精恶唑禾草灵水解酯酶基因、含有该基因的工程菌及其应用

摘要

本发明属于基因工程领域，涉及精恶唑禾草灵水解酯酶基因、含有该基因的工程菌及其应用。精恶唑禾草灵水解酯酶基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。其所编码的精恶唑禾草灵水解酯酶蛋白质，其氨基酸序列为：SEQ ID NO.2。将该精恶唑禾草灵水解酯酶基因构建重组质粒再导入E.coli BL21(DE3)即获得含有该基因的基因工程菌。所述精恶唑禾草灵水解酯酶基因可在水解芳氧苯氧丙酸类除草剂、三酰甘油酯和对硝基苯酯等方面应用。利用该基因生产的酶制剂可用于环境的生物修复、食品加工、医药、洗涤等行业，不仅可以解决精恶唑禾草灵的环境污染问题，还可以取得可观的经济效益。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及精恶唑禾草灵水解酯酶基因、含有该基因的工程菌及其应用。 

背景技术

精恶唑禾草灵2-[4-（6-氯-1，3-苯并恶唑-2-氧基）苯氧基]丙酸乙酯是1978年由德国Hoechst（现归并于德国Bayer）公司，开发出来的一种防除禾本科杂草的芳氧丙酸类除草剂，属于内吸传导型选择性芽后除草剂，主要用于麦田防除野燕麦、看麦娘等多种禾本科杂草，也可以防除豆类、甜菜、棉花、亚麻、花生和蔬菜田的一年生和多年生禾本科杂草。目前在世界及我国使用很广。但大量研究表明精恶唑禾草灵对水生生物表现为高毒性。 

环境污染物的降解主要依赖于土壤中微生物的作用，而微生物对物质的降解主要由细胞内的酶来完成。微生物是各种酶的重要来源。通过从环境中分离产酶微生物，利用分子克隆技术从产酶微生物中克隆产酶基因，再将其与合适的载体连接并转入相应宿主细胞，可进行酶的大量表达。目前，通过基因工程技术手段进行生产酶，已经成为工业用酶的主导。 

酯酶（esterase）广义上是指具有催化水解酯键能力的一类水解酶的总称，而通常所说的酯酶往往是羧酸酯酶（carboxylesterase，E.C.3.1.1.1），主要用来水解脂肪酸族和芳香族酯类物质。三酰甘油酯类和α-萘酯以及对硝基苯酯类物质都是酯酶的特异性底物。由于酯酶具有很高的活性，作为生物催化剂，利用其水解反应、酯转化和酯合成反应可以广泛应用于医药、化工、食品、能源及环保领域。 

发明内容

本发明的目的是针对精恶唑禾草灵对水生生物会产生高毒性的问题，提供一种精恶唑禾草灵水解酯酶基因。 

本发明的另一目的是提供含有该基因的基因工程菌。 

本发明的又一目的是提供该基因的应用。利用该基因生产的酶制剂可用于环境的生物修复、食品加工、医药、洗涤等行业，不仅可以解决精恶唑禾草灵的环境污染问题，还可以取得可观的经济效益。 

本发明的目的可通过如下技术方案实现： 

一种精恶唑禾草灵水解酯酶基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。该基因全长（从起始密码子到终止密码子）为1140bp，G+C含量为63.07%，编码379个氨基酸，其氨基酸序列为：SEQ ID NO.2。 

所述的精恶唑禾草灵水解酯酶基因核苷酸序列所编码的精恶唑禾草灵水解酯酶蛋白质，其氨基酸序列为：SEQ ID NO.2。 

一种重组质粒，该重组质粒是含有所述的精恶唑禾草灵水解酯酶基因的pET-29a(+)重组质粒。 

含所述的精恶唑禾草灵水解酯酶基因的基因工程菌E.coli BL21(DE3)。 

所述的基因工程菌E.coli BL21(DE3)的构建方法：所述的含精恶唑禾草灵水解酯酶基因的pET-29a(+)重组质粒转化到表达宿主菌E.coli BL21(DE3)获得重组微生物E.coli BL21(DE3)，再将所获得的重组微生物E.coli BL21(DE3)转接到含有200mg/l精恶唑禾草灵、50mg/l卡那霉素和24mg/l IPTG的平板，37℃培养16h后，挑取有透明水解圈的阳性转化子，经测序验证基因序列无误后，保存。 

