法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2017-11-03
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):A61L15/38 授权公告日:20140702 终止日期:20160911 申请日:20120911
专利权的终止
2014-07-02
授权
授权
2013-02-06
实质审查的生效 IPC(主分类):A61L15/38 申请日:20120911
实质审查的生效
2012-12-19
公开
公开
技术领域
本发明属于生物医用材料、高分子化学和生物化学领域,特别是涉及一种采用双生物酶修饰的明胶与壳聚糖共混生物材料及其制备方法与应用。
背景技术
明胶作为自然界来源丰富的蛋白质类的天然高分子和生物大分子材料,它具有良好的生物相容性、无毒、可生物降解,可被人体吸收以及价格低廉等优点在生物医用材料领域得到广泛的应用,尤其明胶的氨基酸组成和比例与人体皮肤接近,因此在生物敷料,伤口愈合剂和人工皮肤等皮肤组织工程方面具有很好的应用前景[功能材料, 2004, 35: 2310-2313],然而明胶膜脆性大、易破碎,易滋生感染细菌等缺点限制了其应用。因此,改善明胶的机械性能和抗菌性能以扩展其在生物医学领域的应用具有十分重要的意义。壳聚糖是甲壳素的N-脱乙酰化产物,也是一种自然界中来源丰富的生物多糖类的天然高分子和生物大分子材料,具有很好的成膜性、生物相容性、可降解性,来源广泛性并具有独特的广谱抗菌性能[International Journal of Food Microbiology, 2000, 62(1-2): 139-148]。因此,将明胶和壳聚糖共混可以形成材料各组分之间的优势互补,不仅有利于提高明胶基材料的机械性能,特别是有利于改善明胶基材料易滋生和感染细菌的缺点。
明胶和壳聚糖共混材料的制备过程中,往往需要进行交联来提高共混材料的机械性能和稳定性[Food Chemistry, 2007, 103: 295–300]。然而,传统的化学交联虽然可以有效改善材料的机械性能和稳定性,但是由于常用的化学交联剂例如醛类(甲醛,戊二醛和甘油醛),环氧化合物组分和碳化二亚胺等往往具有细胞毒性,这将会导致化学交联方法制备的生物材料在植入体内以后,影响受体正常组织的生长。鉴于上述原因,在材料的制备过程中使用天然的和无毒性的修饰剂,对于制备生物相容性良好的生物材料具有十分重要的意义。酶作为生物催化剂,具有一系列的优点:酶是一种生物催化剂,没有副反应,不会产生毒性问题;反应条件温和,反应步骤简单;催化效率高,专一性强,而被广泛应用于食品、医疗检验、生物制造等行业。因此,是否能够找到合适的酶对明胶和壳聚糖共混材料进行修饰成为本领域的研究热点。
发明内容
本发明要解决的技术问题是:提供一种采用双生物酶修饰的明胶与壳聚糖共混生物材料及其制备方法与应用,明胶与壳聚糖共混材料经过双生物酶修饰后,材料的稳定性和力学机械性能提高,并且该材料具有良好的抗菌活性。
本发明为解决上述技术问题所采取的技术方案为:
一种采用双生物酶修饰的明胶与壳聚糖共混生物材料,其特征在于,所述双生物酶分别为微生物转谷氨酰胺酶和酪氨酸酶。
采用双生物酶修饰的明胶与壳聚糖共混生物材料的制备方法,其特征在于,它包括如下具体步骤:
1)溶液的配制:
按明胶:去离子水=2~6g:50~100mL,选取明胶和去离子水,备用;将明胶加入到去离子水中,在40~60℃的水浴中搅拌1~2小时至明胶充分溶解后得到明胶溶液;
按壳聚糖:1%(体积百分比)乙酸溶液=1~2g:50~100mL,选取壳聚糖和乙酸溶液,备用;将壳聚糖加入到乙酸溶液中,室温下搅拌3~5小时至壳聚糖充分溶解,然后向溶液中滴加0.5~1.0mol/L氢氧化钠溶液,调节溶液的pH为5.0~6.0,得到壳聚糖溶液;
