抑制PPFIA1基因表达的siRNA及其应用

摘要

本发明公开了一种抑制PPFIA1基因表达的siRNA及其应用，所述的siRNA的正义链序列为：5'-CCACAAAGCUCUGGAUGAA-3'，反义链序列为：5'-UUCAUCCAGAGCUUUGUGG-3′，在该siRNA序列的3'段垂悬有dTdT。本发明抑制PPFIA1基因表达的siRNA能有效沉默PPFIA1基因，为研究PPFIA1基因的功能提供了新的技术方案，PPFIA1基因被沉默后可抑制白血病细胞生长，促进其凋亡；该siRNA可用于制备抗白血病药物。

说明书

技术领域

本发明涉及一种siRNA，特别涉及一种抑制PPFIA1基因表达的siRNA及 其应用。

背景技术

慢性粒细胞性白血病（Chronic Myelogenous leukemia,CML）是一种以粒系 增生为主的造血干细胞恶性增殖性疾病，其特征性的细胞遗传学标志是Ph染色 体t(9；22)(q34；q11)。P210BCR-ABL融合蛋白是Ph染色体的产物，具有强酪氨 酸激酶活性，与CML的发生有着密切的关系，它的产生可导致其下游一系列信 号蛋白的持续性磷酸化，由此引起造血干细胞发生恶性增殖、抗凋亡、黏附功 能缺陷等病理生理变化。流行病学调查显示，在我国白血病中，CML的发病率 为1/10⁵，仅次于急粒和急淋而居第三位，近年来表现出明显的增加趋势。目前， CML的治疗有以下几种方法：1）化疗药物，如马利兰、羟基脲、干扰素等，由 于缺乏肿瘤特异性，常造成较大的毒副作用；2）造血干细胞移植（HSCT）， 这是现今唯一能治愈CML的方法，但是受供者、年龄、病程、经济条件、移植 相关病等多种因素的限制，仅有少数患者可以接受；3）甲磺酸伊马替尼（Imatinib  mesylate），是第一个成功的特异性抑制酪氨酸激酶的分子靶向药物，在治疗CML 上取得了可喜的成就，但其价格昂贵，而且因为耐药性的问题往往导致治疗失 败；4）反义技术（反义RNA或DNA）、RNA干扰（RNA interference，RNAi）， 还未获得肯定疗效（吴国林.医学综述,2006,12(21):1329-1332.）。近20年来， CML的治疗方法有了较大的进展，寻找肿瘤恶性转化的关键“靶标”，以此为 基础开发靶向药物与现代化疗药物联合应用日益表现出巨大的治疗潜力，有待 于我们进行不断地探索与研究。

