降钙素原用于在具有非特异性不适的患者中诊断细菌感染和指导抗生素治疗

摘要

本发明涉及用于在具有非特异性不适的患者中诊断细菌感染的方法，所述方法包括下列步骤：（i）提供来自于表现出非特异性不适的患者的样品；（ii）测定所述样品中降钙素原（PCT）或长度为至少12个氨基酸的其片段的水平；以及（iii）通过将所述测定到的PCT水平与预定的阈值水平进行比较，来确定所述患者是否具有细菌感染。本发明还涉及使用该方法为向具有非特异性不适的患者给药抗生素提供治疗指导。本发明还涉及该方法在用抗生素治疗具有非特异性不适的患者中的用途。

说明书

发明领域

本发明属于临床诊断学领域。具体来说，本发明涉及在从具有非 特异性不适的对象的体液得到的样品中测定降钙素原（PCT）。

发明背景

表现出非特异性不适（NSC）的患者是众所周知但定义不明确的 群体。这在例如急诊部（ED）常见。受影响的个体常常主述“感觉不 好”、“感觉虚弱”、“感觉精疲力竭”、“疲倦或嗜睡”、感觉“晕 眩”，主述不能应付日常活动、缺乏食欲（van Bokhoven等，2008.J Clin Epidemiol;61:318-22）。一些患者可能不能回忆起他们为何被送往ED。 在NSC患者护理期间，ED医生面对广泛不同的诊断，其范围从家庭 护理不足到急性的威胁生命的病情（Gordon 1986.Geriatrics 41(4):75-80）。具有NSC的患者属于对ED医生最具挑战性的患者（Chew和Birnbaumer 1999.Emerg Med Clin North Am 17(1):265-78）。此外， 由于诸如并发疾病、多种药物或精神状态改变的因素，临床表现常常 不清。

Vanapee等证实，来到ED的老年个体中高达20%没有特异性不适 （Vanpee等，2001.Eur JEmerg Med8(4):301-4）。50%的没有特异性 不适的老年个体受到急性医疗问题的困扰（Rutschmann等，2005.Swiss Med Wkly 135(9-10):145-50）。

降钙素原（PCT）已成为诊断脓毒症的广泛接受的生物标志物。 PCT反映出细菌感染的严重性，特别被用于监测感染发展成为脓毒症、 重症脓毒症或脓毒性休克。可以使用PCT来测量与感染相关的全身性 炎性应答的活性、控制抗细菌疗法的成功和估计预后（Assicot等，1993.Lancet 341:515-8；Clec'hC等，2004.Crit Care Med 32:1166-9；Lee等，2004.Yonsei Med J 45:29-37；Meisner等，2005.Curr Opin Crit Care11:473-480；Wunder等，2004.Inflamm Res 53:158-163）。患有脓毒症 的患者中PCT水平的增加与死亡率相关（Oberhoffer等，1999.Clin Chem Lab Med 37:363-368）。

PCT已在具有感染症状（例如呼吸短促、发烧）的患者中用于抗 生素的治疗指导。在来到ED的具有下呼吸道感染症状的患者中测量 PCT，并且只对PCT浓度>0.25ng/mL或>0.5ng/mL的患者用抗生素进 行治疗（Christ-Crain等，2004.Lancet 363:600-7）。在患有社区获得 性肺炎（CAP）的患者中，基于血清PCT浓度进行抗生素治疗（PCT 浓度<0.1ng/mL时强烈不鼓励；PCT浓度<0.25ng/mL时不鼓励；PCT 浓度>0.25ng/mL时鼓励，PCT浓度>0.5ng/mL时强烈鼓励） （Christ-Crain等，2006.Am J RespCritCare Med 174:84-93）。PCT 指导显著降低了CAP中抗生素的使用，并且没有恶化患者的后果。同 样地，对急性呼吸道感染来说，使用与上述相同的决定阈值的PCT指 导的疗法，在初级护理中也显著减少了抗生素使用，并且不损害患者 的后果（Briel等，2008.Arch Intern Med 168:2000-7；Burkhardt等，2010.Eur Resp J Express;doi:10.1183/09031936.00163309）。

