT)的示意图。

图4是高架十字迷宫试验中进入闭臂的次数(施加强迫游泳应激后同时给予 MLCT)的示意图。

图5是中链脂肪酸和长链脂肪酸的最佳剂量的研究结果的示意图。

图6是悬尾试验中不动时间的测定结果(施加慢性轻度应激后给予MLCT) 的示意图。

图7是给予MLCT所引起的脑海马p44/42MAPK活化能力的研究结果的示 意图。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明，本发明不受以下实施方式的 任何限定，可在本发明目的范围内进行适当变更。

本发明的用于预防或治疗抑郁症或抑郁状态的油脂组合物，其特征在于： 以甘油三酯的形态含有碳原子数为8～10的中链脂肪酸和碳原子数为12～24的长 链脂肪酸，相对于上述中链脂肪酸和上述长链脂肪酸的总量，上述长链脂肪酸 的比例为25～90质量％。

本发明的油脂组合物用于预防或治疗抑郁症或抑郁状态。应予说明，本发 明中抑郁症是指，医生根据例如美国精神病学会所制定的精神障碍诊断与统计 手册(DSM)的诊断标准所诊断出的抑郁症。并且，本发明中的抑郁状态是指，例 如由心理压力、季节节律或生物节律等身体内部的变化、自主神经失调症·惊 恐性障碍等疾病症状等引起的、表现为积极性降低、思考力降低、集中力降低、 精力降低、倦怠感、无力感、空虚感、健忘等症状的状态。而且，本发明中的 预防是指，例如，抑制、延迟发病等，治疗是指，例如，延迟病情恶化，缓解、 减轻、改善、治愈症状等。

本发明的油脂组合物的特征在于，以甘油三酯的形态含有碳原子数为8～10 的中链脂肪酸和碳原子数为12～24的长链脂肪酸。作为含有形态，可列举：含 有仅以上述中链脂肪酸作为结构脂肪酸的甘油三酯(以下简称MCT)和仅以上述 长链脂肪酸作为结构脂肪酸的甘油三酯(以下简称LCT)两者的形态、含有以上述 中链脂肪酸和上述长链脂肪酸作为结构脂肪酸的甘油三酯(以下简称M·LCT) 的形态、含有MCT和LCT以及M·LCT的形态、含有MCT和M·LCT的形 态、以及含有LCT和M·LCT的形态。应予说明，本发明中，将含有中链脂肪 酸和长链脂肪酸作为整个甘油三酯的物质统称为中长链脂肪酸甘油三酯(以下简 称MLCT)，来区别在1分子的甘油三酯中混合含有中链脂肪酸和长链脂肪酸的 M·LCT。本发明的意义在于首次发现了，虽然仅含有LCT的油脂组合物没有 显示出对抑郁症或抑郁状态的预防或治疗效果，但含有MLCT(其中LCT的所 占比例高)的油脂组合物显示出了对抑郁症或抑郁状态的预防或治疗效果。

本发明中的中链脂肪酸是碳原子数8～10的脂肪酸。从容易获得、价格低廉 的观点出发，优选碳原子数为8的饱和脂肪酸即辛酸、或碳原子数为10的饱和 脂肪酸即癸酸。此外，长链脂肪酸是碳原子数为12～24的脂肪酸，例如可列举 十二烷酸、十四烷酸、十六烷酸、十八烷酸、二十烷酸、二十二烷酸、二十四 烷酸等长链饱和脂肪酸，肉豆蔻烯酸、十五烯酸、棕榈油酸、油酸、亚油酸、亚 麻酸、γ-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸(icosapentaenoic acid)等长链不饱和 脂肪酸。本发明的油脂组合物中，优选地，中链脂肪酸是碳原子数为8和/或10 的饱和脂肪酸，并且上述长链脂肪酸是碳原子数为16～24的饱和脂肪酸和/或不 饱和脂肪酸，更优选地，中链脂肪酸是碳原子数为8和/或10的饱和脂肪酸，并 且上述长链脂肪酸是碳原子数为16～24的饱和脂肪酸和/或不饱和脂肪酸。

本发明的油脂组合物以甘油三酯的形态含有上述中链脂肪酸和上述长链脂 肪酸，该甘油三酯可以是以同种脂肪酸作为结构脂肪酸的同酸甘油三酯，也可 以是以不同种脂肪酸作为结构脂肪酸的混酸甘油三酯。当使用混酸甘油三酯时， 与各脂肪酸的甘油相结合的位置没有特别限定。