PPFIA1基因定位于人类基因组11p13.3，其编码的蛋白质含有1202个氨基 酸，分子量为126kDa，属于白细胞共同抗原相关蛋白（leukocyte common  antigen-related protein，LAR）-蛋白酪氨酸磷酸酶（protein-tyrosine phosphatase， PTPase）相互作用蛋白家族（Liprin family）。该蛋白N端含有螺旋卷曲结构，C 端具有3个SAM（streyl alpha motif）结构域，SAM结构域中含有LH（liprin  homology）结构。已有研究发现，SAM结构域可以与多种蛋白、RNA、脂膜相 互作用（Feng Qiao,James U.Bowie.Science's STKE:signal transduction knowledge  environment,2005,286,re7.）。Serra-Pagès C等的研究发现，PPFIA1可以结合到白 细胞共同抗原相关的蛋白酪氨酸磷酸酶（leukocyte common antigen-related  protein-tyrosine phosphatase，LAR PTPase）的D2结构域（Serra-Pagès C,Kedersha  NL,et al.The EMBO Journal,1995,14(12):2827-2838.）。除了LAR PTPase，PTPase 家族中的与其结构类似的PTPδ、PTPσ都可以与PPFIA1相互作用（Pulido R, Serra-Pagès C,et al.Proc Natl Ncad Sci USA,1995,92(25):11686-11690.）。另外， 已有研究表明PPFIA1在多种肿瘤中高表达，与肿瘤的发生发展密切相关。 Jarvinen的研究小组通过DNA-RNA高密度芯片联合分析发现，在喉癌细胞系中， PPFIA1可能是11q13扩增区的靶基因，同时发现11q13扩增区基因的高水平扩增 对PPFIA1RNA的表达影响较大（Jarvien AK,Autio R,Haapa-Paananen S et al. Oncogene,2006,25(52):6997-7008.）。Tan等对头颈鳞癌标本做了类似的 DNA-RNA分析也发现到PPFIA1的表达显著上调（Tan KD,Zhu Y,Tan HK et al. Genes Chromosomes Cancer,2008,47(4):353-362.）。V Astro等发现PPFIA1在乳腺 癌中存在高水平表达，通过功能研究发现该基因是MDA-MB-231细胞侵袭和迁 徙过程的关键分子（AstroV,Asperti C,Cangi G et al.Oncogene,2011,30(15): 1841-1849.）。利用微速摄影技术研究发现该基因可以影响细胞的迁徙和伪足数 目，但并不会影响伪足覆盖的面积。降低和升高该基因的表达，可以抑制和增 强细胞对胞外基质的水解能力。Spangler S A等的研究表明PPFIA1可以与突触小 泡锚定和释放过程中的一种功能蛋白结合，对神经元突触结构的组装及稳定性 有着一定的影响（Spangler S.A,Hoogenraad C.C.BIOCHEMICAL SOCIETY  TRANSACTIONS,2007,35(5):1278-1282.）。但是，在慢性粒细胞性白血病中， 目前还未见有关PPFIA1基因的研究报道。

RNAi是近几年发展起来的一种新型基因阻断技术，其主要功能成分为 siRNA，siRNA具有高度的序列专一性，可特异性抑制靶目标mRNA的表达，使 目的基因沉默。利用此技术，将细胞表型的改变与基因表达和功能的变化联系 起来，不仅有助于了解肿瘤发生、发展过程，而且有助于辨认和确定肿瘤基因 治疗的靶点。目前，RNA干扰已广泛应用于肿瘤研究工作中，并取得了一些突 破性进展，成为CML基因治疗研究的重要方向。

发明内容

本发明的首要目的在于提供一种抑制PPFIA1基因表达的siRNA。

本发明的另一目的在于提供上述抑制PPFIA1基因表达的siRNA的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种抑制PPFIA1基因表达的siRNA，其序列为：

正义链：5'-CCACAAAGCUCUGGAUGAA-3'，

反义链：5'-UUCAUCCAGAGCUUUGUGG-3'；

优选为，所述的抑制PPFIA1基因表达的siRNA序列（包括正义链和反义链） 的3'端垂悬有dTdT，dTdT结构有利于保护RNA免受酶解；

上述抑制PPFIA1基因表达的siRNA的应用：抑制PPFIA1基因表达的siRNA 可用于研究PPFIA1基因的功能，特别是用于进行PPFIA1基因与白血病细胞生长 的相关性研究；抑制PPFIA1基因表达的siRNA可用于制备抗白血病药物。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

（1）本发明提供的抑制PPFIA1基因表达的siRNA能有效沉默PPFIA1基 因，为研究PPFIA1基因的功能提供了新的技术方案。

（2）本发明通过抑制PPFIA1基因表达的siRNA研究PPFIA1基因在白血 病细胞中的功能，发现下调PPFIA1的表达可抑制白血病细胞生长，促进其凋亡。

（3）本发明提供的抑制PPFIA1基因表达的siRNA可用于制备抗白血病药 物，为慢性粒细胞性白血病的治疗做出贡献。

附图说明

图1是Real-time PCR检测K562细胞内PPFIA1mRNA的相对表达水平图， *P<0.05。

图2是Western bloting检测K562细胞内PPFIA1蛋白的表达水平图。

图3是Western bloting检测K562细胞内PPFIA1蛋白的相对表达水平图， *P<0.05。

图4是PPFIA1siRNA抑制F562细胞生长的量效关系图，*P<0.05。

图5是PPFIA1siRNA抑制K562细胞生长的时效关系图，*P<0.05。

图6是Annexin V/PI双染检测PPFIA1siRNA对K562细胞凋亡的影响图， Annexin V/PI双染检测结果。

图7是Annexin V/PI双染检测PPFIA1siRNA对K562细胞凋亡的影响图， 各组早期凋亡细胞比例比较，*P<0.05。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式 不限于此。