到目前为止，使用PCT测量值诊断流行性细菌感染仅限于由于他 们所表现出的症状而已经被怀疑患有细菌感染的患者。到目前为止完 全不清楚PCT的这种用法是否也可能用于表现出非特异性不适、但没 有直接指向细菌感染是这些不适的可能原因的患者。在这样的患者中， 细菌感染的患病率是未知的，并且它可能相对低。生物标志物例如PCT 可能能够以有意义的灵敏度和特异性在这样的患者群体中鉴定具有细 菌感染的患者，这是极富挑战性并且一点也不是显而易见的，这是因 为有许多其他患者并没有细菌感染，他们明确有病，并且他们可能病 得非常严重。到目前为止，已经在怀疑患有细菌感染的患者中进行了 PCT测定，因为所述患者显示出指向细菌感染的症状或表现出指向细 菌感染的不适。还从未实践过测量PCT水平以意图在具有非特异性不 适的患者中诊断流行性细菌感染。

通过测定PCT的浓度来确定炎性过程的病因学并从肽的存在或不 存在来确定所述炎症是感染性还是非感染性起因的诊断方法，描述在 EP 080702B1中。

令人吃惊地发现，在来自于表现出非特异性不适的患者的体液的 样品中测量降钙素原水平，可用于在这些患者中进行细菌感染的诊断 和治疗指导。

发明概述

本发明涉及在来到急诊部的具有非特异性不适的患者中诊断或鉴 定细菌感染的方法。所述方法包括下列步骤：

（i）提供来自于表现出非特异性不适的患者的样品；

（ii）测定所述样品中降钙素原（PCT）或长度为至少12个氨基 酸、优选长度在50个以上氨基酸、更优选长度110个以上氨基酸的其 片段的水平；以及

（iii）通过将所述测定到的PCT水平与预定的阈值水平进行比较， 来确定所述患者是否具有细菌感染。

本发明还涉及这样的方法在向表现出非特异性不适的患者给药抗 生素提供治疗指导、以及在监测抗生素治疗中的引用。

附图说明

图1：来到ED的具有非特异性不适、并且具有和不具有感染的患 者的PCT浓度（到院时）。

图2：用于在来到ED的具有非特异性不适的患者中诊断细菌感染 的ROC图。

图3：在BANC研究中具有非特异性不适的患者的鉴定。 发明详述

本发明涉及在表现出非特异性不适的患者中诊断或鉴定细菌感染 的方法。所述方法包括下列步骤：

（i）提供来自于表现出非特异性不适的患者的样品；

（ii）测定所述样品中降钙素原（PCT）或长度为至少12个氨基 酸、优选长度50以上个氨基酸、更优选长度110以上个氨基酸的其片 段的水平；以及

（iii）通过将所述测定到的PCT水平与预定的阈值水平进行比较， 来确定所述患者是否具有细菌感染。

在本发明的一个实施方案中，在表现出非特异性不适的患者中细 菌感染是无症状的（例如尚未显示出临床症状但存在的细菌感染）。

非特异性不适可以选自但不限于下列不适：“感觉不好”、“感 觉虚弱”、“感觉精疲力竭”、“疲倦或嗜睡”、感觉“晕眩”，缺 乏食欲，或仅仅主诉不能应付日常活动，或者患者可能不能回忆起他 们为何被送往ED。

特异性不适通常提供关键信息，并允许产生工作诊断或遵从预定 的诊断方案。特异性不适本身在文献中是认识清楚的，并且诊断方案 往往是适用的（Siegenthaler W.《内科学中的鉴别诊断：从症状到诊断》(Differential Diagnosis in Internal Medicine:From Symptom to Diagnosis），New York:Thieme Medical Publishers:2007）。

在特异性不适中存在着这样的不适，在所述不适中感染、特别是 细菌感染，通常被认为是不适的原因。这些特异性不适随着细菌的类 型和细菌感染的部位而变。这样的特异性不适可以选自但不限于下列 不适：头痛，身体特定部位（例如腹部）中的疼痛，发烧（>38℃）， 选自咳嗽、生痰、呼吸困难、呼吸急促和肋膜疼痛的呼吸症状，听诊 期间的一种发现（例如罗音、捻发音），感染的一种体征（核心体温> 38℃、颤抖）和消化道感染的一种体征（恶心、呕吐、腹泻）。

其他特异性不适概述如下：

细菌感染的经典症状是局部发红、发热、肿胀和疼痛。细菌感染 的标志之一是局部疼痛，身体特定部位中的疼痛。例如，如果发生割 伤并且它被细菌感染，将在感染位点处发生疼痛。细菌性咽喉痛常常 以咽喉的一侧更加疼痛为特征。如果疼痛仅仅发生在一只耳中，耳部 感染更可能是细菌性的。