甘油三酯的制造方法并没有特别限定，可以使用已知的方法。例如，以碳 原子数为8的中链脂肪酸和碳原子数为10的中链脂肪酸作为结构脂肪酸的 MCT，可通过来自椰子油或棕榈仁油的碳原子数为8的中链脂肪酸以及碳原子 数为10的中链脂肪酸与甘油进行酯化反应而得。酯化反应的方法并没有特别限 定，例如可列举在加压条件下不使用催化剂和溶剂使之发生反应的方法，使用 甲醇钠等合成催化剂使之发生反应的化学酯交换法以及使用脂肪酶作为催化剂 使之发生反应的酶酯交换法。例如，可以按照常用方法，将原料油脂充分干燥， 对原料油脂添加0.1～1质量％的催化剂后，在减压条件下，在80～120℃下搅拌 0.5～1小时，由此使其发生化学酯交换反应。酯交换反应完成之后，用水冲洗催 化剂，然后进行一般的食用油精制工序中所进行的脱色、除臭处理即可。例如， 可通过对原料油脂添加0.02～10质量％的脂肪酶粉末或固定化脂肪酶后，在 40～80℃下搅拌0.5～48小时，来使其发生酶酯交换反应。酯交换反应完成后，通 过过滤等工序除去脂肪酶粉末或固定化脂肪酶，然后进行一般的食用油精制工 序中所进行的脱色、除臭处理即可。应予说明，酯交换反应可以是位置特异性 酯交换反应，也可以是随机酯交换反应也可，没有特别限定。

应予说明，LCT可从榨油原料经榨取并精制得到的大豆油、菜子油、玉米 油、米糠油、芝麻油、棉籽油、葵花籽油、红花油、亚麻籽油、紫苏油、橄榄 油等中得到。并且，也可以通过上述LCT的2种以上的酯交换反应得到。MLCT 可通过三种方法得到，即：上述中链脂肪酸和上述长链脂肪酸与甘油的酯化反 应、上述MCT与上述LCT的酯交换反应以及上述MCT与上述LCT的混合。

本发明的油脂组合物中，相对于上述中链脂肪酸和上述长链脂肪酸的总量， 上述长链脂肪酸的必要比例为25～90质量％，优选为27～90质量％，更优选为 29～90质量％，进一步优选为80～90质量％，最优选为85～88质量％。如果长链 脂肪酸的比例在上述范围中，则能抑制抑郁症或抑郁状态(以下简称抑郁状态等) 的发病，改善其症状等。应予说明，作为确认长链脂肪酸占以甘油三酯的形态 含有的中链脂肪酸与长链脂肪酸的总量的比例的方法，例如可列举对构成甘油 三酯的中链脂肪酸和长链脂肪酸进行甲基酯化后，再通过气体色谱法进行分析 的方法。

作为调整构成甘油三酯的中链脂肪酸和长链脂肪酸的比例的方法，例如可 列举制造由中链脂肪酸构成的甘油三酯的MCT和由长链脂肪酸构成的甘油三酯 的LCT以后，按照期望的比例进行混合的方法；预先准备期望比例的中链脂肪 酸和长链脂肪酸以后，用它们对甘油进行酯化的方法；预先准备期望比例的由 中链脂肪酸构成的甘油三酯的MCT和期望比例的由长链脂肪酸构成的甘油三酯 的LCT，将它们混合使它们发生酯交换反应的方法等。

在不损害本发明效果的范围内，为进一步提高保存稳定性和处理性，本发 明的油脂组合物可添加公知的乳化剂、抗氧化剂、色素、香料等。具体可列举 聚甘油脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、失水山梨糖醇脂肪酸酯、聚山梨醇酯、维生 素E、抗坏血酸脂肪酸酯、木酚素、辅酶Q10、阿魏酸酯、甘油二酯、聚硅氧烷、 生育酚、卵磷脂、植物固醇、植物固醇酯等。

本发明的油脂组合物对患有抑郁症或呈抑郁状态的包含人在内的动物有 效。尤其是对应激引起的抑郁状态等有预防或治疗的效果。本发明的油脂组合 物中所含有的甘油三酯以及作为其结构脂肪酸的中链脂肪酸和长链脂肪酸在自 然界中广泛存在，在可食用的自然物中也含有，因此其安全性非常高。因此， 本发明的油脂组合物例如适合用作药品(含动物用的)、食物、饲料等。