按微生物转谷氨酰胺酶:去离子水=10~20U:5~10mL,选取微生物转谷氨酰胺酶和去离子水,备用;将微生物转谷氨酰胺酶加入到去离子水中,室温下搅拌15~30分钟充分溶解,再过滤得到微生物转谷氨酰胺酶溶液;
按酪氨酸酶:pH为7.0的PBS缓冲溶液=5000~10000U:5~10mL,选取酪氨酸酶和pH为7.0的PBS缓冲溶液,备用;将酪氨酸酶溶于所述pH为7.0的PBS缓冲溶液中,室温下搅拌2~5分钟至酪氨酸酶充分溶解后得到酪氨酸酶溶液;
2)明胶与壳聚糖的共混:
按明胶溶液:壳聚糖溶液 =50~100mL:50~100mL,选取上述配制的明胶溶液和壳聚糖溶液,备用;将明胶溶液和壳聚糖溶液等体积混合,40~60℃下搅拌15~30分钟,使溶液混合均匀,得到明胶与壳聚糖共混溶液;
3)双生物酶修饰的明胶与壳聚糖共混材料的制备:
按明胶与壳聚糖共混溶液:微生物转谷氨酰胺酶:酪氨酸酶=50~100mL:3~8U:3000~7000U,选取上述明胶与壳聚糖共混溶液、微生物转谷氨酰胺酶和酪氨酸酶,备用;向明胶与壳聚糖共混溶液中加入上述微生物转谷氨酰胺酶和酪氨酸酶,在28~30℃下搅拌反应10~20分钟,将反应液倒入培养皿中,在室温下通风干燥48~72小时,得到双生物酶修饰的明胶与壳聚糖共混材料膜片,然后将膜片在0.1~0.5mol/L氢氧化钠溶液中浸泡0.5~1小时,再用去离子水冲洗膜片, 30~40℃下干燥12~24小时,得到所述采用双生物酶修饰的明胶与壳聚糖共混生物材料。
采用双生物酶修饰的明胶与壳聚糖共混生物材料在皮肤敷料、伤口愈合剂,或人工皮肤方面的应用。
本发明的有益效果是:
1)本发明采用双生物酶(微生物转谷氨酰胺酶和酪氨酸酶)对明胶与壳聚糖共混材料进行修饰,不仅具有生物酶修饰方法的优点,并且由于本材料采用两种酶的协同修饰作用,与单独使用一种生物酶作为修饰剂相比还具有如下优点:微生物转谷氨酰胺酶可以使明胶分子中的γ-谷氨酸上的羟酰胺基和赖氨酸上的ε-氨基之间发生结合反应从而形成网状交联,而酪氨酸酶通过将明胶分子中的酪氨酸残基氧化成醌类残基,然后和壳聚糖分子中的氨基反应形成共价连接。因此,通过两种生物酶的协同作用,不仅能够将明胶分子与壳聚糖分子形成稳定的共价连接,同时也形成稳定的网状交联结构,从而大大提高材料的稳定性。此外,这种通过双生物酶的协同修饰作用形成的共价连接和网状交联结构,还能够增强材料的力学机械性能,而材料的稳定性能和力学机械性能提高,就能够大大扩展材料在生物医用材料和生物医学领域的用途和应用范围。并且,由于微生物转谷氨酰胺酶价廉易得,因此采用双生物酶(微生物转谷氨酰胺酶和酪氨酸酶)作为修饰剂可以在提高材料稳定性能和力学性能的同时,还可以有效降低材料的生产成本。
2)本发明所制备的生物材料全部由生物大分子构成,其中共混主体材料采用的是明胶和壳聚糖,修饰剂采用的是生物酶,因此这种全部由生物大分子构成的生物材料具有良好的生物相容性,且无细胞毒性。
3)明胶是自然界来源丰富的蛋白质类生物大分子材料,壳聚糖是自然界来源丰富的多糖类生物大分子材料,均具有良好的生物相容性、无毒、可生物降解、可被人体吸收以及价格低廉等优点,壳聚糖还具有独特的广谱抗菌性能,这种由蛋白质和生物多糖共混制备的材料,可以形成材料各组分之间的优势互补,不仅有利于提高明胶基材料的机械性能,特别是有利于改善明胶基材料易滋生和感染细菌的缺点。
4)酶作为生物修饰剂,避免了采用传统化学修饰剂存在的生物相容性差、毒性大的问题;不需要复杂的仪器设备,反应条件温和,反应步骤简单,并且酶具有高效性和专一性。
5)本发明的制备方法简单,易于控制,无毒副作用,制备条件温和。