如上所述，细菌感染的症状随着感染类型而不同。取决于被感染 的区域，症状可能变化。然而，总是会出现症状，即使当所述区域轻 微感染时也是如此。当在呼吸道中存在细菌感染时，发现与咽喉和呼 吸相关的症状。咽喉感染在生活在高污染地区的人中非常常见。肺炎 在自然免疫力非常低的儿童和老年人中非常常见。窦炎和咽炎也见于 患有细菌感染的人中。当呼吸道中存在细菌感染时，常常出现有色鼻 分泌物和头痛。

当消化道中存在感染时（例如胃肠炎），症状大多与消化问题相 关。通常发生胃的炎症和疼痛。腹泻和呕吐是指示肠胃道感染的其他 症状。作为严重细菌感染症状的结果，也可能发生恶心和脱水。

阴道区域中的臭味或鱼腥味是阴道感染的症状。女性阴道具有几 类对器官有益的细菌。然而，如果这种类型的细菌的产生不规则，它 可能引起感染。对于尿路感染来说，细菌感染的症状包括小便器官瘙 痒和疼痛。阴道感染和尿路感染不应被忽视，因为它们可能引起内部 器官的进一步炎症。

脑脊膜炎是覆盖脑和脊髓的膜的细菌感染的严重结果。尽管它也 可见于成年人，但婴儿对这种问题更加易感。脑脊膜炎的常见细菌感 染症状是身体和颈部僵硬、头痛、烦躁、发烧或低于正常体温以及皮 疹。

最危险的细菌感染引起脓毒症，这是一种引起致死性器官机能障 碍的严重病症。发烧和身体的重度颤抖是脓毒症的细菌感染症状。患 有脓毒症的患者还感觉关节疼痛。这必须被立即治疗以阻止感染蔓延 至内部器官。在脓毒症的情况下，患者将住院进行强化治疗。

丹毒是真皮的急性细菌感染，引起炎症。患者典型地在最初感染 的48小时内发生包括高烧、颤抖、寒战、头痛、呕吐的症状。红斑状 皮肤病变快速扩大，并具有界限明显的升高的边缘。它表现为红色、 肿胀、发热、硬化和疼痛的皮疹，在坚实度方面类似于橘皮。更严重 的感染可以引起水疱、大疱和瘀斑，并可能引起皮肤坏死。淋巴结可 能肿胀，并可能发生淋巴水肿。偶尔可见延伸至淋巴结的红线。感染 可能发生在皮肤的任何部位，包括面部、手臂、手指、腿和脚趾，但 是它倾向于偏好肢端。对感染最为易感的是脂肪组织，以及典型在眼、 耳和颊周围的面部区域。

腹膜炎是腹膜、即围住腹腔和内脏部分的浆膜的炎症。腹膜炎可 以是局部或广泛性的，并可能由感染引起（经常由中空器官的破裂造 成，正如在腹部创伤或阑尾炎中可能发生的）。腹膜炎的主要症候是 急性腹痛、腹部触痛和腹壁紧张。这些症候的位置取决于腹膜炎是局 部性（例如穿孔前的阑尾炎或憩室炎）还是遍布于整个腹部。在任一 种情况下，疼痛典型地作为广泛性腹痛（涉及内脏腹膜层的局部神经 支配不良）开始，并且在晚些时候可能变成局部性的（涉及体神经支 配的周壁腹膜层）。一部分胃肠道的穿孔和腹膜破裂是感染性腹膜炎 的最常见原因。

胆管炎是胆管的炎症。最常见的原因是细菌感染。胆管炎的典型 三联征是发烧、黄疸和右上腹部疼痛。

胆囊炎是胆囊的炎症，并通常表现为右上腹疼痛。这通常伴有低 度发烧、呕吐和恶心。

骨髓炎是指骨或骨髓的感染。一般来说，微生物可能通过三种基 本方法中的一种或多种感染骨：通过血流，与局部感染区域邻近，或 穿透性创伤，包括医源性原因例如关节置换或骨折的内部固定或根管 填充术后的牙齿。骨髓炎的体征和症状包括发烧、感染区域疼痛、感 染区域上肿胀、发热和发红。http://en.wikipedia.org/wiki/Infection:

“非特异性”不适的分类蕴含了ED医生的主观判断。这样的判 断依赖于与医生相关的因素，例如临床经验和技巧以及对可能指导进 一步评估的不同不适进行权重。与患者相关的因素包括以言语表达不 适的能力或患者的认知状态。作为一般性范围，NSC的定义旨在缩小 患者分类中的主观性，并且由此促进结构化的主动的患者管理。

特异性不适通常提供关键信息，并允许产生工作诊断或遵从预定 的诊断方案。特异性不适本身在文献中是认识清楚的，并且诊断方案 经常是适用的（Marx J A,Hockberser R,Walls R.《Rosen急诊医学：概 念和临床》（Rosen′s Emergency Medicine:Conceptsand Clinical），第六版，St Louis:Mosbv主编，2005；Siegenthaler W.《内科学中的鉴别诊断：从症状到诊断》(Differential Diagnosis in Internal Medicine:From Symptomto Diagnosis），New York:Thieme Medical Publishers:2007）。

与特异性不适相反，NSC作为所有不适的整体来定义，这样的不 适不是成组的特异性不适或体征的一部分，或者在这样的情况下不能 建立初始工作诊断。优选将NSC定义为排除特异性不适后的剩余病症， 因为主动性定义可能需要几乎无限地枚举可能的非特异性不适。这种 长且复杂的定义可能排除某些NSC患者，因为他们的症状不能与预定 的名单完全匹配。因此，在本申请中提供的NSC名单可能不完整。在 本发明的NSC定义的情形中，术语工作诊断用于患者表现出NSC、但 根据在显现时的事实和发现仍可能进行诊断的情形（例如表现出虚弱 和贫血性苍白的患者）。

图3以程式性方式归纳了该定义。在最优选实施方案中，非特异 性不适被定义为根据图3可以被包含的不适。这意味着本发明的患者 不表现出下列不适之一：疼痛（胸、腹、头、腿、关节、背），呼吸 困难，咳嗽，虚弱（局部），中风样症状，肢端（腿、手臂）肿胀， 腹泻，排尿困难，GCS<14，意识不清，中毒，抽搐，出血，晕厥， 焦虑，精神症状，自杀意念，皮肤病变，过敏性皮肤反应，发烧，眩 晕，心悸，恶心伴有呕吐，外伤。此外，对于在初始评估（病史、身 体检查、ECG读取）后是否存在引起标准化检查或治疗的主要不适这 一问题，答案是“否”。此外，在所述患者中，生命指征（体温，脉 搏或心率，血压和呼吸率）都不超出范围。此外，在初始评估后不能、 特别是不能以足够的确定性建立工作诊断。

在本发明的非常特别的实施方案中，从具有NSC的所述患者组中 优选排除了患有原发疾病的那些患者，这样的原发疾病优选不是感染 和/或优选选自动脉硬化、心力衰竭、急性冠脉综合征、冠心病、心肌 梗塞、癌症、糖尿病、慢性胃肠疾病、慢性肾病、高血压、骨科疾病 包括骨质疏松症、和神经变性疾病包括阿兹海默氏病。

在本发明的情形中，术语“水平”涉及在从对象获取的样品中PCT （或前体/片段）的浓度（优选用重量/体积来表示；w/v）。

本文中使用的术语“患者”是指由于疾病而接受医疗护理或应接 受医疗护理的活的人类或非人类生物体。这包括患有正对其病理体征 进行研究的未确定疾病的人。因此，本文描述的方法和分析方法适用 于人类和兽医疾病两者。

当在本文中使用时，术语“样品”是指出于对目标对象例如患者 进行诊断、预后或评估的目的而获得的体液样品。优选的测试样品包 括血液、血清、血浆、脑脊液、尿液、唾液、痰液和胸腔积液。此外， 本技术领域的专业人员将会认识到，某些测试样品在分级或纯化程序、 例如将全血分离成血清或血浆组分后，将更容易分析。

因此，在本发明的优选实施方案中，样品选自血液样品、血清样 品、血浆样品、脑脊液样品、唾液样品和尿液样品，或上面提到的任 何样品的提取物。优选，样品是血液样品，最优选为血清样品或血浆 样品。

当在本文中在蛋白质或肽的情形中提到时，术语“片段”是指可 以源自于较大的蛋白质或肽的较小蛋白质或肽，因此其包含较大蛋白 质或肽的部分序列。所述片段可以从较大的蛋白质或肽通过其一个或 多个肽键的皂化来产生。