本发明的油脂组合物用作药品时，给药方式优选口服。这是由于甘油三酯 大部分经由肠道(小肠)的粘膜被体内吸收。作为适于口服的制剂，例如可列举胶 囊剂、片剂、丸剂、散剂、细粒剂、颗粒剂、液体剂、糖浆剂等。优选包含构 成作为有效成分的甘油三酯的中链脂肪酸和长链脂肪酸、和药理上以及制药上 可容许的添加剂的药品组合物形态的制剂。作为药理上和制药上可容许的添加 剂，例如可列举葡萄糖、乳糖、结晶纤维素、淀粉等的赋形剂、崩解剂、粘合 剂、包衣剂、色素、稀释剂等，通常可使用在制药领域中常用的且不会与本发 明的油脂发生反应的物质。

本发明的油脂组合物安全性非常高，并且不会像现有的预防或治疗抑郁症 的药物一样具有副作用，因此，可通过与现有药物组合使用，来降低该现有药 物的用量，降低该现有药物的副作用。与其他药物组合使用时，可像复合药物 一样包含在同一药品组合物中，也可以分别包含在不同药品组合物中。

本发明的油脂组合物的给药量可根据患者的症状、预防或治疗、年龄、体 重、给药方法、给药时间等各条件，适当选择。例如，在以治疗人(成人60kg) 为目的时，有效剂量一般为230～1230mg/kg/日，该药量一次或分数次服用即可。

可通过将本发明的油脂组合物填充加工在软胶囊里，作为营养辅助食物进 行服用。另外，本发明的油脂组合物可以保持原状或者将其加工成粉末油脂、 液状乳化油脂等以后直接摄取，或者可以进一步将其用于一般食品经加工间接 食用。

作为可使用本发明油脂组合物的一般食品，只要是使用油脂的加工食品即 可，并没有特别的限定，例如可列举面包、蛋糕、小甜饼干、饼干、蛋糕、巧 克力、软糖、生奶油、冰淇淋等面包·点心类，果汁饮料、能量饮料、运动饮 料等饮料类，汤类，调味汁、蛋黄酱、人造黄油等调味加工食品，炒菜用油， 煎炸用油，各种方便食品，流质食品，吞咽食品等。

[实施例]

以下，通过实施例对本发明进行更加详细的说明，但本发明不受这些实施 例的任何限定。

<制造例1>试验食物1的制造方法

添加7质量份的MLCT(商品名：ヘルシ一リセツタ，日清オイリオグル一 プ(株)制，相对于中链脂肪酸与长链脂肪酸的总量，长链脂肪酸的比例：87％， 脂肪酸的含有形态：M·LCT+MCT+LCT)作为饲料中的油脂成分，由此得到含 有7质量％MLCT的试验食物1。饲料组成如表1所示。

<制造例2>试验食物2的制造方法

添加7质量份的LCT(商品名：日清キヤノ一ラ油，日清オイリオグル一プ (株)制)作为饲料中的油脂成分，由此得到含有7质量％LCT的试验食物2。饲料 的组成如表1所示。

<制造例3>试验食物3的制造方法

分别添加1质量份的MCT(商品名：ODO，日清オイリオグル一プ(株)制) 和6质量份的LCT(商品名：日清キヤノ一ラ油，日清オイリオグル一プ(株)制) 作为饲料中的油脂成分，由此得到分别含有1质量％的MCT和6质量％的LCT 的试验食物3。饲料的组成如表1所示。应予说明，相对于该试验食物3中的中 链脂肪酸和长链脂肪酸的总量，长链脂肪酸的比例为86％。

<制造例4>试验食物4的制造方法

分别添加5质量份的MCT(商品名：ODO，日清オイリオグル一プ(株)制) 和2质量份的LCT(商品名：日清キヤノ一ラ油，日清オイリオグル一プ(株)制) 作为饲料中的油脂成分，由此得到分别含有5质量％的MCT和2质量％的LCT 的试验食物4。饲料的组成如表1所示。应予说明，相对于该试验食物4中的中 链脂肪酸和长链脂肪酸的总量，长链脂肪酸的比例为29％。

[表1]

<试验例1>对抑郁状态的预防效果的研究(1)

对小鼠施加强制游泳应激的同时，使其食用含有MLCT的饲料，来研究本 发明的油脂组合物对抑郁症或抑郁状态的预防效果。

[强迫游泳应激试验]

按照Porsolt R.D.等人开发的方法(Eur.J.Pharmacol.，47，379-391(1978)) 进行强迫游泳试验(FST：Forced Swim Test)。该试验是抑郁症的动物模型实 验中被经常使用的一种试验。在该试验中，强制使小鼠等动物在不可能逃避的 空间中游泳，再使其处于不动状态。即，开始时为从该环境中逃脱而拼命游泳 的小鼠，因无法出逃的压力而陷入无助感，逐渐进入不动状态。该不动状态可 看作放弃逃避行为的一种绝望状态，与人类的抑郁症相类似。而且，实际上， 有报告指出，多数的抗抑郁药物可缩短因强迫游泳引起的不动状态的时间(以下 简称不动时间)。这意味着强迫游泳时的不动时间是抑郁状态的程度的指标。因 此，本试验把强迫游泳时的不动时间作为评价预防效果的指标。