使用的材料：

白血病K562细胞购自中国科学院上海细胞所；新生牛血清购自杭州四季青 生物工程科技有限公司；1640培养基购自GIBCO公司；Lipofectamine^TM2000购 自Invitrogen公司；MTT及二甲基亚砜（DMSO）购自Sigma公司；Trizol试剂、 RNA酶抑制剂、Oligo d(T)15、蛋白质上样缓冲液购自天根生化科技（北京）有 限公司，M-MLV逆转录酶购自Promega公司，Taq DNA Polymerase、dNTP购 自Takara公司，SYBR GreenⅠ核酸染料购自厦门百维信生物科技有限公司；RIPA 细胞裂解液购自上海申能博彩生物科技有限公司，Bradford蛋白浓度测定试剂盒 购碧云天生物技术研究所；β-actin一抗购自武汉博士德生物工程公司，β–actin 二抗购自北京博奥森生物技术公司，PPFIA1一抗购自abcam公司，PPFIA1二抗 购自北京聚研生物技术有限公司。

统计学处理：

SPSS13.0统计软件处理数据，数据以均数±标准差表示，采用完全随 机设计的单因素方差分析法（one-way ANOVA）分析各组数据间差异的显著性。 以P<0.05为有显著性差异。

实施例1

（一）PPFIA1siRNA的设计与合成：

根据GenBank基因库中PPFIA1已知序列（Gene ID：8500，NM_003626.2， NM_177423.1），按照siRNA设计原则，结合Ambion公司提供的在线设计工具 siCatch^TM siRNA Design针对编码区siRNA靶点位置设计；

PPFIA1siRNA的序列为：

正义链：5'-CCACAAAGCUCUGGAUGAA-3'，

反义链：5'-UUCAUCCAGAGCUUUGUGG-3'；

在PFIA1siRNA的序列的3'端垂悬有dTdT，由广州锐博生物技术公司合成。

以随机序列的RNA双链（scramble，SCR）作随机对照，随机序列的RNA 双链购自上海吉玛制药技术有限公司，其目录号为：A06001。

（二）白血病K562细胞的培养

将白血病K562细胞接种于含体积分数10%的新生牛血清、无抗生素的1640 培养基中，置于37℃、体积分数为5%的CO₂培养箱，饱和湿度下培养；每2～ 3天换液传代；实验选用对数生长期、0.2%台盼蓝拒染率>95%的细胞。

（三）Real-time PCR检测K562细胞内PPFIA1mRNA的相对表达水平

（1）实验分PPFIA1siRNA组、随机对照组（SCR）和空白对照组（Control）， 各组细胞以1.5×10⁵/mL的密度接种于24孔板，每孔400μL；

（2）使用Invitrogen公司Lipofectamine^TM2000转染PPFIA1siRNA和随机 对照（转染方法参照Lipofectamine^TM2000说明书），PPFIA1siRNA组和随机对 照组的核酸转染终浓度为100nmol/L，空白对照组加入与药物等体积（100μL） 的无血清Opti-MEM，转染终体积500μL；

（3）转染后的K562细胞培养6h后加入500μL含体积分数20%的新生牛血 清的1640培养基继续培养；

（4）继续培养细胞48h后，使用Trizol试剂提取各组细胞总RNA（提取细 胞总RNA的方法参照天根生化科技有限公司的Trizol试剂说明书），提取的总 RNA用紫外分光光度仪（UVPupland，USA）测A₂₆₀/A₂₈₀进行RNA纯度及浓度 计算；

