一组鼠特异性抗生育作用的多肽

摘要

本发明公开了6种免疫抗生育多肽片段均具有很好的免疫原性，能够刺激机体产生特异性抗体，诱导抗生育作用。从抗原多肽免疫小鼠与对照组(KLH对照组)免疫小鼠的生育对比发现，6条多肽抗原混合组免疫可使雄性和雌性小鼠的产仔率明显下降，产仔数分别下降62.8％和50％。HE6多肽组或混合组免疫雄性小鼠能够显著降低精子的运动能力和活力。本发明所示的具有高效抗生育效果的多肽为鼠特异免疫抗生育疫苗的研究奠定了基础。可以用于各种抗生育制剂的应用。

说明书

技术领域：

本发明涉及一组鼠特异性抗生育的多肽，特别是涉及包含鼠特异性附睾蛋白和精子蛋 白的免疫抗生育多肽。

背景技术：

目前据世界卫生组织(WHO)统计，全世界有老鼠170亿只以上，我国有老鼠40亿只 以上，对农业、林业、畜牧业及人类的健康造成了严重的危害。根据联合国粮农组织(FAO) 报告，全世界由于鼠害造成粮食损失最高可达到收获量的15％-20％，相当于25个贫穷国 家国民收入总值，够1.5亿人全年的口粮。在我国每年近千万亩森林和十亿亩草场被破坏成 为沙漠或荒洲，损失超过30亿人民币。此外，老鼠能传播多种人畜共患传染性疾病，携带 得200余种病原体中能使人致病的就有57种。因此，研究低毒无害、不污染生态环境的特 异灭鼠技术和药品是具有非常重要的意义。

目前灭鼠以化学灭鼠为主，但是化学灭鼠存在对人畜的毒副作用和鼠类抗药性等诸多 问题，而且由于鼠类繁殖能力极强，往往杀灭快，鼠类数量恢复也快。近年来，澳大利亚 科学家成功的构建了表达小鼠卵细胞透明带ZP3蛋白的鼠痘病毒，成功地抑制了鼠类的生 育繁殖能力。但是，由于鼠的ZP3蛋白与人的ZP3蛋白高度同源，即靶标不具备特异性， 从而引发了公众对这种鼠痘病毒在野外长期使用的安全性的担忧，限制了它的推广使用。

因此，研究鼠特异性的抗生育靶标具有非常重要的意义。作为鼠特异性的抗生育靶标， 首要条件是靶标蛋白必须是功能重要的生殖相关蛋白；其次是必须具有鼠特异性；最后是 免疫抗生育靶标能够与抗体直接相互作用，最好是膜蛋白或分泌蛋白。

此外，疫苗促使机体产生高滴度抗体的前提是疫苗具有强免疫原性。现代保护性免疫 理论认为，有效的保护性免疫源于一组表位的合理组合和搭配。蛋白质抗原并非通过其完 整分子发挥功能，而是通过其表位体现其特异性。就某一蛋白质抗原而言，就含有与免疫 识别密切相关的表位结构，产生免疫应答反应。由于许多天然抗原引发的免疫反应存在交 叉反应，不能很好的满足临床实际需要，因此，为了提高蛋白质抗原的特异性，就必须在 表位水平上做出选择，保留和改善特异性多肽片段，以得到更理想的疫苗靶标分子。

发明内容：

本发明目的在于公开一组包含鼠特异性附睾蛋白和精子蛋白的免疫抗生育多肽。

本发明的目的是通过这样的技术方案实现：

一组具有抗生育的多肽，包括SEQ ID：1-6中的任意多个等量混合的所示的氨基酸序 列。

一种抗生育的药物制剂，包含上述SEQ ID 1-6中任意所述的多个等量混合的所示的氨 基酸序列作为活性成分。

一种灭鼠制剂，包含上述SEQ ID 1-6中任一所述的多个等量混合的所示的氨基酸序列 作为活性成分。

一种具有抗生育作用的药物组合物，包含所述的多肽和药学上可接受的载体和赋形 剂。

一种来源于鼠的特异性精子蛋白Sp38免疫抗生育多肽，其氨基酸序列为：SEQ ID：1 和SEQ ID：2。

一种来源于鼠的特异性附睾蛋白HE6免疫抗生育多肽，其氨基酸序列为：SEQ ID：3 和SEQ ID：4。

一种来源于鼠的特异性精子蛋白Slc26a8免疫抗生育多肽，其氨基酸序列为：SEQ ID： 5和SEQ ID：6。

一种具有抗生育的多肽，其氨基酸序列为：SEQ ID：1-6中6个多肽以等量混合制成。

一种抗生育的蛋白，由所述多肽分别与匙孔血蓝蛋白(KLH)偶联组成。

上述SEQ ID 1-6中所述的多肽作为活性成分时，单位制剂中多肽总含量为100μg，单 位制剂指注射剂的“每支”，SEQ ID 1-6中所述的多条多肽混合时按等量进行混合。