本试验采用6周龄的ddY系雄性小鼠(日本SLC，体重28～30g)。将小鼠放 入饲养笼中，在室温22±4℃、相对湿度55±15％、以12小时为周期进行明暗 转换的饲养室里进行饲养。让其自由食用水和饲料。试验共分两组进行，即， 食用含有MLCT的饲料的“试验食物1摄取组(实施例1)”和食用含有LCT的 饲料的“试验食物2摄取组(比较例1)”。以实验开始前每组小鼠的平均体重相等 的方式，进行分组。应予说明，试验中每组有11只小鼠，在施加应激的同时让 小鼠食用饲料。

按照以下方法施加强迫游泳应激。即，向5L的聚乙烯烧杯(poly beaker)(内 径：27cm，高度：27cm)中注入18cm高(水的总量：4L)的水(24～26℃)，让小鼠 在其中每天游泳1次，每次6分钟，连续进行14天。然后，在试验开始的第1 天、试验开始的第7天以及试验开始的第14天，用秒表测定在上述6分钟的强 制游泳时间中剩下的4分钟里被视为不动时间(秒)的时间。应予说明，小鼠在水 面漂浮并静止的状态判断为不动时间。然后，求出各不动时间的平均值，计算 出将试验开始的第1天的不动时间的平均值作为100时的相对值(％)。

应予说明，测定结果用各组的上述相对值±标准误差表示。各组间的显著 性差异通过student’st-检验进行测定(显著性水平：5％)。

结果如图1所示。本试验中不动时间的相对值越高，表示其抑郁状态越强。 食用含有MLCT饲料的试验食物1的摄取组(实施例1)的不动时间的相对值与含 有LCT饲料的试验食物2的摄取组(比较例1)相比，有显著性降低。

<试验例2>对抑郁状态的预防效果的研究(2)

通过施加慢性轻度应激的同时使小鼠食用含有MLCT的饲料，来研究本发 明的油脂组合物对抑郁症或抑郁状态的预防效果。应予说明，在本试验中将强 迫游泳时的不动时间作为评价预防效果的指标。

[慢性轻度应激试验]

本试验采用6周龄的ddY系雄性小鼠(日本SLC，体重28～30g)。将小鼠放 入饲养笼中，在室温22±4℃、相对湿度55±15％、以12小时为周期进行明暗 转换的饲养室里进行饲养。使其自由食用水和饲料。试验共分四组进行，即， 施加应激的同时使小鼠食用含有MLCT的饲料的“施加应激的试验食物1摄取 组(实施例2)”；施加应激的同时使小鼠食用含有LCT的饲料的“施加应激的试 验食物2摄取组(比较例2)”；不施加应激使小鼠食用含有MLCT的饲料的“不 施加应激的试验食物1摄取组(参考例1)”；以及不施加应激使小鼠食用含有LCT 的饲料的“不施加应激的试验食物2摄取组(参考例2)”。以试验开始前每组小鼠 的平均体重相等的方式进行分组。应予说明，每组5只进行试验，在施加应激 的同时使小鼠食用饲料。

按照按以下的方法施加慢性轻度应激。首先，在试验开始的第1天进行15 分钟的强迫游泳。强迫游泳中，向5L的聚乙烯烧杯(内径：27cm，高度：27cm) 中注入18cm高(水的总量：4L)的水(24～26℃)，让小鼠在其中强迫游泳15分钟。 之后，在普通的笼子中饲养1天让其休息。接着，在倾斜的笼子里(倾斜角：20°) 饲养2天，之后在普通的笼子里饲养1天让其休息。接下来，在用200mL的水 浸湿的有污垢的笼子里饲养1天，之后在普通的笼子里饲养1日让其休息。最 后，在转速为180rpm的旋转笼里饲养小鼠1天，之后在普通笼子里饲养1天让 其休息。将使用这3种笼子施加为期1周的应激作为1个试验单元，共进行3 个试验单元(3周)。时间安排表如图2所示。

