细鳞鱼Cathelicidin抗微生物肽CATH_BRALE及其基因、制备、应用

摘要

一种细鳞鱼Cathelicidin抗微生物肽CATH_BRALE及其基因、制备、应用，属于生物医学技术领域。CATH_BRALE的基因由909个核苷酸组成，其中编码成熟肽部分的为第439－597位核苷酸。成熟肽CATH_BRALE富含碱性氨基酸，对水产养殖常见病原菌杀菌作用很强。结构简单，不含有二硫键及环状结构，方便化学合成及基因工程制备。其对多种临床耐药菌，尤其是真菌也有较好的杀灭作用。

说明书

技术领域

本发明提供一种来源于细鳞鱼（Brachymystax lenok）的cathelicidin家族广谱抗微生物肽CATH_BRALE及其基因, 制备方法和在医疗、生物制药及水产养殖病害防治中的应用，属于生物医学技术领域。 

背景技术

Cathelicidin是一类由N端信号肽区域、中间保守cathelin 结构域和C端高度特异的成熟肽区域构成的具有多功能的抗菌肽家族,在几乎所有种类的动物体内(哺乳类、鸟类、两栖类和鱼类)都有发现。与防御素(defensin)一样，Cathelicidin是包括人类在内的大多数脊椎动物所特有的宿主防御肽，构成了脊椎动物自然免疫反应的关键组分，是连接自然免疫和特异性免疫的桥梁。Cathelicidin具有广谱的抗菌活性，不仅对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、某些真菌以及病毒具有非常强的杀菌活性，而且对许多临床耐药细菌同样具有作用。除此之外，Cathelicidin还具有许多其他生物学活性，如对多种免疫细胞（中性粒细胞、单核细胞、肥大细胞和T细胞）具有趋化作用、诱导肥大细胞脱粒和组织胺释放、调节巨噬细胞转录、促进伤口愈合、诱导血管发生、诱导变异细胞系细胞凋亡和淋巴细胞活化等。Cathelicidin基因的缺失或异常表达都将导致人类严重疾病的发生。最新研究发现，系统性红斑狼疮和牛皮癣的发病与人体内Cathelicidin LL-37的过度表达有关。由于具有如此众多的活性，Cathelicidin一直是国际上研究的热点。针对Cathelicidin的药用开发则蕴含着巨大的临床治疗药物制备价值。 

由于近年来抗生素的滥用，导致致病性微生物耐药性的问题日益严重，在临床上已经出现了大量能够完全耐受青霉素等传统抗生素的微生物。最近，一种携带编写NDM-1酶基因的“超级病菌”的出现，罪魁祸首正是抗生素的滥用和误用。这种酶可分解β-内酰胺环结构，因此可使目前为止临床最常用的抗生素， 包括青霉素与头孢菌素，以及新发展的头霉素类、硫霉素类、单环β-内酰胺类等其他非典型β-内酰胺类抗生素失效。而Cathelicidin家族抗微生物肽的杀菌机制是通过破坏细菌细胞膜的完整性介导的：通过静电相互作用吸引并结合到带负电的细菌细胞膜表面，进一步在细菌细胞膜上形成跨膜的孔洞，导致细菌细胞内容物的外泄，从而导致细菌细胞的死亡。除此之外，越来越多的文献报道表明抗菌肽还具有其他的杀菌机制，如抑制细菌细胞壁合成、改变细菌细胞质膜抑制隔膜形成、激活自溶素、抑制细胞内酶活性、抑制DNA、RNA和蛋白质的合成等。正是由于作用方式的不同，Cathelicidin介导的杀菌作用远远快于传统抗生素，并且不会产生耐药性。体外抗微生物测试中，大多数Cathelicidin成熟肽可以在微摩尔和亚微摩尔的浓度下快速杀死广泛的微生物。Cathelicidin成 熟肽表现抗微生物肽的典型特征：大多数Cathelicidin成熟肽分子量小于5000，中性pH条件下带净正电荷，缘于它们含有多个碱性氨基酸残基；富含疏水碱基，整体具有两亲性的拓扑结构。 

