辅助鉴定番茄黄化曲叶病毒抗性植株的特异引物对及其应用

摘要

本发明公开了一种辅助鉴定番茄黄化曲叶病毒抗性植株的特异引物对及其应用。本发明提供的特异引物对由序列表的序列1所示DNA片段和序列表的序列2所示DNA片段组成。本发明提供的特异引物对，具有特异性好、灵敏度高的优点，可以从分子水平准确、快速、高效地检测植株中是否为番茄抗黄化曲叶病毒抗病品种，是否携带番茄抗黄化曲叶病毒基因Ty3a。本发明的引物对可以方便地应用到番茄杂交种种子纯度鉴定以及番茄杂交种品种真实性鉴定；可以方便地应用到抗病毒育种材料的鉴定筛选以及抗病毒品新品种的培育。这项技术将为TYLCV的综合防控和北京及全国的蔬菜安全可持续生产提供强有力的科技支撑。

说明书

技术领域

本发明涉及一种辅助鉴定番茄黄化曲叶病毒抗性植株的特异引物对及其应用。

背景技术

番茄(Solanum lycopersicum)是一种重要的世界性蔬菜作物，在我国设施蔬菜 生产中占有重要位置。以北京为例，番茄、黄瓜、甜辣椒和茄子4种果类蔬菜的设施 生产面积25万余亩，其中番茄12.8万余亩。因此，番茄的安全生产对于北京“菜篮 子”工程起到举足轻重的作用。

病毒病是番茄生产中最常见且发病最普遍的病害之一，其中番茄黄化曲叶病毒 (Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV)严重地威胁着番茄的安全生产。番茄黄化 曲叶病毒属于双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属(Begomoviruses)， 是一种双生DNA病毒，通过“超级害虫”-烟粉虱传播，具有突发性和难以控制的特 点。番茄黄化曲叶病毒可以侵染茄科、豆科等多种植物，主要危害番茄、辣椒、茄子、 甘蓝和黄瓜等蔬菜以及烟草等经济作物，特别是在番茄上危害更重，受害植物的症状 (发病表征)表现如下：生长缓慢，植株明显矮化；顶部叶片皱缩、叶周边向上卷曲， 叶片变厚变小，叶片区域性黄化；坐果少，果实硬小，不能正常转色，丧失商品性； 危害严重时不能开花坐果，造成绝产。

番茄黄化曲叶病毒是近几年新传入我国的有害生物。1964年最早在以色列发生， 之后迅速扩散到中东、地中海沿岸、东亚、南亚、非洲、欧洲、美国、中美洲、澳大 利亚等众多国家和地区。2002年传入我国南方省份。2005年秋在广西番茄主产区百色 市田阳镇大面积爆发，同年传入江浙一带。2007年传入河南和山东。2008年该病在全 国多个省市发展蔓延。2009年该病在河北局部地区和山东寿光大爆发，发生面积10 多万亩，番茄损失8万多亩。2009年夏秋季，在北京郊区县陆续发生，北京地区主栽 的粉色大果番茄品种大多对该病毒敏感，该病害遍及通州、大兴、顺义、平谷、密云、 延庆、昌平、房山、怀柔、丰台、朝阳、海淀等区县，发病棚室一般病株率5-10％， 重病棚室病株率20％左右，个别棚室发病率达90％以上，造成严重减产或绝收，且病情 发展迅速呈蔓延趋势。

从世界各国番茄黄化曲叶病毒危害及防控的经验来看，利用番茄植物自身的抗性 基因，培育并推广抗病毒新品种是最经济有效防控番茄黄化曲叶病毒的根本途径。如 何针对性地快速准确地鉴定并利用番茄自身抗性基因培育抗病毒新品种，以及快速准 确便捷地鉴定番茄抗病毒新品种的真实性和杂交种纯度，这是番茄安全生产的迫切需 求。