本发明的6条多肽片段具有很好的免疫原性，能够刺激机体产生特异性抗体，诱导抗 生育作用。从抗原多肽免疫小鼠与对照组(KLH对照组)免疫小鼠的生育对比发现，6条 多肽抗原混合组免疫可使雄性和雌性小鼠的产仔率明显下降，产仔数分别下降62.8％和 50％。HE6多肽组或混合组免疫雄性小鼠能够显著降低精子的运动能力和活力。本发明所示 的具有高效抗生育效果的多肽为鼠特异免疫抗生育疫苗的研究奠定了基础。

本发明抗原在抗原特性上与天然抗原不同，但引起的免疫反应特异性和免疫效果与天 然抗原无异，有针对性的筛选交叉反应性小或没有交叉反应性的优势表位进行研究，结果 表明申请人筛选的6种鼠特异性抗生育多肽具有很好的免疫抗生育效果具有很乐观的应用 前景。六种鼠特异性附睾蛋白和精子蛋白的免疫抗生育多肽，具有显著的抗原性，免疫抗 生育效果明显，而且无毒副作用。

下述实验例和实施例进一步说明但不限于本发明。

申请人通过比较基因组学及生物信息学技术结合充分的文献调研发现，附睾HE6受体 蛋白、精子Sp38和Slc26a8蛋白，它们均为膜蛋白，敲除后雄性小鼠均呈不育表型，均可 作为免疫抗生育的潜在靶标，同时这三个蛋白由于分布的部位不同，分别参与精液的重吸 收、精卵结合和精子运动发育等不同的过程，所以它们还可能具有协同作用。

由于本合成多肽分子量太小，在动物体内不能诱导产生免疫反应，因此将多肽与载体 蛋白交联后才能进行免疫，能显著增加抗原的免疫原性。选择匙孔血蓝蛋白(Keyhole limpet  hemocyanin，KLH)进行交联，是由于它是一种自身就能引发免疫反应的大分子载体蛋白， 免疫原性优于BSA等其它的载体蛋白。因此，本发明均使用KLH与多肽片段进行偶联。

实验例1抗生育多肽序列的筛选

为了筛选到既具有鼠特异型，又具有良好抗原性的多肽片段，本发明使用了Invitrogen 公司的在线多肽分析工具(http://peptideselect.invitrogen.com/peptide)和DNAStar分析软件 中Protean分析工具，对人/鼠附睾蛋白HE6、精子蛋白Sp38与Slc26a8的蛋白序列进行分 析。根据选取特异性好、抗原性、亲水性强、避免位于螺旋区结构多肽的原则，最终选取 Sp38蛋白的4-19位和40-54位氨基酸序列、Slc26a8蛋白的2-20位和36-51位氨基酸序列 及HE6蛋白的3-14位和35-50位氨基酸序列进行研究，DNAStar分析软件中Protean分析 工具分析多肽序列的结果见图1，选取多肽的序列结果见表1。

表1本发明抗生育多肽中的氨基酸序列信息

实验例2本发明多肽免疫小鼠血清抗体的抗生育研究

试剂及其制备方法：

包被稀释液组成和配制：由0.05mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液组成，1.5g的碳酸钠和 2.9g的NaHCO₃混合后，加双蒸馏水至1000mL，调至pH9.6。

封闭液组成和制备：5％BSA-PBS溶液，BSA5g，加入PBS(pH7.4)100mL得到 磷酸盐缓冲液(PBS)：

A液：0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液，制备方法为NaH₂PO₄，H₂O 27.6g溶于双蒸馏水 1000mL。

B液：0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液，制备方法为Na₂HPO₄·7H₂O 53.6g、Na₂HPO₄·12H₂O 71.6g或Na₂HPO₄·2H₂O 35.6g溶于双蒸馏水1000mL。

样本稀释液：PBS，0.01mol/L磷酸盐缓冲生理盐水，制备方法：PBA液19mL与PBB 液81mL混合，加入NaCl 18.5g，加双蒸馏水至1000mL。