在本发明的情形中，降钙素原优选是指跨越氨基酸残基1-116、 2-116或3-116的肽或其片段。因此，降钙素原片段的长度为至少12 个氨基酸，优选50个以上氨基酸，更优选110个以上氨基酸。PCT可 以包含翻译后修饰例如糖基化、脂质化或衍生化。PCT本身是降钙素 和钙抑肽的前体。PCT 1-116的氨基酸序列在SEQ ID NO:1中给出。

在本发明的情形中，“诊断”涉及对象中细菌感染的识别和（早 期）检测，并且也可以包含鉴别诊断。

诊断测试的灵敏度和特异性不仅取决于测试的分析“质量”，而 且它们还取决于构成异常结果的定义。在实践中，典型地通过将“正 常”（即表观健康的）和“患病”群体（即患有感染的患者）的变量 值对其相对频率进行作图，计算出接受者工作特征曲线（ROC曲线）。 取决于所致力解决的具体诊断问题，参比组绝不一定是“正常的”， 而可以是患有另一种疾病或病症的患者组，所述患者组应与目标疾病 组区分开。对于任何特定标志物来说，患有或未患疾病的对象的标志 物水平分布可能交叠。在这些条件下，测试不能以100%准确性绝对辨 别正常与疾病，并且交叠的区域表示测试不能辨别正常与疾病的地方。 选择一个阈值，高于它（或低于它，取决于标志物随着疾病如何变化） 时测试被认为是异常的，低于它时测试被认为是正常的。ROC曲线下 的面积是察觉到的测量值将允许正确鉴定病症的概率的度量。即使在 测试结果不一定给出准确数字的情况下，ROC曲线也能使用。只要人 们能够对结果排序，人们即可产生ROC曲线。例如，对“患病”样品 进行的测试的结果可以按照程度排序（例如1=低，2=正常，3=高）。 这种排序可以与“正常”群体中的结果相关联，并产生ROC曲线。这 些方法在本技术领域中是公知的（参见例如Hanley等，1982.Radiology143:29-36）。优选，所选的阈值能够提供大于约0.5、更优选大于约 0.7的ROC曲线面积。在这种语境中，术语“约”是指给定测量值的 +/-5%。

ROC曲线的水平轴表示（1-特异性），其随着假阳性率而增加。 曲线的垂直轴表示灵敏度，其随着真阳性率而增加。因此，对于所选 的具体截止值来说，可以测定（1-特异性）的值，并可以获得相应的灵 敏度。ROC曲线下的面积是测量到的标志物水平将允许正确鉴定疾病 或病症的概率的度量。因此，ROC曲线下的面积可用于确定测试的有 效性。

按照本发明的方法，当所述测定到的PCT水平高于预定阈值水平 时，患者被诊断为具有细菌感染。优选，预定阈值水平在0.02至0.5 ng/mL之间，更优选在0.02ng/mL至0.25ng/mL之间，更加优选在0.02 ng/mL至0.1ng/mL之间，更加优选在0.02ng/mL至0.06ng mL之间， 最优选在0.02ng/mL至（低于）0.05ng/mL之间。在优选实施方案中， 当所述测定到的PCT水平高于0.1ng/mL、优选高于0.05ng/mL、更优 选高于0.025ng/mL时，患者被诊断为具有细菌感染。

这些值使用PCT测试格式（灵敏型BRAHMS PCT LIA）来测定， 其在定量测量范围内与自动化PCT分析法（灵敏型BRAHMS RYPTOR PCT）具有相同的校准。BRAHMS PCT LIA灵敏型能够在正常群体中 定量测定PCT水平，给出中值PCT水平，如EP 09011073.5（“用于 在无症状群体中诊断不良事件的降钙素原（Procalcitonin for the  prognosis of adverse events in the asymptomatic population）”）中所述。 在其他PCT分析法中，如果它们与灵敏型BRAHMS PCT LIA进行的 校准不同，上面提到的值可能不同。因此，在考虑到校准的差别后， 上面提到的值将适用于这样的校准不同的PCT分析法。一种可能的校 准差别的定量，是通过使用这两种方法测量样品中的PCT，对所讨论 的PCT分析法与灵敏型BRAHMS PCT LIA进行方法比较分析（关联 性）。另一种可能是只要所讨论的PCT分析法具有足够的分析灵敏度， 使用该分析法测定代表性正常群体的中值PCT水平，如EP 09011073.5 （“用于在无症状群体中诊断不良事件的降钙素原（Procalcitonin for the  prognosis of adverse events in the asymptomatic population）”）中所述 将结果与所述中值PCT水平进行比较，并根据该比较获得的差异来重 新计算校准。