然后，为了评价预防效果，在试验开始的第24天对小鼠进行强迫游泳试验。 应予说明，强迫游泳试验按照与上述相同的方法进行。即，向5L的聚乙烯烧杯 (内径：27cm，高度：27cm)中注入18cm高(水的总量：4L)的水(24～26℃)，让小 鼠在其中强迫游泳6分钟，用秒表测定在剩下的4分钟里被视为不动时间(秒) 的时间，求出平均值。以食用含有MLCT的饲料的“不施加应激的试验食物1 摄取组(参考例1)”的不动时间的平均值作为100，计算出食用含有MLCT的饲 料的“施加应激的试验食物1摄取组(实施例2)”的相对值(％)；以食用含有LCT 的饲料的“不施加应激的试验食物2摄取组(参考例2)”的不动时间的平均值作 为100，计算出食用含有LCT的饲料的“施加应激的试验食物2摄取组(比较例 2)”的相对值(％)。

应予说明，测定结果用各组的上述相对值±标准误差表示。各组间的显著 性差异通过student’s t-检验进行测定(显著性水平：5％)。

结果如图3所示。本试验中不动时间的相对值越高，表示其抑郁状态越强。 试验开始的第24天，食用含有MLCT的饲料的试验食物1摄取组(实施例2)的 不动时间的相对值与食用含有LCT的饲料试验食物2摄取组(比较例2)相比，有 显著性降低。该结果表明，食用MLCT不仅对由上述连续的强迫游泳试验引起 的慢性应激所导致的抑郁状态有效果，也对由其他试验引起的慢性应激所导致 的抑郁状态有效果。

<试验例3>对抑郁状态的预防效果的研究(3)

通过施加强迫游泳应激的同时，使小鼠食用含有MLCT的饲料，来研究本 发明的油脂组合物对抑郁症或抑郁状态的预防效果。应予说明，本研究不采用 强迫游泳时的不动时间作为评价指标，而是以高架十字迷宫试验中小鼠进入闭 臂的次数作为评价预防效果的指标，从而确认上述研究(1)以及(2)中的本发明的 油脂组合物所引起的不动时间的缩短是否是由活动量的增加而引起的。

[强迫游泳试验]

本试验采用6周龄的ddY系雄性小鼠(日本SLC，体重28～30g)。将小鼠放 入饲养笼中，在室温22±4℃、相对湿度55±15％、以12小时为周期进行明暗 转换的饲养室里进行饲养。让其自由食用水和饲料。试验共分3组，即，食用 含有MLCT的饲料的“试验食物1摄取组(实施例3)”；食用含有LCT的饲料的 “试验食物2摄取组(比较例3)”；食用市售饲料(商品名：ラボMRストツク， 日本农业工业(株)制)的“普通食物摄取组(参考例3)”。以试验开始前的各组小鼠 的平均体重相等的方式进行分组。应予说明，“试验食物1摄取组(实施例3)”以 及“试验食物2摄取组(比较例3)”有15只小鼠，“普通食物摄取组(参考例3)” 该组有25只小鼠，在施加应激的同时让小鼠食用饲料。

与上述相同，按照由Porsolt R.D.等开发的方法进行强迫游泳试验。即，向 5L的聚乙烯烧杯(内径：27cm，高度：27cm)中注入18cm高(水的总量：4L)的 水(24～26℃)，让小鼠在其中每天游泳1次，每次6分钟，连续进行14天。

[高架十字迷宫试验]

然后，在试验开始的第15天对小鼠进行高架十字迷宫试验。高架十字迷宫 试验按照Reeves P.G等开发的方法(J.Nutr.，123(11)，1923-1931(1993))进行。该试 验是抗焦虑药的筛选法中所经常使用的一种试验方法。小鼠在明亮的环境里会 感到不安，因此会回避明路。但同时小鼠会产生想探索的矛盾情绪。因此，探 索欲强的小鼠，其探索行动会增加，在作为明路的开臂和作为暗路的闭臂之间 来回走动的次数会增加。本研究以进入该闭臂的次数为活动量的指标，次数越 多，就认为其活动量越高。

应予说明，高架十字迷宫试验按以下方法进行。采用臂长66cm、宽6cm、 高62cm的高架十字迷宫试验装置，将小鼠放置在迷路中央部(开臂与闭臂的交 差部)使小鼠的头朝着闭臂的方向，观察小鼠的行动5分钟，测定其进入闭臂的 次数，求得平均值。

应予说明，测定结果用各组的上述进入次数的平均值±标准误差表示。组 间的显著性差异采用单因素方差分析法，以5％作为显著性水平进行检定。

结果如图4所示。食用含有MLCT的饲料的试验食物1摄取组(实施例3) 的活动量与普通食物摄取组(参考例3)的活动量之间无显著性差异，不存在由 MLCT而引起的活动量增加的情况。因此可知，MLCT引起的不动时间的缩短 不是由活动量的增加引起的。

