复杂天然产物中活性成分筛选方法及应用

摘要

本发明提供一种复杂天然产物中活性成分快速筛选方法，采用多通道高效液相色谱作为分离单元、质谱作为联用的检测分析单元、各型号孔板自动馏分收集仪作为收集单元与药效活性评价单元，构成一体化的天然产物分离分析与活性快速筛选系统，可一次得到多块孔板，可进一步进行基于细胞、酶或者化学反应的活性评价，活性筛选数据又可以与分析检测数据进行比对分析得到活性化合物信息，实现了分离制备、分析检测与活性筛选的连贯结合。本发明具有快速分离、自动收集和与药效筛选紧密结合等显著优点，具有速度快、成本低、信息量丰富、样品要求低等优势。可用于复杂天然产物中活性成分的筛选。

说明书

技术领域

本发明属天然药物筛选领域，具体地说是涉及一种从中药及天然产物等复杂天然产物中快速分离制备、分析和活性评价的一体化方法，用于复杂天然产物中活性化合物的筛选。

背景技术

天然产物中含有丰富的具有生物活性的成分，是开发新药候选化合物的巨大资源库。但是目前针对天然药物的开发并没有形成如化学药物开发那样的规模，其中最大的技术难度在于天然产物的分离制备与高通量筛选的样品要求之间存在差距。常规的植化方法大都采用有机溶剂对天然产物进行系统分离，制得的样品需要干燥、称量、溶解、配制、加样等一系列步骤后才能在微孔板中进行高通量筛选，存在耗时耗力等问题。因此，开发一种快速分离制备与活性评价紧密结合的系统可以极大地提高天然药物中活性化合物发现的速度。

目前，国内外针对天然产物中活性化合物的快速筛选发现已提出了几种研究思路，如构建多通道逆流色谱与高通量分馏相结合构建的自动化组分制备系统，已应用于一些中药复方的组分快速制备；又如应用液相色谱与傅里叶变换质谱联用，结合微孔板分光光度计来筛选柴胡疏肝散中的抗氧化活性成分。这些分离筛选方法，可以提高天然产物中活性成分筛选效率，降低实验成本和时间。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种复杂天然产物中活性成分筛选方法，是一种在复杂天然产物中通过并行分离制备、分析筛选活性成分的方法，通过以下步骤实现： 

（1）样品并行制备

将待测样品（天然产物提取物、中药提取物或含多种化学成分的混合物样品）配制成溶液，分别取10-50μL溶液，通过自动进样器或手动进样器注入并行制备系统，并行制备系统由二元液相色谱泵，5根并行连接的色谱柱以及4台馏分收集仪组成（可根据需求扩展），将其中4根色谱柱的洗脱液，采用4台自动馏分收集仪分别收集至4块微孔板，每孔中馏分体积根据微孔板容积确定。

（2）样品分析

　　将上述并行制备系统中剩余1根色谱柱的洗脱液通过管线与紫外/可见光检测器相连，然后再接入电喷雾－质谱仪，对步骤(1)制备的样品进行定性分析。

（3）样品处理

　　通过常规离心浓缩等方法，挥干4块收集有相同馏分的微孔板中的溶液，再加入一定量溶剂溶解后，作为活性评价的待测样品。

（4）活性评价

　　在微孔板上，采用基于细胞、酶或者化学反应的活性评价方法对微孔板中各孔对应的馏分的活性进行评价，发现其中具有显著活性的馏分。基于细胞的活性评价方法包括肿瘤细胞的细胞活力测试、损伤的内皮细胞及心肌细胞活力测试等，可用于评价馏分的抗肿瘤、内皮保护及心肌保护活性。基于酶的活性评价方法包括alpha-葡萄糖苷酶、脂肪酶、酪氨酸酶、乙酰胆碱酯酶等酶活力测试，可用于评价馏分的酶抑制活性；基于化学反应的活性评价方法包括自由基清除活力测试，可用于评价馏分的抗氧化活性。

（5）活性成分筛选

综合处理液相色谱－质谱联用分析数据和活性评价数据，确定活性馏分在液相色谱－质谱联用分析图谱中的位置，并进一步提取与该馏分相对应的化合物的紫外光谱、分子量、分子碎片等化学信息，推断活性化合物结构，筛选出活性成分。通过制备纯化目标化合物或购买目标化合物标准品等方式，获取活性成分，再采用活性评价方法验证目标化合物的药效活性。