在当前的研究中，从番茄种质资源中已经鉴定到6个番茄黄化曲叶病毒抗性相关基 因，依次命名为番茄抗黄化曲叶病毒基因Ty1(又称Ty1基因)、番茄抗黄化曲叶病毒基 因Ty2(又称Ty2基因)、番茄抗黄化曲叶病毒基因Ty3(又称Ty3基因)、番茄抗黄化曲 叶病毒基因Ty3a(又称Ty3a基因)、番茄抗黄化曲叶病毒基因Ty4(又称Ty4基因)和番 茄抗黄化曲叶病毒基因Ty5(又称Ty5基因)，上述6个基因依次定位在番茄第6号染色体、 第11号染色体、第6号染色体、第6号染色体、第3号染色体和第4号染色体上，其中Ty1 基因、Ty2基因和Ty3a基因已应用于当前的抗病品种的培育中。目前根据材料的抗性表 现，Ty3a基因对于该病毒具有高抗性，但是其具体序列未知。

发明内容

本发明的目的是提供一种辅助鉴定番茄黄化曲叶病毒抗性植株的特异引物对及其 应用。

本发明提供了序列表的序列1所示DNA片段和序列表的序列2所示DNA片段组成 的特异引物对。

所述特异引物对可用于辅助鉴定番茄对番茄黄化曲叶病毒的抗性。

本发明还保护一种辅助鉴定番茄对番茄黄化曲叶病毒抗性的方法，包括如下步骤： 以待测番茄的基因组DNA为模板，用所述特异引物对进行PCR扩增，如果PCR扩增产 物中具有454bp的特异性条带、待测番茄为候选的番茄黄化曲叶病毒抗病番茄，如果 PCR扩增产物中不具有454bp的特异性条带、待测番茄为候选的番茄黄化曲叶病毒感 病番茄。

所述待测番茄为番茄材料M82或其子代、番茄材料Gc171或其子代、苏粉13号或 其子代或罗曼娜2号或其子代。所述待测番茄具体可为番茄材料M82、番茄材料Gc171、 或番茄材料M82和番茄材料Gc171的子代。

所述特异引物对可用于筛选番茄黄化曲叶病毒抗病番茄。

本发明还保护一种筛选番茄黄化曲叶病毒抗病番茄的方法，包括如下步骤：以待 测番茄的基因组DNA为模板，用所述特异引物对进行PCR扩增，如果PCR扩增产物中 具有454bp的特异性条带，待测番茄为候选的番茄黄化曲叶病毒抗病番茄。

所述待测番茄为番茄材料M82或其子代、番茄材料Gc171或其子代、苏粉13号或 其子代或罗曼娜2号或其子代。所述待测番茄具体可为番茄材料M82、番茄材料Gc171、 或番茄材料M82和番茄材料Gc171的子代。

所述特异引物对可用于辅助鉴定番茄是否携带番茄抗黄化曲叶病毒基因Ty3a。

本发明还保护一种辅助鉴定番茄是否携带番茄抗黄化曲叶病毒基因Ty3a的方法， 包括如下步骤：以待测番茄的基因组DNA为模板，用所述特异引物对进行PCR扩增， 如果PCR扩增产物中具有454bp的特异性条带、待测番茄疑似携带番茄抗黄化曲叶病 毒基因Ty3a，如果PCR扩增产物中不具有454bp的特异性条带、待测番茄疑似不携带 番茄抗黄化曲叶病毒基因Ty3a。

所述待测番茄为番茄材料M82或其子代、番茄材料Gc171或其子代、苏粉13号或 其子代或罗曼娜2号或其子代。所述待测番茄具体可为番茄材料M82、番茄材料Gc171、 或番茄材料M82和番茄材料Gc171的子代。

所述特异引物对可用于筛选携带番茄抗黄化曲叶病毒基因Ty3a的番茄。

本发明还保护一种筛选番茄抗黄化曲叶病毒基因Ty3a的番茄的方法，包括如下步 骤：以待测番茄的基因组DNA为模板，用所述特异引物对进行PCR扩增，如果PCR扩 增产物中具有454bp的特异性条带、待测番茄为候选的携带番茄抗黄化曲叶病毒基因 Ty3a的番茄。