（5）利用SYBR GreenⅠReal-time PCR以GAPDH为内参检测K562细胞内 PPFIA1 mRNA的表达水平：将步骤2）提取的总RNA进行逆转录和Real-time PCR，逆转录条件：37℃持续1h，95℃持续5min；Real-time PCR条件：①94℃ 持续5min，②94℃持续30s，③PPFIA160℃、GAPDH57.5℃持续30s，④72℃ 持续30s，⑤读板，⑥步骤②～⑤循环39次，⑦融解曲线分析，从60℃到95℃， 每0.3℃读一次板，停留1秒；PPFIA1mRNA的相对表达水平用△C_T和2^-△△CT计算；其中PCR所用引物自行设计，由上海生物工程技术有限公司合成，PPFIA1 上游引物：5'-GCTTCAGTTAACCTTTTTCATGTATATCCA-3'，下游引物： 5'-TCGACAGTTAACATAAACGTAAAATCCTT-3'；GAPDH上游引物： 5'-CAACGGATTTGGTCGTATT-3′，下游引物：5'-CACAGTCTTCTGGGTGGC-3′。

Real-time PCR检测结果如表1和图1所示：终浓度100nmol/L的PPFIA1 siRNA作用于K562细胞后48小时后，PPFIA1mRNA的表达水平显著降低，与 随机对照组和空白对照组相比有显著差异（*P<0.05），表明PPFIA1siRNA能有效 抑制PPFIA1mRNA的表达。

表1.Real-time PCR检测K562细胞中PPFIA1 mRNA表达水平结果统计（n=3）

注：*¹为同一样本重复实验的Ct值的标准偏差

*²计算公式为$S=\sqrt{S_1^2+S_2^2},$如$\sqrt{{0.16}^2+{0.16}^2}=0.16$

*³计算公式为2^-△△Ct+s和2^-△△Ct-s，S为△△Ct的标准偏差，如2^{-(-0.01+0.03)}=0.90

（四）Western bloting检测K562细胞内PPFIA1蛋白的相对表达水平

（1）实验分组及转染处理同（三）（1）、（2）和（3）；

（2）细胞培养48h后收集细胞，按照细胞裂解液（RIPA）说明书提取细胞 蛋白，并按照Bradford蛋白浓度测定试剂盒说明书测定所提取蛋白的浓度，取含 50μg蛋白的溶液，加入蛋白上样缓冲液，置于沸水加热5min；

（3）将处理好的蛋白质样本进行不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳（5%聚丙烯酰 胺浓缩胶和10%聚丙烯酰胺分离胶）：80V电泳约30min至蛋白进入分离胶，再 120V电泳约1h；

（4）将凝胶上的蛋白条带通过半干式转膜转到PVDF膜上，转膜条件12V、 40min；将膜用质量百分比5%的脱脂奶粉封闭缓冲液37℃封闭60min；TBST 洗膜3次，每次5min；一抗4℃过夜孵育；TBST洗膜3次，每次5min；二抗 37℃摇床孵育60min；TBST洗涤三次，每次5min；ECL化学发光，成像系统 拍照；用Image J图像分析软件分析PPFIA1和β-actin的灰度，以β-actin作为内 参照计算PPFIA1蛋白的相对表达水平；其中，10×TBS缓冲液：1mol/L Tris· HCl（pH7.5）10mL、NaCl8.8g加蒸馏水至1000mL，TBST缓冲液：20％ Tween201.65mL、TBS700mL，混匀后即可使用，最好现用现配。

PPFIA1siRNA转染K562细胞48h后，Western bloting检测结果如图2和图 3所示，PPFIA1siRNA组PPFIA1蛋白的表达明显下调，与随机对照组相比其 PPFIA1的蛋白表达量显著降低（*P<0.05），表明PPFIA1siRNA能有效抑制 PPFIA1蛋白的表达。