在本文中，PCT或片段或其前体或片段的水平的测定，使用检测 方法和/或诊断分析法来执行。

当在本文中提到时，“分析法”或“诊断分析法”可以是在诊断 学领域中应用的任何类型的分析法。这样的分析法可以基于待检测的 分析物与具有一定亲和性的一种或多种捕获探针的结合。对于捕获分 子与靶分子或目标分子之间的相互作用来说，亲和常数优选大于10⁸M^-1。

在本发明的上下文中，“捕获分子”是可用于结合来自样品的靶 分子或目标分子、即分析物（即在本发明的情况下是心血管肽）的分 子。因此，捕获分子必须在空间上和表面特征例如表面电荷、疏水性、 亲水性、是否存在路易斯供体和/或受体上适当塑造，以特异性结合靶 分子或目标分子。因此，结合可以由例如捕获分子与靶分子或目标分 子之间的离子、范德华、π-π、δ-π、疏水或氢键相互作用或两种以上上 面提到的相互作用的组合来介导。在本发明的情形中，捕获分子可以 例如选自核酸分子、糖类分子、RNA分子、蛋白质、抗体、肽或糖蛋 白。优选，捕获分子是抗体，包括与靶或目标分子具有足够亲和性的 其片段，并包括重组抗体或重组抗体片段，以及所述抗体的化学和/或 生物化学修饰的衍生物或源自于长度为至少12个氨基酸的其变异链的 片段。

优选的检测方法包括各种格式的免疫分析法，例如放射免疫分析 法（RIA）、化学发光和荧光免疫分析法、酶联免疫分析法（ELISA）、 基于Luminex的珠子阵列、蛋白质微阵列分析法，以及快速检测格式 例如免疫层析试条测试。

分析法可以是均相或非均相分析法、竞争和非竞争性夹心分析法。 在特别优选的实施方案中，分析法采用夹心分析法形式，其是非竞争 性免疫分析法，其中待检测和/或定量分子与第一抗体并与第二抗体结 合。第一抗体可以结合到固相例如珠子上、孔或其他容器的表面上、 芯片或试条上，并且第二抗体是例如用染料、放射性同位素或反应性 或催化活性部分标记的抗体。然后通过适合的方法测量与分析物结合 的标记抗体的量。“夹心分析法”所涉及的通用组合物和程序是久已 确立的，并为专业技术人员所公知。（《免疫分析手册》（The Immunoassay Handbook），David Wild主编，Elsevier LTD,Oxford；第三版(2005年5月），ISBN-13:978-0080445267；HultschigC等，Curr Opin Chem Biol.2006Feb;10(1):4-10.PMID:16376134，在此引为参 考）。

在特别优选的实施方案中，分析方法包含两种捕获分子，优选为 二者都作为在液体反应混合物中分散体而存在的抗体，其中第一种标 记组分附着在第一种捕获分子上，其中所述第一种标记组分是基于荧 光或化学发光淬灭或扩增的标记系统的一部分，并且所述标记系统的 第二种标记组分附着于第二种捕获分子上，使得当两种捕获分子与分 析物结合后产生可测量信号，允许检测在包含样品的溶液中形成的夹 心复合物。