目前Cathelicidin抗菌肽药物研究热点主要集中在消炎、抗感染和抗真菌等方面，应用方式可以是局部的也可以是系统的，剂型可以是口服也可以外用。尤其由于阳离子抗菌肽的表达与皮炎、侵入性烧伤脓血症、肿瘤病毒引起的肉赘等之间的病理联系，这些抗菌肽对这些疾病的局部治疗有较好的开发前景。例如中科院昆明所优选出蛇cathelicidin抗菌肽对500多株临床耐药菌株显示了较强的抗菌活性，同时具有极低的哺乳动物细胞毒性以及溶血活性，优于美国正进行III期临床的同类候选药物pexiganan；来源于猪protegrin的IB-367用于治疗肿瘤患者口腔溃疡，已进入临床III期试验。LL-37作为治疗囊肿性纤维化支气管炎的局部杀菌剂、及人抗菌肽CAP-18及其衍生物用于治疗上呼吸道感染、呼吸道感染、鼻窦炎、中耳炎等疾病的药物均已经成为生物制药领域内的研究热点。不仅限于医药领域，在农业、畜牧业和日化用品领域，cathelicidin也存在巨大的应用潜能。 

我国是渔业大国，水产品总产量位居世界首位。但是，近几年，随着高密度、集约化养殖模式的发展，水环境的污染程度加重，各种细菌性和病毒性疾病频发，防治疾病大量使用抗生素破坏水环境的微生态平衡，导致某些病原体对药物产生了耐药性，危害人体健康等。相继发生的水产养殖或水产品加工过程中过量使用渔用药物或加入禁用药物导致的“孔雀石绿事件”、“多宝鱼事件”、“氯霉素事件”等，给水产业蒙上一层浓厚的阴影，对消费者的人身安全造成威胁，也因此食品安全问题更加受到人们的关注。近年来，我国已有研究利用抗菌肽替代传统抗生素针对抗水产养殖过程中常见病原菌，如嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、梅氏弧菌(Vibrio metschnikovi)、迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)及温和气单胞菌(Aobria)均有较好的抑菌效果。通过饲料摄入抗菌肽，对南美白对虾亲虾产卵、孵化率及虾苗饲养，和对成虾的饲养效果明显优于金霉素。抗菌肽制品在对虾的饲料或水体中能对水中的微生物加以控制，使致病微生物如弧菌等均能杀灭，通过饲料摄入虾体内能提高免疫力和促进生长等功效。 

由于世界范围内对Cathelicidin的研究历史并不长，我国在此类活性多肽家族的研究还鲜有报道。细鳞鱼（Brachymystax lenok）属鲑科，细磷鱼属，生长在高寒冷水区域，是重要的冷水性经济鱼类。由于肉质鲜美，过量捕捞，已列入我国国家二级保护动物名单。本次发明的细鳞鱼抗微生物肽CATH_BRALE，将其全序列氨基酸结构经NCBI蛋白质数据库进行搜寻比对，未发现有任何相同多肽。发明人将本发明的细磷鱼CATH_BRALE编码基因经NCBI基 因数据库进行搜寻比对，未发现有任何相同基因。 

发明内容

本发明提供一种在亚微摩尔剂量下即具有很强的抗微生物活性的来源于细鳞鱼的一种抗微生物肽，CATH_BRALE及其基因、化学合成方法和应用。本发明的目的是基于上述理论研究和现有技术基础，提供一种具有强烈的抗菌活性，尤其针对水产养殖中几种常见病原菌的细磷鱼CATH_BRALE及其应用，着重水产养殖领域。 

为了实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案： 

CATH_BRALE是细鳞鱼Cathelicidin基因编码的一种直链多肽，含有53个氨基酸残基，理论等电点（pI）为12.43，理论分子量为5200.6，含有15个碱性氨基酸残基（11个精氨酸和4个赖氨酸），含有两个酸性氨基酸残基（天冬氨酸），静电荷为+13，说明它是一种较强的碱性多肽。CATH_BRALE不含半胱氨酸，因此没有分子内和分子间二硫键，结构简单。CATH_BRALE全序列为：精氨酸-精氨酸-丝氨酸-赖氨酸-丙氨酸-精氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸-精氨酸-甘氨酸-丝氨酸-赖氨酸-甲硫氨酸-甘氨酸-精氨酸-赖氨酸-天冬氨酸-丝氨酸-赖氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸-精氨酸-甘氨酸-精氨酸-脯氨酸-甘氨酸-丝氨酸-甘氨酸-丝氨酸-精氨酸-脯氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸-丝氨酸-异亮氨酸-丙氨酸-甘氨酸-丙氨酸-丝氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-精氨酸-甘氨酸-甘氨酸-苏氨酸-精氨酸-天冬酰胺-丙氨酸 