本发明的另一个目的是提供所述方法在复杂天然产物中筛选活性成分中的应用。所述复杂天然产物包括天然产物提取物、中药提取物或含多种化学成分的混合物。

本发明应用多通道高效液相色谱作为分离单元、质谱作为联用的检测分析单元、各型号孔板自动馏分收集仪作为收集单元与药效活性评价单元，上述单元构成了一体化的天然产物分离分析与活性快速筛选系统。/可见光检测器相连然后与电喷雾质谱仪相连，构成一体化的分离分析检测系统；从高效液相泵分出来的另一路管线与多个进样器相连后与多通道并行的色谱柱连接作为并行分离系统，然后通过毛细管与各型号孔板自动馏分收集仪连接作为自动收集系统，在本系统进行分离制备后可一次得到多块孔板，可进一步进行基于细胞、酶或者化学反应的活性评价，活性筛选数据又可以与分析检测数据进行比对分析得到活性化合物信息，实现了分离制备、分析检测与活性筛选的连贯结合。[51] 

本发明提供了一种针对复杂样品的并行分离制备、分析和自动收集方法，使之具有能与药效活性筛选连贯结合的特点，具有快速分离、自动收集和活性快速筛选结合等显著优点。该系统的优点在于采用5通道并行液相色谱进行天然产物的分离，并能够将样品直接制备到匹配的微孔板中，用于活性快速筛选。

本发明可实现与药效活性筛选连贯结合，具有快速分离、自动收集和与药效筛选紧密结合等显著优点，可以同时进行天然产物的分离制备与分析，通过与基于微孔板的活性快速筛选方法相结合，能够快速得到样品中活性成分并进行鉴定，相比于传统的分离制备然后活性筛选的方法有速度快、成本低、信息量丰富、样品要求低等优势。本发明采用多通道并行液相色谱进行天然产物的分离，并能够将经液相色谱分离的馏分直接收集到相匹配的微孔板中，制备出微量组分，用于活性快速筛选；在制备的同时能够对天然产物进行分析，从而通过分子量等鉴定潜在的活性化合物，因此具有高效、低成本等优点。

附图说明

图1为并行制备、分析与活性快速筛选系统基本原理图。

图2为桑叶提取物中抗氧化活性成分筛选结果图。

图3为冬凌草提取物中抗肿瘤活性成分筛选结果图。

图4为七个化合物混合样品溶液中抗氧化活性成分筛选结果图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。

本发明的整个系统由多通道高效液相色谱作为分离单元、质谱作为联用的检测分析单元、各型号孔板自动馏分收集仪作为收集单元与药效活性评价单元，整个系统可由计算机进行控制，实现被分离样品的光谱与质谱信号的自动采集分析。自动馏分收集系统和离心浓缩系统设置可需要根据不同样品的色谱条件进行相应的更改。完成活性测试后，将得到的活性数据与光谱、质谱等化合物数据进行对照吻合分析，可以快速分析得到复杂天然产物混合物中具有相应药理活性的化合物。

实施例1

参见图1，本系统由5通道高效液相色谱分离单元、4台96孔板自动馏分收集单元、1台质谱仪组成、1台离心浓缩仪和活性筛选系统组成。该并行分离制备、分析快速筛选活性成分的方法，可通过以下步骤实现：

（1）样品并行制备

将天然产物提取物、中药提取物或含多种化学成分的混合物样品用50%甲醇－水（体积比）溶液，配成25mg/mL浓度的样品，分别取20μL溶液，通过Agilent 1100液相色谱的自动进样器及4个D-14163手动进样器（德国Knauer公司）注入并行制备系统。并行制备系统由Agilent 1100二元液相色谱泵，5根并行连接的Zorbax SB C₁₈色谱柱（4.6mm*250mm, 5μm粒径）以及4台FoxyR1馏分收集仪（美国Teledyne公司）组成。将其中4根色谱柱的洗脱液，采用自动馏分收集仪分别收集至4块96孔板(Corning公司)中。液相色谱的流动相条件为流动相为0.05%甲酸-水与乙腈溶液，流速为0.4 mL/min，进样量为20 μL，柱温为30℃。洗脱梯度：0-20 min，乙腈（20%-60%）；20-21 min，乙腈（60%-80%）；21-35 min，乙腈（80%-95%）。