更加优选，所述标记系统包含稀土穴状化合物或稀土螯合物与荧 光染料或化学发光染料、特别是花青类型的染料的组合。

在本发明的情形中，基于荧光的分析法包含使用染料，所述染料 可以例如选自FAM（5-或6-羧基荧光素）、VIC、NED、荧光素、荧 光素异硫氰酸酯（FITC）、IRD-700/800、花青染料例如CY3、CY5、 CY3.5、CY5.5、Cy7、占吨、6-羧基-2’,4’,7’,4,7-六氯荧光素（HEX）、 TET、6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基荧光素（JOE）、N,N,N',N'-四 甲基-6-羧基罗丹明（TAMRA）、6-羧基-X-罗丹明（ROX）、5-羧基罗 丹明-6G（R6G5）、6-羧基罗丹明-6G（RG6）、罗丹明、罗丹明绿、 罗丹明红、罗丹明110、BODIPY染料例如BODIPY TMR、俄勒冈绿、 香豆素类例如伞形酮、苯并亚胺类例如Hoechst 33258；菲啶类例如德 克萨斯红、雅吉瓦黄、Alexa Fluor、PET、溴化乙锭、吖啶类染料、咔 唑染料、吩噁嗪染料、卟啉染料、聚甲炔染料等。在本发明的情形中， 基于化学发光的分析法包含根据化学发光材料的物理原理使用染料， 所述原理描述在Kirk-Othmer的《化学技术全书》（Encyclopedia of  chemical technology）第四版，J.I.Kroschwitz执行主编，M.Howe-Grant 编辑，John Wiley &Sons,1993,vol.15,p.518-562中，在此引为参考， 包括在551-562页中的引用文献。优选的化学发光染料是吖啶酯。

正如本技术领域的专业人员所知，用本发明的方法可能诊断的细 菌感染可以用适合的抗生素来治疗。可能的抗生素类别选自青霉素类 （例如氟氯西林、阿莫西林、氨苄西林、美洛西林），头孢菌素类（例 如头孢唑啉、头孢呋辛、头孢噻肟、头孢克洛、头孢氨芐），β-内酰胺 酶抑制剂（例如舒巴坦、他佐巴坦），四环素类（例如多西环素、米 诺环素、四环素、土霉素），氨基糖苷类（例如庆大霉素、新霉素、 链霉素），大环内酯类抗生素（例如阿奇霉素、克拉霉素、红霉素、 罗红霉素、螺旋霉素、克林霉素），林可酰胺类（例如林可霉素）， 旋转酶抑制剂（例如环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星），磺胺类，甲 氧苄啶类，糖肽类抗生素（例如万古霉素），多肽类抗生素（例如多 粘菌素E、多粘菌素）和酰胺醇类（例如氯霉素）。

此外，本发明涉及包含针对PCT或其片段或针对PCT前体或其片 段的一种或多种抗体的试剂盒在具有非特异性不适的患者中诊断细菌 感染的用途。

实施例

入院时提供了近期外部实验室结果或特定ECG变化（例如 STEMI）的任何患者是不合格者。同样地，送到ED的患有已知晚期医 学病症（例如末期癌症）的患者是不合格者。如果患者血液动力学不 稳定或者如果重要参数明显在正常范围之外（例如收缩压<90mmHg， 心率>120/min，体温>38.4或<35.6℃，呼吸速率>30/min），将他们排 除。

感染的诊断

在研究中总共包括了415位患者。这415位患者中有86位被诊断 患有细菌感染（肺炎n=19，膀胱炎n=17，尿路感染n=8，脓毒症n=7， 尿脓毒症n=10，脓毒性休克n=1，支气管炎n=3，未知局部感染n=9， 腹膜炎n=1，骨髓炎n=,1，σ-憩室炎n=1，结肠炎n=1，COPD伴有急 性恶化n=2，胆管炎n=1，胆囊炎n=,1，丹毒n=2，胃肠炎n=2）。

在本研究中，感染的诊断按照标准判据来进行：温度>37.5℃，白 细胞计数>11000/mL或<4000/mL，胸部x-射线上肺部浸润，或病原体 培养物阳性。

如上所概述的，这415位患者中的86位被诊断患有细菌感染（例 如LRTI、尿路感染、脓毒症、脓毒性休克）。下呼吸道感染（LRTI） 包括急性支气管炎、慢性阻塞性肺病（COPD）的急性恶化和肺炎。患 有LRTI的患者表现出选自咳嗽、生痰、呼吸困难、呼吸急促和肋膜疼 痛的至少一种呼吸道症状，以及此外听诊期间的至少一种发现（罗音、 捻发音）或感染体征之一（核心体温>38℃，颤抖，白细胞计数>10G/l 或<4G/l个细胞）。尿路感染（UTI）的诊断是基于下述判据中的两个： 发烧（>38℃），尿样对亚硝酸盐阳性，白细胞尿和显著细菌尿。脓毒 症、重症脓毒症和脓毒性休克按照标准判据来定义（Levy等，《001年SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS国际脓毒症定义大会》（2001SCCM/ESICM/A CCP/A TS/SIS    International    Sepsis Definitions Conference）.Crit Care Med 2003;31:1250-1256）。