细鳞鱼抗菌肽CATH_BRALE基因的克隆包括: 

细鳞鱼脾脏总RNA提取，mRNA纯化，mRNA反转录及cDNA文库构建，设计引物，利用PCR方法筛选细鳞鱼抗菌肽CATH_BRALE基因。5’端引物分别为P1 (5'-ACATGAAGATGAAGGCTCTGGCG-3') 和P2 (5'-CCCAGACTGAGACCAGGTACGAAG-3')，PCR另一扩增引物为CLONTECH 公司CreatorTM SMART TM cDNA Library Construction Kit中的3’ PCR Primer引物，其序列为5’–CGGGGTACGATGAGACACCAT–3’。所获阳性单克隆进行基因核苷酸序列测定。基因测序结果表明编码细鳞鱼抗菌肽CATH_BRALE前体cathelicidin的基因由909个核苷酸组成，自5’端至3’端序列为: 

1 ATGAAGATGA AGGCTCTGGC GAGATCTCTT CTCTTGCTCG CTGTGACTGG 

51 CCTGCTGGTC AGAGGTCATT CCCAGACTGA GACCAGGTAC GAAGACATCA 

101 TCACAGCTGC TTCAACTCAG CTGCTTCCTG TGGAAGAGCA GGCTTTCCGT 

151 CCGCTTCTGA ACCAGCTGGA AGTCGAGACT TTGAATACAG AGGATGTGGA 

201 CCAGTCTGAG GTATCTGTAA AGTTGAGCTT TCCCCTGCAG GAGACTCTCT 

251 GCAGAAAGGC ACAAGGCCAA CCATGCCCTC TGAAGAAAAA TGGGAAACGA 

301 ATGATGTGCA GCATGGAGGT CAGACATCCG ATTCTGGATA CTGGCAACAC 

351 CCTCAACACT GACTGGTCTG ACATTTCTTG TGAATACATG GAGGCAGAAG 

401 ATGCTATGCC AGTACTGAGC ACTCAGAAGA TTCGGACAAG AAGAAGCAAG 

451 GCCAGGGGAG GCTCTAGGGG CTCTAAGATG GGTAGAAAAG ATTCCAAGGG 

501 GGGTAGCAGA GGTCGTCCTG GGAGTGGCTC TCGTCCTGGG GGTGGCTCCT 

551 CCATTGCTGG AGCTAGCAGA GGAGACCGTG GTGGAACTCG CAATGCATAG 

601 AACAGCACAA CACACCCTCT GGATAACTGC AAAATATCTC ACCAATCAAA 

651 GGAACTTCAA AAGCACTCAA AGTTGAGTTT AACGGATGAA CATGCAACCT 

701 TAAGCTTCTG GTAACTCTTT TGTCTACATT CTGAATTGGT TTGTATTTTG 

751 TAGCTATCGT TGTTTGTAAT AATGTACCTA TTCTTACATG CCAATCCTTG 

801 AATTTTAACT ACGGAAAATT GTTTCCAGTT CATGTTTACT GCACTAATAA 

851 ACTGCTAAAT AAGTTTCCAA AAAAAAAAAA AAAAAATGGT GTCTCATCGT 

901 ACCCCGAAT 

编码细鳞鱼cathelicidin成熟肽CATH_BRALE为第367－445位核苷酸，其氨基酸序列为: 

Arg¹ Arg² Ser³ Lys⁴ Ala⁵ Arg⁶ Gly⁷ Gly⁸ Ser⁹ Arg¹⁰ Gly¹¹ Ser¹² Lys¹³ Met¹⁴ Gly¹⁵ Arg¹⁶ Lys¹⁷Asp¹⁸Ser¹⁹ Lys²⁰ Gly²¹ Gly²² Ser²³ Arg²⁴ Gly²⁵ Arg²⁶ Pro²⁷ Gly²⁸ Ser²⁹ Gly³⁰ Ser³¹ Arg³² Pro³³ Gly³⁴ Gly³⁵ Gly³⁶ Ser³⁷ Ser³⁸ Ile³⁹ Ala⁴⁰ Gly⁴¹ Ala⁴²Ser⁴³ Arg⁴⁴ Gly⁴⁵ Asp⁴⁶ Arg⁴⁷ Gly⁴⁸ Gly⁴⁹ Thr⁵⁰ Arg⁵¹ Asn⁵² Ala⁵³