（2）样品分析

　　将上述并行制备系统中，剩余1根色谱柱的洗脱液通过管线与Agilent 1100型光电二极管阵列检测器(DAD检测器)相连，然后再接入Finnigan LCQ Deca XP^Plus型电喷雾离子阱质谱仪，对步骤(1)制备的样品进行定性分析。DAD检测器检测范围为190-400nm；质谱条件为：鞘气（氮气），辅助气（氮气），裂解电压为 3.5 KV，离子源温度为 350 ℃，扫描质荷比范围为100-1000m/z。

（3）样品处理

　　将步骤1制备得到的4块96孔板，采用SpeedVac 离心浓缩仪 (美国Thermo Electron, 公司)离心浓缩仪，冷冻浓缩2小时挥干溶剂。在96孔板中每孔加入5%乙醇溶液，溶解后作为待测样品。

（4）活性评价

　　在96板上，采用基于细胞、酶或者化学反应的活性评价方法对各孔对应的馏分的活性进行评价，发现其中具有显著活性的馏分。采用的活性评价模型包括但不限于：抗氧化活性评价、抗肿瘤细胞增殖活性评价、alpha-葡萄糖苷酶抑制活性评价、脂肪酶抑制活性评价。基于酶的活性评价方法包括alpha-葡萄糖苷酶、脂肪酶、酪氨酸酶、乙酰胆碱酯酶等酶活力测试，可用于评价馏分的酶抑制活性；基于化学反应的活性评价方法包括自由基清除活力测试，可用于评价馏分的抗氧化活性。

（5）活性成分发现

综合处理液相色谱－质谱联用分析数据和活性评价数据，确定活性馏分在液相色谱－质谱联用分析图谱中的位置，采用Xcalibur软件(美国Thermo公司)进一步提取与该馏分相对应的化合物的紫外吸收光谱、分子量等信息，推断活性化合物结构，筛选出活性成分。通过制备纯化目标化合物或购买目标化合物标准品等方式，获取活性成分，再采用活性评价方法验证目标化合物的药效活性。

实施例2  本发明方法在桑叶提取物中筛选抗氧化活性成分中的应用

桑叶提取物制备：250 g药材，用70%乙醇回流提取2次，每次2小时后用D101大孔树脂纯化以后，再过聚酰胺纯化，50%的乙醇冲洗下来的样品，浓缩至干燥后，再用50%甲醇-水复溶至25 mg/mL，配置好的溶液混匀后离心（10000 rpm，10 min），取上清液减压浓缩干燥后作为并行制备样品。按以下步骤进行活性化合物发现：

(1) 样品并行制备　将桑叶提取物用50%甲醇－水（体积比）溶液，配成25mg/mL浓度的样品，分别取20μL溶液，通过Agilent 1100液相色谱的自动进样器及4个D-14163手动进样器（德国Knauer公司）注入并行制备系统。并行制备系统由Agilent 1100二元液相色谱泵，5根并行连接的Zorbax SB C₁₈色谱柱（4.6mm*250mm, 5μm粒径）以及4台FoxyR1馏分收集仪（美国Teledyne公司）组成。将其中4根色谱柱的洗脱液，采用自动馏分收集仪分别收集至4块96孔板(Corning公司)中。色谱条件为：流动相为0.05%甲酸-水与乙腈溶液，流速为0.4 mL/min，进样量为20 μL，柱温为30℃。洗脱梯度：0-20 min，乙腈（20%-60%）；20-21 min，乙腈（60%-80%）；21-35 min，乙腈（80%-95%）。

(2) 样品分析　将上述并行制备系统中，剩余1根色谱柱的洗脱液通过管线与Agilent 1100型光电二极管阵列检测器(DAD检测器)相连，然后再接入Finnigan LCQ Deca XP^Plus型电喷雾离子阱质谱仪，对步骤(1)制备的样品进行定性分析。DAD检测器检测范围为190-400nm；质谱条件为：鞘气（氮气），辅助气（氮气），裂解电压为 3.5 KV，离子源温度为 350 ℃，扫描质荷比范围为100-1000m/z。