洗涤液：PBST，pH7.4，制备方法：PBS液1000mL加Tween200.5mL，调至pH7.4。

底物液：OPD-H₂O₂来源：OPD(邻苯二胺<盐酸盐>)(Sigma公司，USA)

A液：0.1mol/L柠檬酸溶液，制备方法：柠檬酸19.2g，加双蒸馏水至1000mL。

B液：0.2mol/LNaH₂PO₄溶液，制备方法：Na₂HPO₄·12H₂O 71.7g，加双蒸馏水至1000mL。

终止液：2mol/LH₂SO₄溶液，制备方法：向双蒸馏水600mL中缓缓滴加浓硫酸100mL 并不断搅拌后，加双蒸馏水至900mL。

辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG(Cell Signaling公司，USA)。

福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂(Sigma公司，USA)。

牛血清白蛋白(BSA)(Sigma公司，USA)。

主要仪器：

酶标仪(Bio-Rad公司，USA)

96孔聚丙乙烯酶联板(Costar公司，USA)

电热恒温水热箱(上海一恒科技有限公司，中国)

实验方法：

实验动物分组：健康Balb/c小鼠(北京军事医学科学院实验动物中心提供)50只，雌 性和雄性各25只，6～8周龄，10～16g，随机分为10组，以SEQ ID 1-6中所述的2条或多 条多肽混合使用，每条多肽的使用剂量按等量进行混合，每次使用的总剂量为100μg/只， 分别分组，每组5只，按如下相同的方法和剂量免疫小鼠。6种多肽用于免疫的分组设计见 表2。表2本发明多肽免疫小鼠的分组设计

免疫程序：首次免疫，将多肽按100μg/只/次的剂量与福氏完全佐剂等体积混合，充分 乳化，制得免疫原，分两点注射到Balb/c小鼠腹膜下组织部位；间隔2周，加强免疫，将 多肽按100μg/只/次的剂量与福氏不完全佐剂等体积混合，充分乳化，制得免疫原，分两点 注射到Balb/c小鼠腹膜下组织部位；再间隔2周，以同样方法重复加强免疫1次。免疫结 束后14天，将接受免疫的小鼠尾静脉取血，收集其血清。

标本的采集和分离：将免疫小鼠尾静脉放血，分离血清，于-20℃冰箱保存备用。

间接酶联免疫(ELISA)方法检测抗体：采用标准间接ELISA法测定血清中抗体滴度， 分别测定每组动物特异性抗体滴度。包被液、稀释液及洗涤液、酶标二抗为羊抗小鼠IgG， 地物为OPD；用96孔酶联板包被抗原浓度为10μg/mL，每孔100μl，置37℃恒温水浴箱4 小时后，弃去孔中液体；用5％BSA-PBS封闭酶标反应孔，37℃恒温水浴箱40分钟后，洗 涤液满孔洗涤3次，每次3分钟。按照10倍连续稀释的血清比例加入各孔，每孔100μl，37℃ 恒温水浴箱1小时后洗涤3次；加入酶标二抗，37℃恒温水浴箱40分钟，加入底物OPD， 每孔100μl，置37℃蔽光显色反应20分钟，终止反应，于20分钟内，用酶标仪于492nm 测定吸光度A值，以正常小鼠血清作阴性对照。结果以双复孔平均OD值表示，待测标本 OD值/阴性对照OD值＞2.1判定为阳性。免疫雌性和雄性小鼠血清抗体检测结果见图2和 图3。

检测结果显示：多肽组免疫雄性小鼠血清中针对多肽Sp38-1、HE6-1和Slc26a8-2产生 的抗体效价均较高；混合组免疫雄性小鼠血清中针对Slc26a8-1的抗体效价最高，而针对 Sp38-1、HE6-1和Slc26a8-2的抗体效价均有所降低；多肽免疫雌性小鼠血清中针对6种多 肽均产生了均较高的抗体。

实验例3 本发明的多肽免疫小鼠的抗生育效果

主要试剂：

福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂(Sigma公司，USA)。

实验方法：

实验动物分组：健康Balb/c小鼠(北京军事医学科学院实验动物中心提供)50只，雌 性和雄性各25只，6～8周龄，10～16g，随机分为10组，SEQ ID 1-6中所述的多肽混合使用 时，按照实验例2中的分组设计表2进行样品分组，每条多肽的使用剂量按等量进行混合， 每次使用的总剂量为100μg/只分别分组，每组5只，按如下相同的方法和剂量免疫小鼠。