细鳞鱼抗菌肽CATH_BRALE基因作为基因工程制备细鳞鱼抗菌肽CATH_BRALE的应用。 

CATH_BRALE的化学制备方法： 

根据编码细鳞鱼cathelicidin抗微生物肽基因推断的成熟肽CATH_BRALE氨基酸序列，用自动多肽合成仪(433A, Applied Biosystems)合成其全序列。通过HPLC反相柱层析脱盐纯化，并确定其纯度大于95％。用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）测定其分子量，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。合成的CATH_BRALE抗菌肽可以溶于灭菌超纯水，用于药理活性检测。 

本发明的有益效果在于： 

基因克隆得到编码细鳞鱼cathelicidin抗微生物肽的基因，通过化学合成方法得到成熟肽CATH_BRALE。该抗微生物肽富含碱性氨基酸，对水产养殖常见病原菌A. salmonicida, A. hydrophila杀菌作用很强，结构简单，不含有二硫键及环状结构，方便化学合成及基因工程制备。抗菌实验显示其对多种临床耐药菌也有较好的杀灭作用。此外还具有无溶血性，无细胞 毒性等特点。 

具体实施方式

下面结合技术方案详细叙述本发明的具体实施例，但本发明的内容并不局限于此。 

实施例1 

抗微生物肽CATH_BRALE前体基因的克隆及基因测序，包括: 

采用RNeasy AxyPrep^TM Multisource Total RNA Miniprep Kit (Qiagen, union city, CA, USA)提取细鳞鱼脾脏总RNA，mRNA分离纯化采用美国PROMEGA公司的PolyATtract? mRNA Isolation Systems 试剂盒。利用In-Fusion? SMARTer Directional cDNA Library Construction Kit建库试剂盒构建细鳞鱼骨髓cDNA文库。 PowerScript Reverse Transcriptase反转录合成cDNA第一链，引物为： 

正向SMARTer V Oligonucleot引物：5'–AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACXXXXX–3'反向In-Fusion SMARTer CDSⅢ引物： 5’–CGGGGTACGATGAGACACCATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN–3’(N = A, C, G, or T; V = A, G, or C). 

利用Advantage DNA Polymerase合成第二链，引物为：正向5'–AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT-3'， 反向引物同为In-Fusion SMARTer CDSⅢ。. 

设计两条特异性正向引物（P1、P2）和一条反向非特异性通用引物（CDSⅢ），以细鳞鱼脾脏cDNA为模板，采用半巢式PCR的方法扩增cathelicidin的cDNA。 

正向P1：5'-ACATGAAGATGAAGGCTCTGGCG-3'； 

正向P2：5'-CCCAGACTGAGACCAGGTACGAAG-3'； 

反向非特异性通用引物为In-Fusion SMARTer CDSⅢ，其序列为：5‘—CGGGGTACGATGAGACACCAT-3’。 

所获阳性单克隆进行基因核苷酸序列测定, pMD19-T Vecter测序通用引物： 

正向M13F：5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'； 

反向M13R：5'-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3'； 

具体步骤如下： 

第一步、细鳞鱼脾脏总RNA提取（以下实验所用器具和试剂均经过处理，无RNase）： 

A. 从新鲜宰杀的细鳞鱼各种新鲜组织上分别剪下1g左右的小块，分别放入液氮预冷的细胞冻存管中，然后迅速放入液氮中保存； 

B．将保存在液氮中的组织材料取出，放入预冷的研钵内，迅速充分研磨，期间不断向研钵内加入少许液氮；将大约30 mg的组织粉末转移至预冷的1.5 ml离心管中，向其中分别 加入400 μl Buffer R-I（裂解液，RNA Miniprep Kit提供），用21-25号针头的注射器反复抽吸8-10次，转入1.5ml离心管中，加入150 μl Buffer R-П，涡旋振荡15-30s， 4?C, 12000 rpm离心5 min； 