(3) 样品处理　将步骤1制备得到的4块96孔板，采用SpeedVac 离心浓缩仪 (美国Thermo Electron, 公司)离心浓缩仪，冷冻浓缩2小时挥干溶剂。在96孔板中每孔加入5%乙醇溶液，溶解后作为待测样品。

(4) 抗氧化活性评价　采用DPPH法测定96孔板中桑叶各馏分的抗氧化活性。在样品板中10个空白孔内加入维生素C作为阳性药，再每孔加入100 μL水和100 μL DPPH的乙醇溶液（500 μmol/L），震荡孵育1 h（700 rpm, 37 ℃）。然后采用ELx800型酶标仪（美国Biotek公司）在 517 nm波长下测定空白对照板和样品板的吸光度，并计算DPPH的清除率：清除率 (%) = [1- (OD^sample - OD^blank) / OD^control ]′100。（OD^control是阴性对照样吸光值(溶剂+ DPPH)；OD^sample是样品吸光值；OD^blank是空白对照吸光值（纯溶剂））。

(5) 活性化合物发现　结果参见附图2，图中共有六个色谱峰对应的馏分具有显著的DPPH清除作用，其清除率均高于40%。通过分析液相色谱-质谱联用分析数据，得到各色谱峰对应的化合物分别为绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、芦丁、陆地棉苷和烟花苷，其质谱碎片信息和分子离子峰数据如表1所示。结合验证试验和文献报道，发现这6个化合物均具有较好的抗氧化活性。

实施例3  本发明在冬凌草提取物中筛选抗肿瘤活性成分的应用。

冬凌草提取物样品制备：250 g药材，用70%乙醇回流提取2次，每次2小时后用ODS反相硅胶柱分离，分别用5%和60%的甲醇冲洗，取60%甲醇冲洗下来的样品，浓缩至干燥后，用50%甲醇-水复溶至25 mg/mL，配置好的溶液混匀后离心（10000 rpm，10 min），取上清液减压浓缩得浸膏作为待分离样品。按以下步骤进行活性化合物发现：

(1) 样品并行制备　将冬凌草提取物用50%甲醇－水（体积比）溶液，配成25mg/mL浓度的样品，分别取20μL溶液，通过Agilent 1100液相色谱的自动进样器及4个D-14163手动进样器（德国Knauer公司）注入如实施例1所述的并行制备系统。并行制备系统由Agilent 1100二元液相色谱泵，5根并行连接的Zorbax SB C₁₈色谱柱（4.6mm*250mm, 5μm粒径）以及4台FoxyR1馏分收集仪（美国Teledyne公司）组成。将其中4根色谱柱的洗脱液，采用自动馏分收集仪分别收集至4块96孔板(Corning公司)中。色谱条件为：流动相为0.05%甲酸-水与乙腈溶液，流速为0.4 mL/min，进样量为20 μL，柱温为30℃。洗脱梯度：0-20 min，乙腈（20%-60%）；20-21 min，乙腈（60%-80%）；21-35 min，乙腈（80%-95%）。

(2) 样品分析　将上述并行制备系统中，剩余1根色谱柱的洗脱液通过管线与Agilent 1100型光电二极管阵列检测器(DAD检测器)相连，然后再接入Finnigan LCQ Deca XP^Plus型电喷雾离子阱质谱仪，对步骤(1)制备的样品进行定性分析。DAD检测器检测范围为190-400nm；质谱条件为：鞘气（氮气），辅助气（氮气），裂解电压为 3.5 KV，离子源温度为 350 ℃，扫描质荷比范围为100-1000m/z。

(3) 样品处理　将步骤(1)制备得到的4块96孔板，采用SpeedVac 离心浓缩仪 (美国Thermo Electron, 公司)离心浓缩仪，冷冻浓缩2小时挥干溶剂。在96孔板中每孔加入5%乙醇溶液，溶解后作为待测样品。

(4) 抗肿瘤细胞增殖活性评价　将步骤(3)制得的待测样品置于超净台紫外线下照射杀菌1h，在每孔中加入100 μL细胞培养液，使微孔板上收集得到的组分溶解；接着各孔接种HL-60细胞，种板密度为1×10⁵个/mL，同时设定正常组和阳性对照组（终浓度为4 μM阿霉素），将培养板置于37℃，5% CO₂环境的细胞培养箱中，孵育48 h后，采用ELx800型酶标仪（美国Biotek公司）MTT法测定细胞活力。以正常组为对照，计算其他各组相对于正常组的存活细胞比例。