（五）MTT法测不同浓度PPFIA1siRNA对K562细胞增殖抑制率

（1）实验分PPFIA1siRNA组、随机对照组和空白对照组，每组设5个复孔；

（2）各组细胞以1×10⁵/mL的密度接种于96孔板，每孔50μL，转染终体积 100μL（转染处理方法参照Lipofectamine^TM2000说明书），PPFIA1siRNA组和随 机对照组的核酸转染终浓度分别为50、75、100、125nmol/L；

（3）转染6h后，加入100μL含体积分数20%的新生牛血清的1640培养基， 使终体积200μL，继续培养；

（4）48小时后每孔加入5mg/mL的MTT液20μL，于培养箱中培养4小时 后，37℃、1000rpm离心10min，弃上清，每孔加入150μL二甲基亚砜；

（5）震荡使结晶充分溶解，在多功能酶标仪上测定吸光度A_570nm，以A_630nm作为参照，可间接反映细胞存活率；实验重复三次，计算增殖抑制率，增殖抑制 率=[1-（A_实验组/A_对照组）]×100%。

结果如图4所示：从转染终浓度50nmol/L的PPFIA1siRNA开始，就表现 出抑制K562细胞生长的活性，随着浓度的增加，抑制效应逐渐增强，与随机对 照组相比有显著差异(*P<0.05)；终浓度为100nmol/L的PPFIA1siRNA作用效果 最佳，当浓度增大到125nmol/L时表现出了非特异性抑制。

（六）台盼蓝拒染法检测不同时间段PPFIA1siRNA对K562细胞生长状况

实验分组及转染处理同（三）（1）、（2）和（3），K562细胞继续培养，于24、 48、72小时将每组细胞充分混匀后用台盼蓝拒染法计数每组活细胞数，重复3次， 取均值。

结果如图5所示：终浓度100nmol/L的PPFIA1siRNA转染K562细胞后48 小时开始表现出生长抑制效应，可持续至72小时，与随机对照组和空白对照组 相比有显著差异（*P<0.05），表明PPFIA1siRNA可以抑制K562细胞生长。

（七）Annexin V/PI双染检测PPFIA1siRNA对K562细胞凋亡的影响

（1）实验分PPFIA1siRNA组、随机对照组和空白对照组，每组设3个复孔；

（2）各组细胞以3×10⁵/mL的密度、每孔1.5mL接种于6孔板，转染体积 500μL（转染处理方法参照Lipofectamine^TM2000说明书），PPFIA1siRNA组和随 机对照组的核酸转染终浓度为100nmol/L；

（3）转染6h后，加入2mL含体积分数20%的新生牛血清的1640培养基， 终体积为4mL，继续培养；

（4）48小时后，4℃、800rpm离心5min收集各组细胞，用预冷pH7.2 的PBS（PBS配方：Na₂HPO₄·2H₂O1.56g、KH₂PO₄2.00g、KCl0.20g、NaCl8.00 g，加双蒸水溶解并定容至1000mL，过滤除菌或高压蒸汽灭菌30分钟，4°C保 存。）洗涤细胞3次，再用1mL结合缓冲液洗涤细胞1次，4℃、800rpm离心去 上清；其中，10×结合缓冲液：0.1mol/L Hepes/NaOH，pH7.4，1.4mol/L NaCl， 25mmol/LCaCl₂，使用前用去离子水稀释至1×工作液；

（5）加入200μL结合缓冲液，轻轻吹打重悬细胞，分别加入10μLLAnnexin V以及5μL PI，轻轻混匀，避光反应30min，上机检测；Annexin V(+)、PI(-)的 细胞群为早期凋亡细胞。

结果如图6和图7所示：终浓度为100nmol/L的PPFIA1 siRNA转染K562 细胞48h后均出现早期凋亡细胞群，早期凋亡率为13.26%，与随机对照组相比， 具有统计学意义（*P<0.05），表明PPFIA1siRNA可以促进K562细胞凋亡。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施 例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替 代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。