免疫程序：首次免疫，将多肽按100μg/只/次的剂量与福氏完全佐剂等体积混合，充分 乳化，制得免疫原，分两点注射到Balb/c小鼠腹膜下组织部位；间隔2周，加强免疫，将 多肽按100μg/只/次的剂量与福氏不完全佐剂等体积混合，充分乳化，制得免疫原，分两点 注射到Balb/c小鼠腹膜下组织部位；再间隔2周，以同样方法重复加强免疫1次。免疫结 束后观察14天，再将免疫小鼠与正常的健康小鼠按照1∶1比例合笼饲养。合笼14天后分笼， 分笼4天后，每日上午观察小鼠生产情况，并统计产仔数，结果见表3。

表3 本发明多肽免疫雄性小鼠的抗生育效果检测结果

检测结果显示：Sp38、HE6和Slc26a8中任意一组多肽单独免疫对雄鼠的生育没有显著 性的影响(P值均大于0.05)，而混合组免疫小鼠的产仔数明显减少，产仔数为对照组的 32.6％，P值小于0.02，提示混合组的各个多肽可能产生协同作用，干扰了正常的生育过程。 虽然来自HE6多肽的HE6-1和HE6-2对雄鼠生育的影响没有统计学意义(P值为0.15)， 但用它免疫后可以导致20％的雄鼠不育，产仔数为对照组的62.8％。混合组免疫雌性小鼠具 有免疫抗生育作用(P值小于0.05)，可使雌鼠的产仔数降低50％，提示Sp38与Slc26a8也 具有协同作用。Sp38和Slc26a8多肽组的免疫，能使产仔数分别减少33％和25％，P值均 大于0.05(分别为0.28和0.14)。

实验例5 本发明多肽免疫小鼠附睾组织的病理学检测抗生育研究

主要试剂：

4％多聚甲醛(北京索莱宝科技有限公司，中国)。

实验方法：

实验动物分组：健康Balb/c小鼠(北京军事医学科学院实验动物中心提供)50只，雌 性和雄性各25只，6～8周龄，10～16g，随机分为10组，SEQ ID 1-6中所述的多肽混合使用 时，按照实验例2中的分组设计表2进行样品分组，每条多肽的使用剂量按等量进行混合， 每次使用的总剂量为100μg/只分别分组，每组5只，按如下相同的方法和剂量免疫小鼠。

免疫程序：首次免疫，将多肽按100μg/只/次的剂量与福氏完全佐剂等体积混合，充分 乳化，制得免疫原，分两点注射到Balb/c小鼠腹膜下组织部位；间隔2周，加强免疫，将 多肽按100μg/只/次的剂量与福氏不完全佐剂等体积混合，充分乳化，制得免疫原，分两点 注射到Balb/c小鼠腹膜下组织部位；再间隔2周，以同样方法重复加强免疫1次。免疫结 束后观察14天，再将免疫小鼠与正常的健康小鼠按照1∶1比例合笼饲养。合笼14天后分笼， 解剖小鼠取附睾组织利用4％多聚甲醛固定，检测免疫雄鼠后产生的抗体是否会导致雄鼠生 殖系统的病理学改变，结果见图4。

检测结果显示：混合注射组(分组4)和HE6多肽组免疫的小鼠附睾头部和尾部的管腔 变小，小管变稀疏；尾部管腔内的精子也减少。Sp38和Slc26a8多肽组免疫的小鼠附睾头 部和尾部均未发生明显变化。

实验例6 本发明多肽免疫对小鼠对精子运动与活力的影响

实验方法：

实验动物分组：健康Balb/c小鼠(北京军事医学科学院实验动物中心提供)50只，雌 性和雄性各25只，6～8周龄，10～16g，随机分为10组，SEQ ID 1-6中所述的多肽混合使用 时，按照实验例2中的分组设计表2进行样品分组，每条多肽的使用剂量按等量进行混合， 每次使用的总剂量为100μg/只分别分组，每组5只，按如下相同的方法和剂量免疫小鼠。

免疫程序：首次免疫，将多肽按100μg/只/次的剂量与福氏完全佐剂等体积混合，充分 乳化，制得免疫原，分两点注射到Balb/c小鼠腹膜下组织部位；间隔2周，加强免疫，将 多肽按100μg/只/次的剂量与福氏不完全佐剂等体积混合，充分乳化，制得免疫原，分两点 注射到Balb/c小鼠腹膜下组织部位；再间隔2周，以同样方法重复加强免疫1次。免疫结 束后观察14天，再将免疫小鼠与正常的健康小鼠按照1∶1比例合笼饲养。合笼14天后分笼， 检测多肽免疫的雄性小鼠的精子活力、运动能力和精子数。结果见表4。