C．将离心后的上清转移至新的1.5 ml离心管中，加入250ul异丙醇，迅速吸打混匀；将混合液分别转移至离心吸附柱，室温，6000 rpm离心1min；弃废液，然后加入500μl Buffer W1A，4?C, 12000 rpm离心1min；弃废液，加入700μl BufferW2A, 4?C, 12000 rpm离心1min；弃废液，加入700 μl Buffer W2A, 4?C, 12000 rpm离心1 min；弃废液, 空管12000 rpm离心1 min；将离心吸附柱转移至新的1.5 ml离心管中，然后直接向吸附膜上滴加70-100 μl Buffer TE，室温放置1min，12000 rpm离心1 min洗脱得到总RNA； 

第二步、cDNA文库的构建 

第一链的合成( mRNA 反转录 )： 

A. 在新的0.2ml PCR管（无DNase和RNase）中配制下列混合液： 

模板RNA                              1μg 

3’ In-Fusion SMARTer CDS Primer (50 μM)  1μl 

去离子水                               2.5μl 

混合均匀，短暂离心; PCR仪中72?C保温5 min后，然后42?C2 min；短暂离心后，在上述管中配制如下反转录反应液： 

混合均匀后，短暂离心；在PCR仪中完成以下程序： 

42?C，90min；68?C，10min；4?C，保存。cDNA保存于-80?C。 

第二链的合成： 

第三步、采用半巢式PCR进行细鳞鱼cathelicidin的基因克隆筛选 

引物使用前先12000 rpm离心5min, 然后根据标明的摩尔数加入相应体积的ddH₂O溶解至20 μM的浓度。以合成的骨髓cDNA为模板，以P1和In-Fusion SMARTer CDS为引物，进行第一次PCR扩增。在0.2ml PCR管中加入下列试剂（总体积20μl）： 

混匀后，短暂离心。PCR条件为：94?C变性5min；25个循环：94?C变性30s，60?C退火30s，72?C延伸1min；72?C延伸10min；4?C保存。反应结束后，取5 μl产物于1%琼脂糖凝胶电泳检测目的条带。 

取上步PCR产物1μl加入99 μl ddH₂O稀释100倍作为模板，以P2和CDSⅢ为引物，进行第二次PCR扩增。在0.2 ml PCR管中先后加入下列试剂（总体积20 μl）： 

PCR条件为：94?C变性5min；25个循环：94?C变性30s，58?C退火30s，72?C延伸1min；72?C延伸10min；4?C保存。反应结束后，取5 μl，1%琼脂糖凝胶电泳检测目的条带。 

扩增完成后用胶回收试剂盒（天根生物）进行目的片段回收。将回收的目的DNA片段与测序载体pMD19-T Vecter连接，转化进CaCl₂-MgCl ₂法制备好的DH5α感受态细胞。取100 μl转化菌液均匀涂布在含有100 μlg/ml氨苄青霉素（Amp）的LB琼脂培养基平板上；表面晾干后，放在37?C恒温培养箱中倒置培养12-16 h。挑取单菌落用M13引物PCR检测插入片段大小。挑取阳性菌落，摇菌提取质粒，使用Applied Biosystems DNA sequencer, model ABI PRISM 377进行核苷酸测序。 

第四步、细鳞鱼cathelicidin的基因序列测定和结果： 

基因测序结果表明编码CATH_BRALE前体cathelicidin的基因由909个核苷酸组成，自5’端至3’端序列为: 