6)本发明采用双生物酶修饰的明胶与壳聚糖共混生物材料,在生物医用材料和生物医学领域的用途,特别是在降低感染和炎症反应、抗菌、保护伤口、可生物降解的皮肤敷料和伤口愈合剂,以及人工皮肤等生物医用材料和生物医学领域具有良好的应用前景和十分广泛的用途。
附图说明
图1是未采用生物酶修饰、单独采用一种酶修饰、以及实施例1所得的采用微生物转谷氨酰胺酶和酪氨酸酶修饰的明胶与壳聚糖共混材料的拉伸强度的对比图,其中G/CS代表未采用生物酶修饰的明胶与壳聚糖共混材料,m-G/CS代表微生物转谷氨酰胺酶修饰的明胶与壳聚糖共混材料,t-G/CS代表酪氨酸酶修饰的明胶与壳聚糖共混材料,mt-G/CS代表双生物酶(微生物转谷氨酰胺酶和酪氨酸酶)修饰的明胶与壳聚糖共混材料。
图2是明胶材料,以及实施例1得到的采用双生物酶修饰的明胶与壳聚糖共混材料对大肠杆菌的抑菌效果对比图,其中Control代表未加入样品的空白对照组,G代表未修饰的明胶材料,mt-G/CS代表双生物酶(微生物转谷氨酰胺酶和酪氨酸酶)修饰的明胶与壳聚糖共混材料。
图3是明胶材料,以及实施例1得到的采用双生物酶修饰的明胶与壳聚糖共混材料对金黄色葡萄球菌的抑菌效果对比图,其中Control代表未加入样品的空白对照组,G代表未修饰的明胶材料,mt-G/CS代表双生物酶(微生物转谷氨酰胺酶和酪氨酸酶)修饰的明胶与壳聚糖共混材料。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的描述,当然下述实施例不应理解为对本发明的限制。
本发明提供一种采用双生物酶修饰的明胶与壳聚糖共混生物材料,它完全采用生物大分子材料作为共混材料及修饰剂构成,共混主体材料采用的是明胶和壳聚糖,然后同时采用两种生物酶,即微生物转谷氨酰胺酶和酪氨酸酶作为修饰剂,对明胶和壳聚糖共混生物材料进行修饰后得到。下面结合具体实施例对本发明制备方法作进一步说明,但不限定本发明。
实施例1:
一种采用双生物酶修饰明胶与壳聚糖共混生物材料的制备方法,它包括如下具体步骤:
1)溶液的配制:
称取2g明胶加入到50mL去离子水中,在50℃的水浴中搅拌1小时至明胶完全溶解得到浓度为0.04g/mL的明胶溶液;称取1g壳聚糖加入到50mL 1%(体积百分比v/v%)乙酸溶液中,室温下搅拌3小时至壳聚糖充分溶解,得到浓度为0.02g/mL的壳聚糖溶液,向壳聚糖溶液中缓慢滴加1mol/L氢氧化钠溶液至溶液的pH为5.5;将微生物转谷氨酰胺酶加入到去离子水中室温下搅拌10分钟,再过滤得到2U/mL的微生物转谷氨酰胺酶溶液;将酪氨酸酶加入到PBS(pH7.0)缓冲溶液中,室温下搅拌2分钟,得到1000U/mL的酪氨酸酶溶液。
2)明胶与壳聚糖的共混:
分别量取50 mL上述配制的明胶溶液和壳聚糖溶液等体积混合,50℃下搅拌30分钟,使溶液混合均匀,得到明胶与壳聚糖共混溶液。
3)双生物酶修饰的明胶与壳聚糖共混材料的制备:
向100mL明胶与壳聚糖的共混溶液中加入4U微生物转谷氨酰胺酶和5000U酪氨酸酶,在28℃下搅拌反应15分钟,将反应液倒入培养皿中,在室温下通风干燥72小时,得到双生物酶修饰的明胶与壳聚糖共混材料膜片,然后将膜片在0.1mol/L氢氧化钠溶液中浸泡0.5小时,再用大量去离子水冲洗膜片, 30℃下干燥12小时,得到采用双生物酶修饰的明胶与壳聚糖共混生物材料。
图1是未采用生物酶修饰、单独采用一种酶修饰、以及实施例1所得的采用微生物转谷氨酰胺酶和酪氨酸酶修饰的明胶与壳聚糖共混材料的拉伸强度的对比图。