表4本发明多肽免疫对小鼠精子运动与活力的影响结果

检测结果显示：HE6多肽组免疫能够显著抑制精子的运动与活力，精子数也有所降低。 混合注射组的精子运动与活力也显著降低，而Sp38和Slc26多肽组免疫对精子运动与活力 影响不大，表明HE6多肽组在混合注射组的免疫抗生育中发挥着重要的作用。

附图说明：

图1：DNAStar分析软件中Protean分析工具分析多肽序列的结果

图2：本发明多肽ELISA检测雄鼠抗血清抗体效价

图3：本发明多肽ELISA检测雌鼠鼠抗血清抗体效价

图4：本发明多肽免疫小鼠附睾组织的病理学检测结果

下述实施例均能实现上述实验例的效果。

实施例1

对筛选的鼠抗生育多肽序列在全自动多肽合成仪上由固定羧基向氨基端递减合成后获 得粗品，再经30％乙睛溶解后进行高压液相色谱(HPLC)分析，计算主峰面积并收集，经 冷冻真空抽干后纯化合成多肽，质谱鉴定。多肽序列的合成委托北京康为世纪生物科技有 限公司完成。

载体蛋白选择匙孔血蓝蛋白(Keyhole limpet hemocyanin，KLH)，用双功能试剂顺丁烯 酰胺苯甲酸-N-琥珀酸酯(MBS)连接法将KLH与合成肽SEQ ID 1-2等量混合使用，进行 偶联：取KLH 5mg(0.11μmol，含赖氨酸2.2μmol)，溶于0.75mL偶联缓冲液1(50mmol/L 硼酸盐缓冲液，pH8.5)；3mgMBS(11μmol)溶于75μl二甲酰胺(DMF)。将MBS溶液分 3次加入KLH溶液，旋转混匀，室温作用30分钟。迅速离心后将反应混合物(约0.8mL) 加入预先用偶联缓冲液2(0.1mol/L磷酸盐，0.15mol/LNaCL，0.01mol/LNa₂EDTA，pH＝7.0) 平衡的PD-10柱。用偶联缓冲液2洗脱，收集洗脱液(即MBS-KLH溶液)。溶解1.5mg合 成多肽于0.15mL偶联缓冲液2，加入MBS-KLH缓冲液0.56mL，室温下旋转混合，作用2 小时后置4℃过夜，将反应混合物(0.7mL)加入预先用磷酸盐缓冲液平衡的PD-10柱，磷 酸缓冲液洗脱，收集流出液。将KLH、MBS-KLH和偶联物进行SDS-PAGE(聚丙烯酰胺 凝胶电泳)鉴定偶联效率，将得到的蛋白，按照常规方法，制成注射剂，后用于本发明的 雌鼠或雄鼠抗生育应用。

实施例2

对筛选的鼠抗生育多肽序列在全自动多肽合成仪上由固定羧基向氨基端递减合成后获 得粗品，再经30％乙睛溶解后进行高压液相色谱(HPLC)分析，计算主峰面积并收集，经 冷冻真空抽干后纯化合成多肽，质谱鉴定。多肽序列的合成委托北京康为世纪生物科技有 限公司完成。

载体蛋白选择匙孔血蓝蛋白(Keyhole limpet hemocyanin，KLH)，用双功能试剂顺丁烯 酰胺苯甲酸-N-琥珀酸酯(MBS)连接法将KLH与SEQ ID 3-4中所述的2条多肽等量混合 使用，进行偶联：取KLH 5mg(0.11μmol，含赖氨酸2.2μmol)，溶于0.75mL偶联缓冲液1 (50mmol/L硼酸盐缓冲液，pH8.5)；3mgMBS(11μmol)溶于75μl二甲酰胺(DMF)。将 MBS溶液分3次加入KLH溶液，旋转混匀，室温作用30分钟。迅速离心后将反应混合物 (约0.8mL)加入预先用偶联缓冲液2(0.1mol/L磷酸盐，0.15mol/L NaCL，0.01mol/L Na₂EDTA，pH＝7.0)平衡的PD-10柱。用偶联缓冲液2洗脱，收集洗脱液(即MBS-KLH 溶液)。溶解1.5mg合成多肽于0.15mL偶联缓冲液2，加入MBS-KLH缓冲液0.56mL，室 温下旋转混合，作用2小时后置4℃过夜，将反应混合物(0.7mL)加入预先用磷酸盐缓冲 液平衡的PD-10柱，磷酸缓冲液洗脱，收集流出液。将KLH、MBS-KLH和偶联物进行 SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)鉴定偶联效率，将得到的蛋白，按照常规方法，制成片 剂，后用于本发明的雌鼠或雄鼠抗生育应用。