所述精恶唑禾草灵水解酯酶基因在芳氧苯氧丙酸类除草剂水解方面的基因工程应用。 

其中，所述的芳氧苯氧丙酸类除草剂优选精恶唑禾草灵、精喹禾灵、炔草酯、氰氟草酯。 

所述精恶唑禾草灵水解酯酶基因在水解三酰甘油酯中的应用，所述的三酰甘油酯优选三乙酸甘油酯、三丁酸甘油酯或三己酸甘油酯。 

所述精恶唑禾草灵水解酯酶基因在水解对硝基苯酯中的应用，所述的对硝基苯酯优选乙酸对硝基苯酯、丁酸对硝基苯酯、己酸对硝基苯酯、辛酸对硝基苯酯、癸酸对硝基苯酯、月桂酸对硝基苯酯、肉豆蔻酸对硝基苯酯、棕榈酸对硝基苯酯，进一步优选丁酸对硝基苯酯。 

所述精恶唑禾草灵水解酯酶蛋白质在水解芳氧苯氧丙酸类除草剂方面的应用。 

其中，所述的芳氧苯氧丙酸类除草剂为优选精恶唑禾草灵、精喹禾灵、炔草酯、氰氟草酯。 

所述精恶唑禾草灵水解酯酶蛋白质在水解三酰甘油酯中的应用，所述的三酰甘油酯优选三乙酸甘油酯、三丁酸甘油酯或三己酸甘油酯。 

所述精恶唑禾草灵水解酯酶蛋白质在水解对硝基苯酯中的应用，所述的对硝基苯酯优选乙酸对硝基苯酯、丁酸对硝基苯酯、己酸对硝基苯酯、辛酸对硝基苯酯、癸酸对硝基苯酯、月桂酸对硝基苯酯、肉豆蔻酸对硝基苯酯、棕榈酸对硝基苯酯，进一步优选丁酸对硝基苯酯。 

本发明的有益效果如下： 

1.本发明以精恶唑禾草灵为唯一碳源从土壤中分离筛选到一株高效降解精恶唑禾草灵的菌株红球菌(Rhodococcus sp.）T1，并以该菌株为材料构建其基因组文库，并成功从该文库中克 隆出精恶唑禾草灵水解酯酶（精恶唑禾草灵降解过程中的关键酶之一）基因。该基因表达的产物精恶唑禾草灵水解酯酶，能高效的水解芳氧苯氧丙酸类除草剂精恶唑禾草灵、精喹禾灵、炔草酯、氰氟草酯等。 

2.利用该基因构建的工程菌株能高效表达精恶唑禾草灵水解酯酶，该酯酶还可以作用于三酰甘油酯、对硝基苯酯等其他酯类化合物，生产的酶制剂可用于环境的生物修复、食品加工、医药和洗涤等行业。 

附图说明

图1精恶唑禾草灵水解酯酶基因克隆的策略图。 

图2精恶唑禾草灵水解酯酶基因在E.coli BL21（pET-29a(+)）中高效表达实验方案图。 

生物材料保藏信息 

红球菌（Rhodococcus sp.）T1已于2011年7月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC），地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No.5030。 

具体实施方式

实施例1.精恶唑禾草灵水解酯酶基因的克隆 

1.1红球菌(Rhodococcus sp.）T1的筛选 

在100ml含25mg/l精恶唑禾草灵的富集培养基（K₂HPO₄ 1.5g/l，KH₂PO₄ 0.5g/l，NH₄NO₃1.0g/l，MgSO₄·7H₂O 0.10g/l，NaCl 1.0g/l，酵母粉20mg/l，pH 7.0）中加入5g受精恶唑禾草灵污染的土样，于30℃、180rpm培养7d。富集培养液经盐酸酸化和二氯甲烷抽提后，利用高效液相色谱测定有降解效果后，吸取10ml富集液转接至新鲜富集培养基中，连续富集，并逐步提高精恶唑禾草灵的浓度至200mg/l。待富集液降解效果稳定后，采用梯度稀释平板法，将稀释的富集液在含100mg/l精恶唑禾草灵的MSM固体培养基平板上涂布，30℃培养。待平板上出现单菌落后，挑选菌落周围有透明圈的单菌落转接至含25mg/l精恶唑禾草灵的液体无机盐培养基（K₂HPO₄ 1.5g/l，KH₂PO₄ 0.5g/l，NH₄NO₃ 1.0g/l，MgSO₄·7H₂O 0.10g/l，NaCl1.0g/l，pH 7.0）中，30℃、180rpm培养2d。培养液经盐酸酸化，二氯甲烷抽提后测定单菌对精恶唑禾草灵的降解效果。其中菌株T1具有最强的降解精恶唑禾草灵的能力，经生理生化试验和16S rDNA序列扩增、测序鉴定为Rhodococcus sp.。该菌株在pH 7.0的LB培养基中， 30℃下生长良好。培养24h可见乳白色或淡红色圆形，湿润，粘稠的菌落。红球菌(Rhodococcus sp.）T1已于2011年7月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC），地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No.5030。 