所述待测番茄为番茄材料M82或其子代、番茄材料Gc171或其子代、苏粉13号或 其子代或罗曼娜2号或其子代。所述待测番茄具体可为番茄材料M82、番茄材料Gc171、 或番茄材料M82和番茄材料Gc171的子代。

所述特异引物对可用于制备试剂盒；所述试剂盒的功能为如下(a)、(b)、(c)、 (d)、(e)、(f)或(g)：(a)辅助鉴定番茄对番茄黄化曲叶病毒的抗性；(b)筛选番 茄黄化曲叶病毒抗病番茄；(c)辅助鉴定番茄是否携带番茄抗黄化曲叶病毒基因 Ty3a；(d)筛选携带番茄抗黄化曲叶病毒基因Ty3a的番茄；(e)辅助鉴定番茄黄化曲 叶病毒抗病番茄的杂交种种子的纯度；(f)辅助鉴定番茄黄化曲叶病毒抗病番茄的杂 交种的品种真实性；(g)番茄黄化曲叶病毒抗病番茄育种。

所述番茄为番茄材料M82或其子代、番茄材料Gc171或其子代、苏粉13号或其子 代或罗曼娜2号或其子代。所述待测番茄具体可为番茄材料M82、番茄材料Gc171、或 番茄材料M82和番茄材料Gc171的子代。

本发明提供的特异引物对，具有特异性好、灵敏度高的优点，可以从分子水平准 确、快速、高效地检测植株是否为番茄抗黄化曲叶病毒抗病品种，是否携带Ty3a基因。 本发明的引物对可以方便地应用到番茄杂交种种子纯度鉴定以及番茄杂交种品种真实 性鉴定，可以方便地应用到抗番茄黄化曲叶病毒育种材料的鉴定筛选以及抗番茄黄化 曲叶病毒新品种的培育。本发明将为番茄黄化曲叶病毒的综合防控和北京及全国的蔬 菜安全可持续生产提供强有力的科技支撑。

附图说明

图1为实施例2中的琼脂糖凝胶电泳图。

图2为实施例3中苗期的症状表现图。

图3为实施例3中的琼脂糖凝胶电泳图。

图4为实施例3中成株的症状表现图。

图5为实施例4中的琼脂糖凝胶电泳图。

图6为实施例6中的琼脂糖凝胶电泳图。

图7为实施例7中的琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明， 均为自常规生化试剂商店购买得到的。实施例中病毒接种植株的方法参见文献：番茄 黄化曲叶病毒病抗性鉴定技术研究，分子植物育种，2011，9(2)：210-217。

番茄材料M82获自美国番茄遗传资源中心(The C.M.Rick Tomato Genetics  Resource Center)，种质编号为LA3475，为番茄黄化曲叶病毒感病品种，不含有包括 Ty3a基因在内的任何番茄黄化曲叶病毒抗性相关基因。

番茄材料Gc171获自美国番茄遗传资源中心(The C.M.Rick Tomato Genetics  Resource Center)，种质资源编号为LA1932，为番茄黄化曲叶病毒抗病品种，含有Ty3a 基因。

番茄黄化曲叶病毒：公众可从北京市农林科学院、中国科学院遗传与发育生物学 研究所或江苏省农业科学院获得；参考文献：上海地区番茄黄化曲叶病毒病的鉴定及 嫁接接种法研究，基因组学与应用生物学，2009，28(1)：115-118。

实施例1、特异引物对的设计

根据对抗病番茄种质资源和感病番茄种质资源进行大量的攻毒试验、分子鉴定以 及序列比对，设计一对用于鉴定抗病番茄和感病番茄的特异引物对如下(引物对的靶 序列为Ty3a基因的片段)：

Ty3a-1F(序列表的序列1)：5’-CAATAGTTCTAGAATGGGTAAAA-3’；

Ty3a-1R(序列表的序列2)：5’-GTGTGATATGAGAGGTAGGATT-3’。

实施例2、应用特异引物对鉴定番茄是否携带Ty3a基因

将番茄材料M82和番茄材料Gc171分别进行如下实验：

1、提取叶片的基因组DNA。

2、以步骤1的基因组DNA为模板，用Ty3a-1F和Ty3a-1R组成的引物对进行PCR 扩增，得到PCR扩增产物。

PCR扩增条件：94℃预变性3min，94℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸 30sec，共30个循环，72℃延伸10min。