实施例3

对筛选的鼠抗生育多肽序列在全自动多肽合成仪上由固定羧基向氨基端递减合成后获 得粗品，再经30％乙睛溶解后进行高压液相色谱(HPLC)分析，计算主峰面积并收集，经 冷冻真空抽干后纯化合成多肽，质谱鉴定。多肽序列的合成委托北京康为世纪生物科技有 限公司完成。

载体蛋白选择匙孔血蓝蛋白(Keyhole limpet hemocyanin，KLH)，用双功能试剂顺丁烯 酰胺苯甲酸-N-琥珀酸酯(MBS)连接法将KLH与SEQ ID 5-6中所述的2条多肽等量混合 使用，进行偶联：取KLH 5mg(0.11μmol，含赖氨酸2.2μmol)，溶于0.75mL偶联缓冲液1 (50mmol/L硼酸盐缓冲液，pH8.5)；3mgMBS(11μmol)溶于75μl二甲酰胺(DMF)。将 MBS溶液分3次加入KLH溶液，旋转混匀，室温作用30分钟。迅速离心后将反应混合物 (约0.8mL)加入预先用偶联缓冲液2(0.1mol/L磷酸盐，0.15mol/L NaCL，0.01mol/L Na₂EDTA，pH＝7.0)平衡的PD-10柱。用偶联缓冲液2洗脱，收集洗脱液(即MBS-KLH 溶液)。溶解1.5mg合成多肽于0.15mL偶联缓冲液2，加入MBS-KLH缓冲液0.56mL，室 温下旋转混合，作用2小时后置4℃过夜，将反应混合物(0.7mL)加入预先用磷酸盐缓冲 液平衡的PD-10柱，磷酸缓冲液洗脱，收集流出液。将KLH、MBS-KLH和偶联物进行 SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)鉴定偶联效率，将得到的蛋白，按照常规方法，制成膜 剂，后用于本发明的雌鼠或雄鼠抗生育应用。

实施例4

对筛选的鼠抗生育多肽序列在全自动多肽合成仪上由固定羧基向氨基端递减合成后获 得粗品，再经30％乙睛溶解后进行高压液相色谱(HPLC)分析，计算主峰面积并收集，经 冷冻真空抽干后纯化合成多肽，质谱鉴定。多肽序列的合成委托北京康为世纪生物科技有 限公司完成。

载体蛋白选择匙孔血蓝蛋白(Keyhole limpet hemocyanin，KLH)，用双功能试剂顺丁烯 酰胺苯甲酸-N-琥珀酸酯(MBS)连接法将KLH与SEQ ID 1-6中所述的6条多肽等量混合 使用，进行偶联：取KLH 5mg(0.11μmol，含赖氨酸2.2μmol)，溶于0.75mL偶联缓冲液1 (50mmol/L硼酸盐缓冲液，pH8.5)；3mgMBS(11μmol)溶于75μl二甲酰胺(DMF)。将 MBS溶液分3次加入KLH溶液，旋转混匀，室温作用30分钟。迅速离心后将反应混合物 (约0.8mL)加入预先用偶联缓冲液2(0.1mol/L磷酸盐，0.15mol/L NaCL，0.01mol/L Na₂EDTA，pH＝7.0)平衡的PD-10柱。用偶联缓冲液2洗脱，收集洗脱液(即MBS-KLH 溶液)。溶解1.5mg合成多肽于0.15mL偶联缓冲液2，加入MBS-KLH缓冲液0.56mL，室 温下旋转混合，作用2小时后置4℃过夜，将反应混合物(0.7mL)加入预先用磷酸盐缓冲 液平衡的PD-10柱，磷酸缓冲液洗脱，收集流出液。将KLH、MBS-KLH和偶联物进行 SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)鉴定偶联效率，将得到的蛋白，按照常规方法，制成注 射剂，后用于本发明的雌鼠或雄鼠抗生育应用。