1.2红球菌(Rhodococcus sp.）T1基因组文库的构建 

采用高盐法提取T1（CGMCC No.5030）的染色体总DNA，用限制性内切酶Sau3AI将其部分酶切，再经琼脂糖凝胶电泳分离回收4-6kb的DNA片段，与脱磷载体pUC118(BamHⅠ/BAP)（TaKaRa，Code:D3321，下同）连接后，化学转化导入制备好的E.coli DH5α感受态细胞（TaKaRa，Code:D9057，下同），构建红球菌(Rhodococcus sp.）T1基因组文库。通过含200mg/l精恶唑禾草灵的LB平板挑选含精恶唑禾草灵水解酯酶基因的阳性克隆。 

1.2.1菌体总DNA的提取 

采用高盐法提取红球菌(Rhodococcus sp.）T1（CGMCC No.5030）的染色体总DNA：挑取红球菌(Rhodococcus sp.)T1（CGMCC No.5030）单菌落接种于3ml LB液体培养基中，30℃、180rpm培养至OD600nm≈1.0，12000rpm离心收集菌体；用1.0mL TE缓冲液（10mmol/l Tris·Cl(pH8.0),1mmol/l EDTA，pH 8.0）重悬洗涤菌体，10000rpm离心5min收集菌体，加入1.0ml TEN缓冲液（10mmol/l Tris·Cl(pH8.0),1mmol/l EDTA，0.1mol/l NaCl pH 8.0）悬浮菌体，加入5μl的溶菌酶（100mg/mL），37℃水浴1h，加入25-50μl 20%SDS和5μl蛋白酶K(20mg/ml)，65℃水浴2h，待液体澄清后，加入340μl饱和NaCl溶液剧烈震荡，12000rpm离心10min，将上清液转移至无菌洁净eppendorf管中，用等体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）抽提至界面澄清无白色固体物为止，转移上清液于另一无菌洁净eppendort管中，加入0.6倍体积的异丙醇，-20℃放置0.5-1h沉淀DNA，12000rpm离心10min，去除上清后用70%乙醇洗涤2次，待乙醇挥发后加入30μl无菌水或TER，放置4℃冰箱过夜溶解，短期4℃保存，长期采用-20℃冻存。 

1.2.2限制性内切酶Sau3AI酶切总DNA体系如下： 

37℃酶切30min。加入3μl 10×loading buffer终止酶切反应。酶切产物经0.75%琼脂糖凝 胶电泳进行分离，回收4-6kb DNA片段。回收按照试剂盒说明书进行。 

1.2.3酶切片段与脱磷载体pUC118(BamH Ⅰ/BAP)的连接 

将1μl pUC118(BamH Ⅰ/BAP)载体DNA转移到无菌微量离心管中，加入6μl总DNA的Sau3AI酶切回收片段，加水至8.5μl，于45℃加温5min使重新退火的粘端解链，将混合物冷却到0℃。然后加入1μl10×T₄DNA连接酶缓冲液，0.5μl T₄DNA连接酶。16℃连接反应12h以上。 

1.3酶连产物的转化与阳性克隆的筛选 

将10μl酶连产物加入到200μl在冰上融化后的E.coli DH5α感受态细胞中，冰浴30min，在42℃水浴锅中热激90s后。快速转移到冰浴中冷却1~2min，向每管中加入800μl液体LB培养基，37℃摇床80-90rpm温育45min，复苏细胞。4000rpm离心3min，剩余200μl感受态细胞涂布于含200mg/l精恶唑禾草灵和100mg/l氨苄青霉素的LB琼脂平板上，平板倒置于37℃培养箱培养，12-16h后出现菌落，选择有水解圈的克隆子，即为含精恶唑禾草灵水解酯酶基因片段的阳性克隆子，同时对阳性克隆子进行编号。挑单菌落接种于3ml LB液体试管，待长出菌悬液后提质粒验证。 

