HIV感染疾病进展分子标志物miR-99a

摘要

本发明提供了一种HIV感染疾病进展分子标志物miR-99a，及其在制备HIV感染疾病进展诊断试剂中的用途。HIV感染快速进展者miR-99a在外周血单个核细胞中的含量比典型进展者及正常对照外周血单个核细胞中的含量低，能够预测感染一年后疾病进展程度。本发明还提供了一种诊断HIV感染疾病进展的诊断试剂盒。使用本发明的HIV感染疾病进展分子标志物miR-99a诊断疾病进展具有操作简单，安全无创伤，高特异性，高灵敏性以及易于大量筛查的特点。

说明书

技术领域

本发明涉及HIV感染预后诊断领域，具体来说涉及一种HIV感染疾病进展分子标 志物miR-99a，其可应用于在HIV感染早期进行预后评估，以给患者及时有效地随访、 治疗等干预措施，以延长生存时间，提高生存质量。

背景技术

microRNA（miRNA）是近年来的研究热点，它是一种广泛存在于真核生物中的单 链小分子RNA，不具编码功能，但它能够结合于基因序列的侧翼区域阻遏或抑制靶 mRNA的翻译，具有高度的保守性、时序性和组织特异性，目前在肿瘤、血液病、病毒 感染等多种疾病的临床诊断、治疗及预后评价等领域发挥了重要作用。

艾滋病是一个世界性的重大传染病，严重威胁人们的健康和影响经济社会的发展。 HIV感染后，疾病进展速度不同，一般经8-10年进入艾滋病期，称为“典型进展者”。 但10%的感染者，在感染三年甚至一年内CD4+T细胞显著下降至350个/微升以下，称 为“快速进展者”。如快速进展者诊断后不能定期随访及尽早治疗，则发病率及死亡率 将持续上升，且增加传播风险。目前，我国经性途径HIV感染者不断增加，男男性接触 中快速进展者比例较高，如果在HIV感染早期能对预后进行有效预测，区分快速进展者 及典型进展者，个体化合理安排病人的随访及治疗，不仅可以提高HIV感染者的生存时 间及生存质量，对国家的艾滋病防治工作亦具有重要意义。

目前，HIV感染疾病进展及预后评价的方式主要有以下几种：CD4+T细胞数量、病 毒载量、免疫活化等其他指标。CD4+T细胞数量是HIV感染的靶细胞，可有效反映机 体免疫状态，但其检测需要流式细胞仪，仪器及相应试剂价格昂贵，技术要求高，不适 合普遍开展，且快速进展者及典型进展者在HIV感染早期，CD4+T细胞数量差异不够 显著，不易对未来的疾病进展进行有效预测；病毒载量在HIV感染早期波动较大，且并 不与临床免疫状态完全平行；免疫活化等指标虽有报道可预测疾病预后，但对设备要求 高，需要专业人员的分析，标本最好选用新鲜标本，储存运输不便，难以推广。

近年来的研究表明，HIV感染和miRNA密切相关，miRNA可以通过作用于病毒本 身或作用于免疫系统从而影响疾病进展，因此对HIV感染疾病进展的诊断也可能有相应 的作用。与HIV感染相关的miRNA种类较多且作用不一，已有研究表明在HIV感染后 miRNA普遍下调，miR-17/92基因簇可抑制HIV感染等。虽然已在该领域进行了一些研 究，但是HIV感染早期疾病快速进展者的miRNA表达变化目前还没有研究，在临床和 研究中，需寻找可有效预测疾病预后的miRNA标志物。

发明内容

本发明提供了一种新的HIV感染疾病进展相关的miRNA作为疾病进展的分子标志 物，该miRNA为miR-99a，其序列为5’-AACCCGUAGAUCCGAUCUUGUG-3’（SEQ ID  NO：1）。

发明人发现，miR-99a在HIV感染早期（120天）快速进展者外周血单个核细胞中 的含量相比典型进展者明显降低，可以预测感染一年后疾病进展情况，由此可见，降低 的miR-99a与HIV感染疾病进展及预后密切相关。

在上述发现的基础上，本发明提供了miR-99a在制备诊断HIV感染疾病进展的诊断 试剂中的用途。

具体地，所述诊断试剂通过检测被试者外周血单个核细胞中miR-99a的含量，并与 HIV感染典型进展者平均水平相比较来诊断HIV感染疾病进展，其中，miR-99a在HIV 感染快速进展者外周血单个核细胞中的含量相对于典型进展者显著下降。在一个特定的 实施方案中，使用定量PCR的方法来检测被试者外周血单个核细胞中miR-99a含量。

本发明还提供了一种诊断HIV感染疾病进展的诊断试剂盒，其包括：

（1）外周血单个核细胞总RNA提取试剂，

（2）RNA加polyA试剂，

（3）RT-PCR试剂，

（4）定量PCR试剂。

其中，定量PCR试剂中包括HIV感染疾病进展分子标志物miR-99a的特异性正向 引物，优选地，其序列为5’-CCCGTAGATCCGATCCGA-3’（SEQ ID NO：7）。