(5) 活性化合物发现　结果参见附图3，图中共有4个色谱峰对应的馏分具有显著的抑制肿瘤细胞增殖作用，加入孔中肿瘤细胞存活率均低于22.4%（即2μM阳性药阿霉素作用下的细胞存活率）。通过分析液相色谱-质谱联用分析数据，得到各色谱峰对应的化合物分别为新西兰牡荆甙Ⅱ、Rabdosiin、Dehydroxyl Rabdosiin和迷迭香酸，其质谱碎片信息和分子离子峰数据如表2所示。结合验证试验和文献报道，发现这4个化合物均具有较好的抗肿瘤活性。

实施例4   本发明方法在7种化合物混合样品中筛选抗氧化活性成分的应用。 

混合样品制备：取芦丁2.44mg、二氢槲皮素 1.216mg、丹酚酸b 2.871mg、丹酚酸a 1.976mg、甘草酸3.288mg、冬凌草甲素1.456mg和桔皮素1.488mg（标准品均购自上海融禾医药科技有限公司），混合后加入2mL 50%乙醇－水（体积比）溶液，配制成含7种化合物的混合样品，其中每种化合物浓度为2mM。按以下步骤进行活性化合物发现：

(1) 样品并行制备　分别取20μL混合样品溶液，通过Agilent 1100液相色谱的自动进样器及4个D-14163手动进样器（德国Knauer公司）注入并行制备系统。并行制备系统由Agilent 1100二元液相色谱泵，5根并行连接的Zorbax SB C₁₈色谱柱（4.6mm*250mm, 5μm粒径）以及4台FoxyR1馏分收集仪（美国Teledyne公司）组成。将其中4根色谱柱的洗脱液，采用自动馏分收集仪分别收集至4块96孔板(Corning公司)中。色谱条件为：流动相为0.05%甲酸-水与乙腈溶液，流速为0.4 mL/min，进样量为20 μL，柱温为30℃。洗脱梯度：0-20 min，乙腈（20%-60%）；20-21 min，乙腈（60%-80%）；21-35 min，乙腈（80%-95%）。

(2) 样品分析　将上述并行制备系统中，剩余1根色谱柱的洗脱液通过管线与Agilent 1100型光电二极管阵列检测器(DAD检测器)相连，然后再接入Finnigan LCQ Deca XP^Plus型电喷雾离子阱质谱仪，对步骤(1)制备的样品进行定性分析。DAD检测器检测范围为190-400nm；质谱条件为：鞘气（氮气），辅助气（氮气），裂解电压为 3.5 KV，离子源温度为 350 ℃，扫描质荷比范围为100-1000m/z。

(3) 样品处理　将步骤1制备得到的4块96孔板，采用SpeedVac 离心浓缩仪 (美国Thermo Electron, 公司)离心浓缩仪，冷冻浓缩2小时挥干溶剂。在96孔板中每孔加入5%乙醇溶液，溶解后作为待测样品。

(4) 抗氧化活性评价　采用DPPH法测定96孔板中各馏分的抗氧化活性。在样品板中10个空白孔内加入维生素C作为阳性药，再每孔加入100 μL水和100 μL DPPH的乙醇溶液（500 μmol/L），震荡孵育1 h（700 rpm, 37 ℃）。然后采用ELx800型酶标仪（美国Biotek公司）在 517 nm波长下测定空白对照板和样品板的吸光度，并计算DPPH的清除率：清除率 (%) = [1- (OD^sample - OD^blank) / OD^control ]′100。（OD^control是阴性对照样吸光值(溶剂+ DPPH)；OD^sample是样品吸光值；OD^blank是空白对照吸光值（纯溶剂））。

(5) 活性化合物发现　结果参见附图4，图中共有7个标准品对应的色谱峰，其中丹酚酸b和丹酚酸a对应的馏分具有最显著的DPPH清除作用，其清除率均高于40%；芦丁和二氢槲皮素具有较微弱的DPPH清除作用，而其它几个标准品无明显的DPPH清除作用。结合验证试验和文献报道，表明该方法能够较好地从混合物中筛选到活性成分。