<试验例4>对抑郁状态的预防效果的研究(4)

通过施加强迫游泳应激的同时，让小鼠食用含有不同配合量的中链脂肪酸 和长链脂肪酸的饲料，来研究对抑郁症或抑郁状态有预防效果的中链脂肪酸和 长链脂肪酸的最佳剂量。另外，通过让小鼠食用配合了MCT和LCT的含有 MLCT的饲料、以及配合了M·LCT、MCT和LCT的含有MLCT的饲料，来研 究对抑郁症或抑郁状态有预防效果的甘油三酯的摄取形态。应予说明，本试验 将强迫游泳时的不动时间作为评价预防效果的指标。

[强迫游泳试验]

本试验采用6周龄的ddY系雄性小鼠(日本SLC，体重28～30g)。将小鼠放 入饲养笼中，在室温22±4℃、相对湿度55±15％、以12小时为周期进行明暗 转换的饲养室里进行饲养。让其自由食用水和饲料。试验共分4组，即，食用 配合了M·LCT、MCT以及LCT的含有MLCT饲料的“试验食物1摄取组(实 施例4)”；食用含有LCT饲料的“试验食物2摄取组(比较例4)”；食用配合了 MCT(5质量％)以及LCT(2质量％)的含有MLCT饲料的“试验食物3摄取组(实 施例5)”；食用配合了MCT(1质量％)以及LCT(6质量％)的含有MLCT饲料的“试 验食物4摄取组(实施例6)”。以试验开始前每组小鼠的平均体重相等的方式进行 分组。应予说明，每组5只进行试验，对小鼠施加应激的同时让小鼠食用饲料。

与上述相同，按照由Porsolt R.D.等开发的方法(Eur.J.Pharmacol.，47，379 -391(1978))进行强迫游泳试验。即，向5L的聚乙烯烧杯(内径：27cm，高度： 27cm)中注入18cm高(水的总量：4L)的水(24～26℃)，让小鼠在其中每天游泳1 次，每次6分钟，连续进行20天。在试验开始的第1天以及试验开始第20日， 用秒表测定在上述6分钟的强迫游泳时间中剩下的4分钟里被视为不动时间(秒) 的时间，求出平均值。然后，求出各个不动时间的平均值，以试验开始的第1 天的不动时间的平均值作为100，算出相对值(％)。

应予说明，测定结果用各组的上述相对值±标准误差表示。组间的显著性 差异采用单因素方差分析法，以5％为显著性水平进行检定。

结果如图5所示。食用配合了M·LCT、MCT以及LCT的含有MLCT的饲 料的试验食物1摄取组(实施例4)和食用配合了MCT(1质量％)以及LCT(6质 量％)的含有MLCT饲料的试验食物4摄取组(实施例6)的不动时间的相对值，与 食用含有LCT饲料的试验食物2摄取组(比较例4)相比，有显著性降低。食用配 合了MCT(5质量％)以及LCT(2质量％)的含有MLCT饲料的试验食物3摄取组 (实施例5)的不动时间的相对值，与食用含有LCT饲料的试验食物2摄取组(比 较例4)相比，虽无显著性差异，但有降低的倾向。这是因为各组间平均值的差 别大，如果再稍微增加一些样本数，就能存在显著性差异。

此外，尽管食用含有LCT饲料的试验食物2摄取组(比较例4)的不动时间变 长，但食用配合了MCT(5质量％)以及LCT(2质量％)的含有MLCT饲料的试验 食物3摄取组(实施例5)，与配合了MCT(1质量％)以及LCT(6质量％)的含有 MLCT饲料的试验食物4摄取组(实施例6)相比，含有LCT较多的试验食物4 摄取组(实施例6)存在不动时间缩短的倾向。该结果提示构成甘油三酯的长链脂 肪酸具有最佳剂量(图5)。

并且，食用配合了M·LCT、MCT以及LCT的含有MLCT饲料的试验食物 1摄取组(实施例4)、与食用配合了MCT(1质量％)以及LCT(6质量％)的含有 MLCT饲料的试验食物4摄取组(实施例6)之间，其不动时间没有显著性差异， 因此可知，甘油三酯的摄取形态对抑郁状态的预防效果没有影响(图5)。

<试验例5>对抑郁状态的治疗效果的研究(1)

通过施加慢性轻度应激后，让小鼠食用含有MLCT的饲料，来研究本发明 的油脂组合物对抑郁症或抑郁状态的治疗效果。

[慢性轻度应激负荷试验]