1 ATGAAGATGA AGGCTCTGGC GAGATCTCTT CTCTTGCTCG CTGTGACTGG 

51 CCTGCTGGTC AGAGGTCATT CCCAGACTGA GACCAGGTAC GAAGACATCA 

101 TCACAGCTGC TTCAACTCAG CTGCTTCCTG TGGAAGAGCA GGCTTTCCGT 

151 CCGCTTCTGA ACCAGCTGGA AGTCGAGACT TTGAATACAG AGGATGTGGA 

201 CCAGTCTGAG GTATCTGTAA AGTTGAGCTT TCCCCTGCAG GAGACTCTCT 

251 GCAGAAAGGC ACAAGGCCAA CCATGCCCTC TGAAGAAAAA TGGGAAACGA 

301 ATGATGTGCA GCATGGAGGT CAGACATCCG ATTCTGGATA CTGGCAACAC 

351 CCTCAACACT GACTGGTCTG ACATTTCTTG TGAATACATG GAGGCAGAAG 

401 ATGCTATGCC AGTACTGAGC ACTCAGAAGA TTCGGACAAG AAGAAGCAAG 

451 GCCAGGGGAG GCTCTAGGGG CTCTAAGATG GGTAGAAAAG ATTCCAAGGG 

501 GGGTAGCAGA GGTCGTCCTG GGAGTGGCTC TCGTCCTGGG GGTGGCTCCT 

551 CCATTGCTGG AGCTAGCAGA GGAGACCGTG GTGGAACTCG CAATGCATAG 

601 AACAGCACAA CACACCCTCT GGATAACTGC AAAATATCTC ACCAATCAAA 

651 GGAACTTCAA AAGCACTCAA AGTTGAGTTT AACGGATGAA CATGCAACCT 

701 TAAGCTTCTG GTAACTCTTT TGTCTACATT CTGAATTGGT TTGTATTTTG 

751 TAGCTATCGT TGTTTGTAAT AATGTACCTA TTCTTACATG CCAATCCTTG 

801 AATTTTAACT ACGGAAAATT GTTTCCAGTT CATGTTTACT GCACTAATAA 

851 ACTGCTAAAT AAGTTTCCAA AAAAAAAAAA AAAAAATGGT GTCTCATCGT 

901 ACCCCGAAT 

细鳞鱼cathelicidin编码区的cDNA核苷酸的序列表为：序列长度为909个碱基，序列类型：核酸，链数：单链，拓扑学：直链状，序列种类：cDNA，来源： 细鳞鱼骨髓。 

编码细鳞鱼cathelicidin成熟肽CATH_BRALE为第367－445位核苷酸，其氨基酸序列为: 

Arg¹ Arg² Ser³ Lys⁴ Ala⁵ Arg⁶ Gly⁷ Gly⁸ Ser⁹ Arg¹⁰ Gly¹¹ Ser¹² Lys¹³ Met¹⁴ Gly¹⁵ Arg¹⁶ Lys¹⁷Asp¹⁸Ser¹⁹ Lys²⁰ Gly²¹ Gly²² Ser²³ Arg²⁴ Gly²⁵ Arg²⁶ Pro²⁷ Gly²⁸ Ser²⁹ Gly³⁰ Ser³¹ Arg³² Pro³³ Gly³⁴ Gly³⁵ Gly³⁶ Ser³⁷ Ser³⁸ Ile³⁹ Ala⁴⁰ Gly⁴¹ Ala⁴²Ser⁴³ Arg⁴⁴ Gly⁴⁵ Asp⁴⁶ Arg⁴⁷ Gly⁴⁸ Gly⁴⁹ Thr⁵⁰ Arg⁵¹ Asn⁵² Ala⁵³

CATH_BRALE的化学制备方法： 

Ⅰ、根据编码细鳞鱼cathelicidin基因推断的成熟肽CATH_BRALE氨基酸序列，用自动多肽合成仪(Applied Biosystems)合成其全序列，通过HPLC反相柱层析脱盐纯化，并确定其纯度 大于95％。 

Ⅱ、分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF），等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。合成的CATH_BRALE抗菌肽可以溶于灭菌超纯水，用于药理活性检测。 

细磷鱼抗微生物肽CATH_BRALE的药理实验： 

1. CATH_BRALE抗菌活性检测： 

将化学合成的CATH_BRALE以2mg/ml的浓度溶解在无菌超纯水中；用接种环挑取新活化的微生物，然后均匀涂布在新的LB琼脂板上；将直径0.5 cm的圆形无菌滤纸片放在上述琼脂板上，然后向纸片上滴加10μl CATH_BRALE样品溶液；放入37 oC恒温培养箱中培养12-24 h；观察抑菌圈形成与否，将对CATH_BRALE敏感的菌株记录下来。 

2. CATH_BRALE对敏感菌株最小抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC）的测定。该实验以人cathelicidin LL-37，无菌液体LB作阴性对照；最小抑菌浓度的定义为肉眼可以观察到的完全抑制微生物生长的最低多肽浓度，或者是光吸收值不高于阴性对照5%的最低浓度。 