测试过程为:选取平整、洁净、无缺陷的材料薄膜,将其裁成70mm×1Omm的横条。测量薄膜厚度,每个试样在标距内测量六个点,取其平均值,作为膜的厚度。将试样置于相对湿度约为50%的干燥器中,放置于25℃条件下平衡24小时。然后采用万能试验机(CMT-6503,深圳新三思材料检测有限公司)进行力学性能测定,初始夹距设定为30mm,拉伸速率设定为40mm/min。不同样品的力学性能都平行做6个样, 取6次结果的平均值。从图1中可以看出,未采用生物酶修饰的明胶与壳聚糖共混材料G/CS的拉伸强度为30.75MPa,而单独采用微生物转谷氨酰胺酶酶修饰的明胶与壳聚糖共混材料m-G/CS的拉伸强度为43.09MPa,单独采用酪氨酸酶修饰的明胶与壳聚糖共混材料t-G/CS的拉伸强度为39.97MPa,这说明单独采用一种生物酶(微生物转谷氨酰胺酶或酪氨酸酶)修饰的明胶与壳聚糖共混材料的拉伸强度得到提高。采用双生物酶(微生物转谷氨酰胺酶和酪氨酸酶)共同修饰的明胶与壳聚糖共混材料mt-G/CS的拉伸强度为50.06MPa,与G/CS相比拉伸强度提高了62.80%,以上结果表明,本发明采用的双生物酶修饰方法能够明显提高明胶与壳聚糖共混材料的力学性能。
图2是明胶材料,以及实施例1得到的采用双生物酶修饰的明胶与壳聚糖共混材料对大肠杆菌的抑菌效果对比图。
其测试过程参考中华人民共和国轻工行业标准:QB/T 2591-2003《抗菌塑料—抗菌性能测试方法和抗菌效果》。具体测试过程为:将新鲜细菌培养物(24小时内转接的),加入培养液中,依次做10倍递增稀释,选择菌液浓度为(5.0~10.0)×105 CFU/mL 的稀释液作为试验用菌液。在每个培养管中加入2mL菌液,分别加入1片明胶膜片和采用双生物酶修饰的明胶与壳聚糖共混膜片,而不加入膜片的培养管作为空白对照组,在37℃恒温振荡培养24小时后,用平板计数法计算出菌落数目。每组数据做两次平行实验,每个样品做三个平行抗菌测试。其中抗菌率(%)=(空白对照样品平均回收菌数-抗菌样品平均回收菌数)/空白对照样品平均回收菌数×100%。
从图2可以看出,Control代表的未加入样品的空白培养基经过过夜培养后大肠杆菌的浓度为6.48×107CFU/mL,而G代表的加入未修饰的明胶材料经过过夜培养后的大肠杆菌浓度为8.22×107CFU/mL,这说明未修饰的明胶基材料不仅不具有对大肠杆菌的抗菌活性,相反它能够促进大肠杆菌的生长和繁殖。mt-G/CS代表的加入双生物酶修饰的明胶与壳聚糖共混材料经过过夜培养后的大肠杆菌浓度为5.70×107CFU/mL,与未修饰的明胶材料G相比,抗菌率提高了30.66%。以上结果表明,本发明所得到的双生物酶修饰的明胶与壳聚糖共混材料对大肠杆菌具有抗菌活性。
图3是明胶材料,以及实施例1得到的采用双生物酶修饰的明胶与壳聚糖共混材料对金黄色葡萄球菌的抑菌效果对比图。
其测试过程参考中华人民共和国轻工行业标准:QB/T 2591-2003《抗菌塑料—抗菌性能测试方法和抗菌效果》。具体测试过程为:将新鲜细菌培养物(12小时内转接的),加入培养液中,依次做10倍递增稀释,选择菌液浓度为(1.0~5.0)×109CFU/mL 的稀释液作为试验用菌液。在每个培养管中加入3mL菌液,分别加入1片明胶膜片和采用双生物酶修饰的明胶与壳聚糖共混膜片,而不加入膜片的培养管作为空白对照组,在37℃恒温振荡培养12小时后,用平板计数法计算出菌落数目。每组数据做两次平行实验,每个样品做三个平行抗菌测试。其中抗菌率(%)=(空白对照样品平均回收菌数-抗菌样品平均回收菌数)/空白对照样品平均回收菌数×100%。
从图3可以看出,Control代表的未加入样品的空白培养基经过过夜培养后金黄色葡萄球菌的浓度为2.79×1011CFU/mL,而G代表的加入未修饰的明胶材料经过过夜培养后的金黄色葡萄球菌浓度为3.71×1011CFU/mL,这说明未修饰的明胶基材料不仅不具有对金黄色葡萄球菌的抗菌活性,相反它能够促进金黄色葡萄球菌的生长和繁殖。mt-G/CS代表的加入双生物酶修饰的明胶与壳聚糖共混材料经过过夜培养后的金黄色葡萄球菌浓度为2.26×1011CFU/mL,与未修饰的明胶材料G相比,抗菌率提高了39.08%。以上结果表明,本发明所得到的双生物酶修饰的明胶与壳聚糖共混材料对金黄色葡萄球菌具有抗菌活性。