3、将步骤2的PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，见图1。图1中，DL2000 为分子量标准，空白对照为用水代替基因组DNA作为模板的PCR扩增产物，Gc171为 以番茄材料Gc171的基因组DNA为模板的PCR扩增产物，M82为以番茄材料M82的基 因组DNA为模板的PCR扩增产物。

与番茄材料M82相比，番茄材料Gc171的PCR扩增产物显示一条特异性条带。

4、回收步骤3中的特异性条带并测序，其大小为454bp，如序列表的序列3所示。

以上结果表明：应用实施例1设计的特异引物对，根据PCR扩增产物中是否具有 约454bp的特异性条带，即可判断待测番茄是否携带Ty3a基因，如果具有约454bp 的特异性条带、待测番茄携带Ty3a基因，如果不具有约454bp的特异性条带、待测番 茄不携带Ty3a基因，也就是说实施例1设计的特异引物对的靶序列为与Ty3a基因紧 密连锁的标记序列。

实施例3、应用特异引物对鉴定抗病番茄和感病番茄

将番茄材料M82和番茄材料Gc171分别进行如下实验：

一、接种用番茄黄化曲叶病毒

用番茄黄化曲叶病毒接种20株番茄幼苗，作为实验组；用等体积无菌水代替番茄 黄化曲叶病毒接种20株番茄幼苗，作为对照组。

二、苗期形态观察和发病率统计

接种20天后，观察苗期表型并拍照，出现发病表征的植株即为发病植株，计算发 病率。

实验组中，番茄材料M82的发病率为100％，番茄材料Gc171的发病率为0％。对照 组中，番茄材料M82的发病率为0％，番茄材料Gc171的发病率为0％。实验组中，番茄 材料Gc171的照片见图2A。实验组中，番茄材料M82的照片见图2B。

三、分子鉴定

接种20天后，每组随机取三株植株进行分子鉴定，方法同实施例2。

1％琼脂糖凝胶电泳图见图3。图3中，DL2000为分子量标准，空白对照为用水代 替基因组DNA作为模板的PCR扩增产物，阴性对照为用其它感病番茄的基因组DNA为 模板的PCR扩增产物，阳性对照为用其它抗病番茄的基因组DNA为模板的PCR扩增产 物，三个Gc171分别为以三株番茄材料Gc171的基因组DNA为模板的PCR扩增产物， 三个M82分别为以番茄材料M82的基因组DNA为模板的PCR扩增产物。

对于番茄材料M82，实验组植株的叶片和对照组植株的叶片均未显示约454bp的 特异性条带。对于番茄材料Gc171，实验组植株的叶片和对照组植株的叶片均显示约 454bp的特异性条带(测序结果表明，各个特异性条带大小均为454bp)。

以上结果表明：应用实施例1设计的特异引物对，根据PCR扩增产物中是否具有 约454bp的特异性条带，即可判断待测番茄为番茄黄化曲叶病毒抗病番茄还是番茄黄 化曲叶病毒感病番茄，如果具有约454bp的特异性条带、待测番茄为候选的番茄黄化 曲叶病毒抗病番茄，如果不具有约454bp的特异性条带、待测番茄为候选的番茄黄化 曲叶病毒感病番茄。

四、成株形态观察

接种40天后，观察成株表型并拍照，见图4。番茄材料Gc171的生长状态正常。 与番茄材料Gc171相比，番茄材料M82的坐果少，果实硬小，不能正常转色。

实施例4、应用特异引物对鉴定杂交种种子纯度

由于番茄黄化曲叶病毒对番茄生产造成灾难性的损失，推广应用抗病毒品种是防 控病害发生、确保番茄安全生产的根本途径。抗病毒品种的真实性和种子纯度是种业 的生命线，如何快速准确鉴定种子的纯度是种业运营和番茄安全生产的基本需求。