试验采用6周龄的ddY系雄性小鼠(日本SLC，体重28～30g)。将小鼠放入 饲养笼中，在室温22±4℃、相对湿度55±15％、以12小时为周期进行明暗转 换的饲养室里进行饲养。让其自由食用水和饲料。在进行慢性轻度应激试验的 最初的24天里，让小鼠食用市售的饲料(商品名：ラボMRストツク，日本农产 工业(株)制)作为普通食物。上述试验完成后，让小鼠食用试验食物16天。试验 共分四组，即，在施加应激后让小鼠食用含有MLCT饲料的“试验食物1摄取 组(实施例7)”；在施加应激后让小鼠食用含有LCT饲料的“试验食物2摄取组(比 较例5)”；在施加应激后让小鼠食用市售饲料的“普通食物摄取组(参考例4)”； 不施加应激让小鼠食用市售饲料的“普通食物摄取组(参考例5)”。以实验开始前 的各组小鼠的平均体重相等方式进行分组。应予说明，每组5只进行试验。

按照以下的方法施加慢性轻度应激。首先，在试验开始的第1天，让小鼠 进行15分钟的强迫游泳。强迫游泳中，向5L的聚乙烯烧杯(内径：27cm，高 度：27cm)中注入18cm高(水的总量：4L)的水(24～26℃)，让小鼠在其中强迫游 泳15分钟。之后，在普通的笼子里饲养小鼠1天让其休息。接着，在倾斜的笼 子里(倾斜角：20°)饲养2天，之后在普通的笼子里饲养1天让其休息。接着， 在用200mL的水浸湿的有污垢的笼子里饲养1天，之后在普通的笼子里饲养1 日让其休息。最后，在转速为180rpm的旋转笼里饲养小鼠1天，之后在普通笼 子里饲养1日让其休息。将使用这3种笼子施加为期1周的应激作为1个试验 单元，共进行3个试验单元(3周)。

[悬尾试验]

然后，为评价治疗效果，施加慢性轻度应激后，在食用试验食物开始的第0 天、第9天以及第16天，对小鼠进行悬尾试验。悬尾试验与上述的强迫游泳试 验一样，是抑郁症的动物模型实验中所经常用到的一种方法，通过固定小鼠的 尾巴并将其倒吊，施加无法逃避的应激，来引起不动状态。因此，本研究把悬 尾垂吊时的不动时间作为评价MLCT效果的指标。应予说明，悬尾试验按以下 的方法进行。首先，使用实验台，用螺丝钳将金属制的固定棒固定在与地面平 行的高度为35cm的地方。接着，用纸做隔板，使小鼠相互看不到对方倒吊的状 态，用固定在固定棒上的用来悬挂小鼠尾巴的夹子(山下技研制)将小鼠的尾巴固 定，使其垂吊6分钟。用秒表测定在这6分钟里被视为不动时间(秒)的时间，即 小鼠保持悬吊状态的静止时间，求出平均值。

应予说明，测定结果用各组上述不动时间的平均值±标准误差来表示。组 间的显著性差异采用单因素方差分析法，以5％为显著性水平进行检定。

结果如图6所示。在摄食的第9天，施加应激后食用含有MLCT饲料的试 验食物1摄取组(实施例7)与普通食物摄取组(参考例5)之间没有显著性差异，具 有接近无应激状态的倾向。该结果提示，食用MLCT能够减轻或改善已经发病 的抑郁状态等。

以上对抑郁状态的预防或治疗效果的试验结果表明，本发明的油脂组合物 在动物试验中显示出优异地抗抑郁作用，因此对抑郁症或抑郁状态的预防或治 疗有用。

<试验例6>对MLCT的脑海马p44/42MAPK活化能力的研究

近年来，有报告指出，未治疗的抑郁症患者的血清的脑源性神经营养因子 (BDNF)比健康人的少(Huang T.L.et al.，J.Psychiatr.Res.，42(7)，521- 525(2008))。此外，抑郁症状与小鼠海马中的p44/42丝裂原活化蛋白激酶(MAPK) 的磷酸化水平呈负相关(Behavioural Brain Research，175，233-240(2006))。 MAPK作为BDNF的主要的细胞内信号传递途径(intracellular signaling  pathway)，被磷酸化后具有活性。其提示MAPK的磷酸化水平为抗抑郁的一个 指标。因此，通过测定给予MLCT的小鼠中脑海马p44/42MAPK的磷酸化水平， 来确定MLCT具有抗抑郁效果。