1.4阳性克隆子插入片段的测序与分析 

阳性克隆子插入片段的测序委托上海英潍捷基生物技术有限公司完成。测序引物为pUC118(BamHⅠ/BAP)载体上特异性引物，并根据两端测序结果设计引物，直至将整个插入片段测通。 

将测序完成的序列在NCBI数据库中进行比对，并利用ORF finder工具鉴定插入片段所含的ORF。 

1.5精恶唑禾草灵水解酯酶基因的PCR扩增 

根据推断的精恶唑禾草灵水解酯酶ORF，设计两对引物，利用重叠延伸PCR技术扩增精恶唑禾草灵水解酯酶基因。其中正向引物F1:5’-CATATGGCGAACATCGAAGGCGTA-3’（SEQ ID NO.3）带有NdeI酶切位点，反向引物R1:5’-CTCGAGTCAACTCAAAGCGTCGTAGGC-3’（SEQ ID NO.4）带有一个XhoI酶切位点，用于扩增精恶唑禾草灵水解酯酶全基因。另外一对引物F2:5’-GTTCACCCTGGAGAACATTTG-3’（SEQ ID NO.5）和R2:5’-CAAATGTTCTGGAGGGTGAAC-3’（SEQ ID NO.6）为一对互补序列，用于使精恶唑禾草灵水解酯酶基因内部的一个XhoI酶切位点发生定点突变，避免精恶唑禾草灵水解酯酶基因被XhoI切断。 

PCR反应分四次进行，第一次以1.4中经测序验证的含精恶唑禾草灵水解酯酶基因的阳性 克隆质粒为模板，利用引物F1和R2对精恶唑禾草灵水解酯酶基因中包含XhoI酶切位点在内的左侧的片段进行扩增。第二次以阳性克隆质粒为模板利用引物F2和R1为引物对精恶唑禾草灵水解酯酶基因中包含XhoI酶切位点在内的右侧的片段进行扩增。第三次以前两次扩增的PCR产物为模板，利用引物F1和R1进行扩增，得到精恶唑禾草灵水解酯酶的完整基因。第四次以第三次扩增产物为模板，利用Taq酶对扩增片段加A尾。 

第一次扩增： 

扩增体系： 

PCR扩增程序： 

a.98℃变性10sec，55℃退火10sec，72℃延伸1min，进行30个循环； 

b.72℃延伸10min； 

c.15℃冷却10min。 

第二次扩增：将扩增引物改为F2和R1，其余与第一次扩增相同。 

第三次扩增： 

扩增体系： 

PCR扩增程序： 

第四次扩增：PCR产物加A尾 

扩增体系： 

PCR扩增条件：72℃延伸20min；10℃保温10min。 

1.6酶连 

经PCR加A尾的精恶唑禾草灵水解酯酶DNA片段与pMD 19-T Vector（TaKaRa Code：D102A）按摩尔比3:1混合，在连接液作用下，16℃水浴过夜。酶连体系如下： 

1.7酶连产物的转化和阳性克隆子的筛选（参考1.3） 

1.8阳性克隆子质粒的提取与测序 

将1.7中筛选得到的阳性克隆子在含氨苄青霉素的LB培养基中培养过夜，12000rpm离心10min收集菌体，利用质粒提取试剂盒提取质粒，送上海英潍捷基生物有限公司测序。 

实施例2.精恶唑禾草灵水解酯酶基因在E.coli BL21(pET-29a(+))中的高效表达 

2.1将1.8中提取的重组质粒用NdeI和XhoI双酶切 

酶切体系： 

在37℃水浴中，反应3h以上。酶切产物进行0.75%的琼脂糖凝胶电泳切胶回收。 

2.2pET-29a(+)（Merck-Novagen，Cat NO.69871）用NdeI和XhoI双酶切（参考2.5）。 

2.3转化和表达 

2.1中的回收片段和2.2中酶切好的pET-29a(+)进行酶连得含精恶唑禾草灵水解酯酶基因的pET-29a(+)重组质粒。 

酶连好的含精恶唑禾草灵水解酯酶基因的pET-29a(+)重组质粒转化到表达宿主菌E.coli BL21(DE3)（NBE，Cat NO.C2527H）获得重组微生物E.coli BL21(DE3)，涂布含有200mg/l精恶唑禾草灵、50mg/l卡那霉素和24mg/l IPTG的平板，经37℃培养16-20h后，挑取有透明水解圈的阳性克隆子，经测序验证基因序列无误。 