在一个特定的实施方案中，所述外周血单个核细胞总RNA提取试剂中包括序列为 5’-CAACCTCCTAGAAAGA-3’（SEQ ID NO：2）的External Control-1；所述RNA加polyA 试剂中包括序列为5’-TGAGCAACGCGAACAA-3’（SEQ ID NO：3）的External Control-2； 所述RT-PCR试剂中包括序列为 5’-CAGTGGTATCAACGCACTCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3’（SEQ  ID NO：4）的RT-Primer（其中，V为A或C或G，N为A或T或C或G）；所述定量 PCR试剂中包括序列分别为5’-CTCACACGACTCACGACAC-3’（SEQ ID NO：5）和 5’-CTCACACGACTCACGACACCAGTGGTATCAACGCACTC-3’（SEQ ID NO：6）的通 用反向引物UPM-short和UPM-long。

使用本发明的HIV感染疾病进展分子标志物miR-99a诊断HIV感染疾病进展具有 操作简单，安全无创伤，高特异性，高灵敏性以及易于大量筛查的特点。

具体实施方式

1.外周血单个核细胞中总RNA的提取

抽取11名HIV感染快速进展者感染120天5ml血液，同时抽取6名HIV感染疾病 典型进展者及4名正常人对照血液各5ml作为对照，密度梯度离心法收集外周血单个核 细胞，用PBS1ml重悬细胞，置于1.5ml的RNase/DNase-free离心管中。

使用RNA提取试剂盒（北京旷博生物技术有限公司）自外周血单个核细胞中提取 总RNA，每250μl外周血单个核细胞中加入1μl（20nM）序列为 5’-CAACCTCCTAGAAAGA-3’（SEQ ID NO：2）的External Control-1（上海生工生物 工程技术有限公司合成）来监控外周血单个核细胞中RNA的提取质量。提取的总RNA 使用Thermo NanoDrop2000c测定浓度。

2.三步法定量检测外周血单个核细胞中的miRNA

（1）加polyA尾：

i.在无RNA酶的PCR管（Axygen公司，200μl）中配制加polyA尾的反应液，体 系为20μl。每20μl体系中加入1μl（20nM）序列为5’-TGAGCAACGCGAACAA-3’（SEQ  ID NO：3）的External Control-2（上海生工生物工程技术有限公司合成）来监控miRNA 的加尾及反转录质量。

（注：加入的RNA体积由RNA的浓度确定，x=500ng/RNA浓度，本实验所使用的酶均 为北京旷博生物技术有限公司的产品。）

ii将装有配置好反应液的PCR管放入PCR仪（Thermo）中37℃孵育1小时。

（2）RT-PCR得到cDNA单链：

i.向（1）得到的反应液中加入0.5μl（0.5ng/μl）序列为 5’-CAGTGGTATCAACGCACTCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3’ （SEQ ID NO：4）的RT-Primer（上海生工生物工程技术有限公司合成），70℃孵育5min， 立即放到冰上冰浴至少2min。

ii配制反转录反应液：

（注：所用产品均为北京旷博生物技术有限公司的产品。）

iii.将i与ii得到的溶液混合，50℃孵育50min后70℃保温15min，置冰上冷却，得 到cDNA。

iv.将iii得到的产物稀释至1μl体系中含有1ng总RNA的反转录产物，分装后-20 ℃保存。

（3）qPCR定量检测：

i.在2ml EP管（Axygen公司）中配制反应液：

（注：UPM-long、UPM-short均在Invitrogen公司合成，其余试剂均来自北京旷博生物 技术有限公司的Green PCR Master Mix。）

其中，通用反向引物UPM-short和UPM-long的序列分别为 5’-CTCACACGACTCACGACAC-3’（SEQ ID NO：5）和 5’-CTCACACGACTCACGACACCAGTGGTATCAACGCACTC-3’（SEQ ID NO：6）。

ii配置好的反应液充分颠倒混匀后，分装入96孔尖底PCR板中（Axygen公司）， 每孔18μl。

iii.使用排枪（Eppendoff公司，1-10μl）加入序列为5’-CCCGTAGATCCGATCCGA -3’（SEQ ID NO：7）的miR-99a特异性正向引物（Invitrogen公司合成），每孔2μl（10μM）。

iv.加入10μl石蜡油液封后用专用贴膜（ABI公司）密封。

v.放入ABI7900PCR定量检测仪中，程序设定为：

vi.绘制熔解曲线，检查引物的特异性，程序设定为：95℃15s,60℃15s,95℃15s。

3.采用RealTime StatMiner software进行数据分析

用上述方法可测得HIV感染快速进展者感染120天、典型进展者及正常对照各样本 外周血单个核细胞中miR-99a的平均Ct值分别为9.54、8.11和7.99，结果表明miR-99a 在快速进展者外周血单个核细胞中的相对含量显著下降。单因素Cox风险回归分析显示， miR-99a可以在HIV感染早期预测感染一年后的疾病进展。

<110>  中国医科大学附属第一医院 北京旷博生物技术有限公司

 

<120>  HIV感染疾病进展分子标志物miR-99a

 

<160>  7    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  22

<212>  RNA

<213>  智人（Homo sapiens）

 

<400>  1

aacccguaga uccgaucuug ug                                            22

 

 

<210>  2

<211>  16

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

caacctccta gaaaga                                                    16

 

 

<210>  3

<211>  16

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

tgagcaacgc gaacaa                                                    16

 

 

<210>  4

<211>  52

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  4

cagtggtatc aacgcactcc tttttttttt tttttttttt tttttttttt vn                             52

 

 

<210>  5

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  5

ctcacacgac tcacgacac                                                  19

 

 

<210>  6

<211>  38

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  6

ctcacacgac tcacgacacc agtggtatca acgcactc                                 38

 

 

<210>  7

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  7

cccgtagatc cgatccga                                                   18