<制造例5>试验用乳化物1的制造方法

在65℃的加热状态下，将乳化剂溶解在生理盐水中后，用超声波混合，得 到试验用乳化物1。

<制造例6>试验用乳化物2的制造方法

在65℃的加热状态下，将乳化剂溶解在生理盐水中后，用超声波混合，在 其中配合1.2质量％的MLCT(商品名：ヘルシ一リセツタ，日清オイリオグル 一プ(株)制，相对于中链脂肪酸和长链脂肪酸的总量，长链脂肪酸的比例：87％， 脂肪酸的含有形态：M·LCT+MCT+LCT)，进一步用超声波乳化，得到试验用 乳化物2。

<制造例7>试验用乳化物3的制造方法

在65℃的加热状态下，将乳化剂溶解在生理盐水中后，用超声波混合，在 其中配合6质量％的MLCT(商品名：ヘルシ一リセツタ，日清オイリオグル一 プ(株)制，相对于中链脂肪酸和长链脂肪酸的总量，长链脂肪酸的比例：87％， 脂肪酸的含有形态：M·LCT+MCT+LCT)，进一步用超声波乳化，得到试验用 乳化物3。

<制造例8>试验用乳化物4的制造方法

在65℃的加热状态下，将乳化剂溶解在生理盐水中后，用超声波混合，在 其中配合1.2质量％的LCT(商品名：日清キヤノ一ラ油，日清オイリオグル一 プ(株)制)，进一步用超声波乳化，得到试验用乳化物4。

<制造例9>试验用乳化物5的制造方法

在65℃的加热状态下，将乳化剂溶解在生理盐水中后，用超声波混合，在 其中配合6质量％的LCT(商品名：日清キヤノ一ラ油，日清オイリオグル一プ (株)制)，进一步用超声波乳化，得到试验用乳化物5。

本试验采用7周龄的ddY系雄性小鼠(日本SLC，体重31～33g)。以每组小 鼠的平均体重相等的方式进行分组。应予说明，每组3只进行试验。给小鼠口 服通过上述方法制造的试验用乳化物1～5，3小时后断头处理取出脑海马。通过 蛋白印迹法(western blotting method)测定脑海马的p44/42MAPK的磷酸化水平。 印迹仪(blotting device)采用ATTO公司制造的ホライズブロツト，在电流 2mA/cm2、电压100V、电泳时间60分钟的条件下测定。用均化器在19倍量的 RIPA缓冲器中对脑海马进行均化。以16.1k×g对匀浆液进行10分钟的离心分 离，取上清液。使用上述上清液，在10％的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳(SDS- PAGE)。转印到硝化纤维素膜上后，在封闭液(含5％的脱脂牛奶的TBS)中浸泡 转膜(転写メンブラン)1小时。之后，用抗兔p44/42MAPK抗体(Cell Signaling 社制)或phospho-p44/42MAPK抗体(Cell Signaling社制造)在4℃下孵育一昼 夜。然后，用含0.1％Tween20的TBS(TBS-T)洗涤膜3次，再用碱性磷酸酶标 记的羊抗兔IgG抗体孵育1小时，用TBS-T洗涤后，在BCIP-NBT溶液(Dig3 缓冲液)中使其显色，检测p44/42MAPK蛋白。应予说明，各试样溶液的蛋白质 含量通过使用了二辛可宁酸(bicinchoninic acid)(BCA)的试剂盒来测定，在含有 5μg蛋白质的提取液里加入1/3量的4倍浓度的电泳用样本缓冲液以及1/10量的 2-巯基乙醇，在95℃下加热5分钟处理后，进行电泳。

接着，用扫描仪(ES-2200，EPSON社制)扫描显色所得到的蛋白带的颜色深 浅后，用图像分析软件(Image J，Wayne Rasband，美国国立卫生研究院(NIH)开 发，http://rsb.info.nih.gov/ij/)进行处理，得到数值。然后，分别求出试验用乳化 物1～5的各给药组的磷酸化/非磷酸化的数值，再求出试验用乳化物1的给药组 的磷酸化/非磷酸化数值的平均值。接着，以上述试验用乳化物1的给药组的磷 酸化/非磷酸化数值的平均值作为100，算出上述试验用乳化物1～5的各给药组 的磷酸化/非磷酸化数值的相对值(％)，求出给药组的平均值。将这些相对值的 平均值作为各给药组的p44/42MAPK的磷酸化水平，进行比较。

[统计处理]

测定结果用各组的上述相对值±标准误差表示。组间的显著性差异采用单 因素方差分析法，以5％为显著性水平进行检定。

结果如图7所示。p44/42MAPK中与神经细胞增殖有关的p42MAPK(ERK2) 的磷酸化水平，因给予含有MLCT的乳化物而呈浓度依赖性地上升。与此相反， 含有LCT的乳化物不存在这样的倾向。