2.4验证阳性转化子表达的酶对精恶唑禾草灵的水解功能 

2.3中得到的阳性克隆子在LB培养基中37°C培养至0D_600nm在0.5-0.6之间，加IPTG至浓度0.2mM，18℃继续培养24h。收集菌体用磷酸缓冲液（pH8.0）重悬后，用超声处理破碎菌体细胞，20000g离心15min，所得上清即为精恶唑禾草灵水解酯酶粗酶液。取10μl精恶唑禾草灵水解酯酶粗酶液加至4ml含有100mg/l精恶唑禾草灵的磷酸缓冲液中，于50℃反应5min后，用高效液相色谱检测精恶唑禾草灵的降解情况。酶活单位定义为每分钟产生1μmol精恶唑禾草灵酸即为一个单位，测得粗酶的比活力为31.83μmol/min/mg，即1mg该粗酶以精恶唑禾草灵为底物在最适条件下反应每分钟可获得31.83μmol精恶唑禾草灵酸。后将该酶通过Ni-NTA亲和层析纯化并经超滤浓缩后测得该酶在以精恶唑禾草灵为底物时的比活力为2995.03μmol/min/mg，即1mg纯酶在精恶唑禾草灵为底物时每分钟产生2995.03μmol精恶唑禾草灵酸。该结果表明纯化浓缩后的比酶活力约为粗酶的94倍。 

实施例3精恶唑禾草灵水解酯酶对三酰甘油酯的水解 

将337μg纯化的精恶唑禾草灵水解酯酶（制备方法同实施例2）加入到5ml分别含0.02 mol/l三乙酸甘油酯、三丁酸甘油酯、三己酸甘油酯、三辛酸甘油酯和三癸酸甘油酯的磷酸缓冲液（0.02mol/l,pH7.5）中，在50℃下反应10min，加入10ml乙醇终止反应后再加两滴1%酚酞溶液，用0.01mol/l NaOH滴定至浅粉色，记录NaOH用量。酶活单位定义为每分钟产生1μmol相应酸即为一个单位。结果表明精恶唑禾草灵水解酯酶可作用于三乙酸甘油酯、三丁酸甘油酯和三己酸甘油酯，它们的比活力分别为3164.47、1107.57和59.33μmol/min/mg。但不能作用于三辛酸甘油酯和三癸酸甘油酯。 

实施例4精恶唑禾草灵水解酯酶对对硝基苯酯的水解 

将0.67μg纯化的精恶唑禾草灵水解酯酶（制备方法同实施例2）加入到4ml分别含0.02mol/l乙酸对硝基苯酯、丁酸对硝基苯酯、己酸对硝基苯酯、辛酸对硝基苯酯、癸酸对硝基苯酯、月桂酸对硝基苯酯、肉豆蔻酸对硝基苯酯及棕榈酸对硝基苯酯的磷酸缓冲液（0.02mol/l,pH8.0）中，在50℃下反应，5min后立即稀释10倍，测定OD_410nm。酶活单位定义为每分钟产生1μmol相应酸即为一个单位。结果表明精恶唑禾草灵水解酯酶对丁酸对硝基苯酯的水解活力最强，比活力为13814.16μmol/min/mg。随着脂肪酸碳链的延长，水解活力逐渐降低，其对乙酸对硝基苯酯、己酸对硝基苯酯、辛酸对硝基苯酯、癸酸对硝基苯酯、月桂酸对硝基苯酯、肉豆蔻酸对硝基苯酯和棕榈酸对硝基苯酯的比活力分别为7013.14、9011.83、5627.81、2542.37、1148.951、199.06和130.63μmol/min/mg。 

实施例5精恶唑禾草灵水解酯酶对其他芳氧苯氧丙酸类除草剂的水解 

将1.47μg纯化的精恶唑禾草灵水解酯酶（制备方法同实施例2）加入到4ml分别含100mg/l精喹禾灵、炔草酯、氰氟草酯的磷酸缓冲液中（0.02mol/l,pH8.0），在50℃下反应，5min。加10%HCl调节pH至2.0，加等体积二氯甲烷抽提。去水相，加无水硫酸钠去除残留水分。取1ml抽提液，室温挥发至干。剩余物用甲醇溶解后，用高效液相色谱检测精喹禾灵、炔草酯、氰氟草酯的降解情况。酶活单位定义为每分钟降解1μmol相应底物即为一个单位，测得纯酶对精喹禾灵、炔草酯和氰氟草酯的比活力分别为3287、3463、2496μmol/min/mg。