苏粉13号是江苏省农业科学院培育的番茄黄化曲叶病毒抗病品种(携带番茄抗黄 化曲叶病毒基因Ty3a)。为了尽早满足种子经销商的需求，利用Ty3a-1F和Ty3a-1R 组成的引物对对随机抽样的200粒苏粉13号种子进行分子检测(方法同实施例2)。

部分样本的电泳结果见图5。图5中，DL2000为分子量标准，阳性对照为苏粉13 号的抗病亲本；阴性对照为苏粉13号的感病亲本，其余泳道为部分待测样本。200份 番茄样本中，196份的PCR扩增产物中具有约454bp的特异性条(测序结果表明，各 个特异性条带大小均为454bp)，占总样本数的98％，4份的PCR扩增产物中不具有约 454bp的特异性条带。这说明该品种种子纯度为98％，符合种子质量标准，可以投放生 产。

实施例5、应用特异引物对鉴定杂交后代中的抗病番茄和感病番茄

1、将1株番茄材料M82和1株番茄材料Gc171进行杂交，收获F1代种子。

2、将F1代种子培育为植株，即为F1代植株。

3、将F1代植株进行自交，收获F2代种子。

4、将F2代种子培育为植株，即为F2代植株。

5、将168株F2代植株幼苗接种番茄黄化曲叶病毒。

6、步骤5中接种20天后，观察苗期表型并拍照，出现发病表征的植株即为发病 植株，168株植株中有52株为发病植株，其余为抗病植株。

7、步骤5中接种20天后，取植株叶片进行分子鉴定，方法同实施例2，步骤6 鉴定为抗病植株的PCR扩增产物中具有约454bp的特异性条(测序结果表明，各个特 异性条带大小均为454bp)，而步骤6鉴定为感病植株的PCR扩增产物中均不具有约 454bp的特异性条。

实施例6、应用特异引物对鉴定品种真实性

针对目前种子市场上假冒伪劣种子的现象，利用实施例1设计的特异引物对，可 以快速方便地检测种子的真实性。

对种植在山东省寿光市蔬菜博览会展示园的番茄品种罗曼娜2号和寿光市稻田镇 田家村的罗曼娜2号的番茄黄化曲叶病毒发生情况分别进行现场调查，发现展示园的 罗曼纳2号没有出现典型的番茄黄化曲叶病毒症状，而田家村的罗曼纳2号部分植株 出现典型的番茄黄化曲叶病毒症状(发病率31％)。

分别对这两个地点的罗曼娜2号品种进行了抽样，利用Ty3a-1F和Ty3a-1R组成 的引物对进行分子检测(方法同实施例2)。

部分样本的结果见图6。图6中，DL2000为分子量标准，空白对照为水，阴性对 照为番茄材料M82，阳性对照为番茄材料Gc171。结果表明，展示园的样本的PCR扩增 产物中均具有约454bp的特异性条(测序结果表明，各个特异性条带大小均为454bp)， 而田家村的样本的PCR扩增产物中均不具有约454bp的特异性条。这说明田家村的罗 曼娜2号与展示园的罗曼娜2号不是同一番茄品种，田家村的罗曼娜2号为假冒伪劣 种子。

实施例7、特异性引物对在抗病毒品种培育上的应用

利用实施例1设计的特异引物对，可以快速方便地确定育种者所搜集和转育的育 种材料中是否含有Ty3a基因，是否为番茄黄化曲叶病毒抗病品种，提高抗病毒品种的 选育的准确性，加快育种进程，提升育种水平。

随机采集番茄种质资源488份，利用Ty3a-1F和Ty3a-1R组成的引物对进行分子 检测(方法同实施例2)。部分结果见图7。图7中，DL2000为分子量标准，阴性对照 为番茄材料M82，阳性对照为番茄材料Gc171。488份番茄种质资源中的8份具有约 454bp的特异性条带(测序结果表明，各个特异性条带大小均为454bp)。

将以上8份种质资源通接种病毒并观察表型(方法同实施例3)，该8份种质资源 确实为抗病品种，这为培育抗病毒品种奠定了物质基础。