实施例2:
一种采用双生物酶修饰明胶与壳聚糖共混生物材料的制备方法,它包括如下具体步骤:
1)溶液的配制:
称取3g明胶加入到50mL去离子水中,在40℃的水浴中搅拌1.5小时至明胶完全溶解得到浓度为0.06g/mL的明胶溶液;称取1.5g壳聚糖加入到50mL 1%((体积百分比v/v%)乙酸溶液中,室温下搅拌4小时至壳聚糖充分溶解,得到浓度为0.03g/mL的壳聚糖溶液,向壳聚糖溶液中缓慢滴加0.5mol/L氢氧化钠溶液至溶液的pH为5.5;将微生物转谷氨酰胺酶加入去离子水中温下搅拌15分钟,再过滤得到2U/mL的微生物转谷氨酰胺酶溶液;将酪氨酸酶加入 PBS(pH7.0)缓冲溶液中,室温下搅拌3分钟,得到1000U/mL的酪氨酸酶溶液。
2)明胶与壳聚糖的共混:
分别量取50 mL上述配制的明胶溶液和壳聚糖溶液等体积混合,40℃下搅拌30分钟,使溶液混合均匀,得到明胶与壳聚糖共混溶液。
3)双生物酶修饰的明胶与壳聚糖共混材料的制备:
向100mL明胶与壳聚糖的共混溶液中加入6U微生物转谷氨酰胺酶和3000U酪氨酸酶,在28℃下搅拌反应20分钟,将反应液倒入培养皿中,在室温下通风干燥48小时,得到双生物酶修饰的明胶与壳聚糖共混材料膜片,然后将膜片在0.2mol/L氢氧化钠溶液中浸泡45分钟,再用大量去离子水冲洗膜片, 35℃下干燥18小时,得到一种采用双生物酶修饰的明胶与壳聚糖共混生物材料。
实施例3:
一种采用双生物酶修饰明胶与壳聚糖共混生物材料的制备方法,它包括如下具体步骤:
1)溶液的配制:
称取6g明胶加入到100mL去离子水中,在60℃的水浴中搅拌1.5小时至明胶完全溶解得到浓度为0.06g/mL的明胶溶液;称取2g壳聚糖加入到100mL 1%((体积百分比v/v%)乙酸溶液中,室温下搅拌5小时至壳聚糖充分溶解,得到浓度为0.02g/mL的壳聚糖溶液,向壳聚糖溶液中缓慢滴加0.8mol/L氢氧化钠溶液至溶液的pH为5.5;将微生物转谷氨酰胺酶加入去离子水室温下搅拌20分钟,再过滤得到2U/mL的微生物转谷氨酰胺酶溶液;将酪氨酸酶加入PBS(pH7.0)缓冲溶液中,室温下搅拌5分钟,得到1000U/mL酪氨酸酶溶液。
2)明胶与壳聚糖的共混:
分别量取100mL上述配制的明胶溶液和壳聚糖溶液等体积混合,60℃下搅拌30分钟,使溶液混合均匀,得到明胶与壳聚糖共混溶液。
3)双生物酶修饰的明胶与壳聚糖共混材料的制备:
向100 mL明胶与壳聚糖的共混溶液中加入8U微生物转谷氨酰胺酶和4000U酪氨酸酶,在30℃下搅拌反应10分钟,将反应液倒入培养皿中,在室温下通风干燥60小时,得到双生物酶修饰的明胶与壳聚糖共混材料膜片,然后将膜片在0.5mol/L氢氧化钠溶液中浸泡1小时,再用大量去离子水冲洗膜片, 40℃下干燥24小时,得到采用双生物酶修饰的明胶与壳聚糖共混生物材料。
需要说明的是,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或等同替换,而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围,其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
机译: 壳聚糖衍生物经过分子修饰后,可以形成一种有机连接,一种包含成分的制备方法,并且可以用于防止由重金属(尤其是钯,钴,铬和金,尤其是硝基)引起的过敏。
机译: 具有胶原蛋白,壳聚糖和糖胺聚糖混合物的生物材料,其制备方法及其在人体医学中的应用
机译: 基于胶原蛋白,壳聚糖和糖胺聚糖混合物的新型生物材料,其制备方法及其在人体医学中的应用。