PCT的测量

如Morgenthaler等（Morgenthaler等2002.Clin Chem 48:788-790） 中所述，使用功能分析灵敏度为0.007ng/mL的超灵敏可商购测试系统 来测量PCT。简单来说，产生针对PCT的降钙素部分的绵羊抗体，并 产生针对PCT的钙抑肽部分的小鼠单克隆抗体。将试管用抗钙抑肽抗 体包被。将抗降钙素抗体用MACN吖啶酯标记（InVent GmbH, Hennigsdorf，德国）并用作示踪剂。将重组PCT在正常马血清中的稀 释液用作校准物。将100μL样品或标准品在包被的试管中温育30分钟， 加入200μL示踪剂。在进一步温育2小时后，将试管用1mL LIA清 洗溶液（BRAHMS AG,Hennigsdorf，德国）清洗4次，并使用LB952T 照度计（Berthold,Wildbad，德国）测量结合的化学发光。

结果

在研究中包括总共415位患者。具有非特异性不适的患者在来到 急诊部后立即测定其血浆样品中的降钙素原水平。这415位患者中的 86位被诊断患有细菌感染。具有非特异性不适并患有和未患细菌感染 的患者的PCT浓度显示在图1中。患有细菌感染的患者与未患细菌感 染的患者相比，PCT浓度明显更高（p<0.0001）。ROC图分析揭示出 曲线下面积（AUC）为0.721（p<0.0001）（图2）。使用了不同的截 止值来确定相应的灵敏度和特异性（表1）。

序列

SEQ ID NO：1（PCT的氨基酸序列）：

1     APFRSALESS PADPATLSED EARLLLAALV QDYVQMKASE LEQEQEREGS

51     SLDSPRSKRC GNLSTCMLGT YTQDFNKFHT FPQTAIGVGA PGKKRDMSSD

101    LERDHRPHVS MPQNAN

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种用于在来到急诊部的具有非特异性不适的患者中诊断细 菌感染的方法，所述方法包括下列步骤：

（i）提供来自于表现出非特异性不适的患者的样品；

（ii）测定所述样品中降钙素原（PCT）或其长度为至少12个氨 基酸的片段的水平；以及

（iii）通过将所述测定到的PCT水平与预定的阈值水平进行比较， 来确定所述患者是否具有细菌感染，

其中所述预定的阈值水平在0.02ng/mL至0.25ng/mL之间。

2.权利要求1的方法，其中所述样品是体液，特别是血液、血清、 血浆、脑脊液、尿液、唾液或胸腔积液。

3.权利要求1和2的方法，其中所述PCT片段或PCT前体的片 段具有至少12个氨基酸残基的长度。

4.权利要求1至3的方法，其中所述预定的阈值水平在0.02ng/mL 至0.1ng/mL之间，更优选在0.02ng/mL至0.06ng/mL之间，最优选 在0.02ng/mL至（低于）0.05ng/mL之间。

5.权利要求1至4的方法，其中当所述测定到的PCT水平高于所 述预定的阈值水平时，所述患者具有细菌感染。

6.权利要求1至5的方法，其使用功能分析灵敏度低于0.06ng/mL 的PCT检测分析法。

7.权利要求1至6的方法，其中所述细菌感染选自下呼吸道感染、 感染、尿路感染、阴道感染、脓毒症、重症脓毒症、脓毒性休克、消 化道感染、腹膜炎、膀胱炎、结肠炎、细菌性脑膜炎、窦炎、咽炎、 胆管炎、胆囊炎、骨髓炎、丹毒、腹膜炎、胆管炎、胆囊炎、骨髓炎。

8.权利要求1至7的方法，其中所述细菌感染可以用抗生素治疗。

9.权利要求1至8的方法，其中所述细菌感染没有细菌感染的临 床症状。

10.权利要求1至9的方法，其还包括下列步骤：

（iv）向患者给药抗生素或不给药抗生素。

11.权利要求1至9的方法，其还包括下列步骤：

测定至少一种其他标志物例如C-反应性蛋白（CRP）的水平。

12.权利要求1至11的方法在向来到急诊部的具有非特异性不适 的患者给药抗生素提供治疗指导的用途。

13.权利要求1至11的方法在使用抗生素治疗来到急诊部的具有 非特异性不适的患者中的用途。