挑取新活化的微生物，接种至无菌液体LB培养基，37 oC恒温振荡器中200 rpm培养10-16h至对数生长期；用紫外分光光度计测菌液600 nm光波处的吸光值，吸光值为1时，浓度大约为10⁹ cfu/ml，将菌液用无菌液体LB培养基稀释至10⁶ cfu/ml，冰上待用; 在96微孔板上配制浓度梯度为200 μg/ml、100 μg/ml、50 μg/ml、25 μg/ml、12.5 μg/ml、6.25 μg/ml、3.13 μg/ml、1.56 μg/ml、0.78 μg/ml、0.39 μg/ml、0.20 μg/ml的经0.22 μm孔径膜过滤的CATH_BRALE样品溶液，每孔50 μl；每孔加入50 μl上述稀释菌液；在恒温振荡器中37 oC，100 rpm振荡培养10-16h；使用酶标仪测600 nm吸光值或肉眼观察；上述实验重复3次，取平均值。另取一块96孔板，同样操作，仅是每孔多加100mMNaCl，仍然重复3次，取平均值。 

由表1可见，CATH_BRALE对测试的微生物具有广谱的抗菌活性，特别是对两种水产养殖常见病原菌株Aeromonas salmonicida,（杀鲑气单胞菌） Aeromonas hydrophila（嗜水气单胞菌）。CATH_BRALE不仅对革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）具有抗菌活性，还对部分真菌也有抗菌活性，而LL-37对革兰氏阴性菌（G-）基本无活性。与人LL-37相比，CATH_BRALE对革兰氏阴性菌（G-）抗菌活性更强：CATH_BRALE对P. aeruginosa（铜绿假单胞菌）最为敏感，最小抑菌浓度仅为1.17μM。CATH_BRALE对两种水产养殖常见病原菌株A. salmonicida和A. hydrophila都具有非常强的抗菌活性，最小抑菌浓度仅为9.38μM， 而LL37在2mg/ml的高浓度下仍未显示抑菌活性。此外，CATH_BRALE还具有一定的抗真菌活性，对 白色念珠菌ATCC2002的最小抑菌浓度也仅为2.34μM。 

表 1  CATH_BRALE的最小抑菌浓度（MIC） 

* MIC：最小抑菌浓度，浓度值为3次重复实验的平均值；LL-37：人cathelicidin, ND：2mg/ml剂量纸片抑菌试验无明显活性； IS：临床分离菌株,。以上结果为三次独立重复实验平均值。 

3. CATH_BRALE的溶血活性分析 

该实验以1%Triton X-100作阳性对照，以生理盐水作阴性对照。制备红细胞：取1ml人血，置于15ml离心管中，加入10ml生理盐水，混匀后2000rpm离心5min，用生理盐水重悬，重复离心至上清液不呈红色为止；用1ml生理盐水重悬红细胞沉淀，取少量重悬液加入小烧杯中，用生理盐水稀释至呈微红色；每种测试样品制备1000μl体系： 

10μl多肽样品+990μl红细胞稀释液             CATH_BRALE(终浓度为20μg/ml) 

10μl 1‰Triton X-100+990μl红细胞稀释液             阳性对照 

10μl生理盐水+990μl红细胞稀释液                   阴性对照 

CATH_BRALE和阴、阳性对照各做3个重复体系。37^oC温育30min，3000rpm离心5min；收集上清200μl，分别测540nm处光吸收值，计算3个重复的平均值；溶血率= (样品540nm光吸收值－阴性对照)×100%/(阳性对照－阴性对照)。 

实验结构表明，在10μg/ml（3.15 μM）剂量下的CATH_BRALE对人血红细胞的溶血率仅为6.8%；显示了CATH_BRALE对微生物细胞的强选择性。 

4. CATH_BRALE细胞毒性实验 

人脐静脉内皮细胞系HUVEC和大鼠巨噬细胞系RAW264.7用DMEM+10% FBS培养基培养。培养的细胞稀释接种到96孔板中（2×104 per well），细胞培养箱中培养过夜使细胞贴壁。然后加入不同浓度的CATH_BRALE样品，继续培养48小时。MTT法检测CATH_BRALE对HUVEC和RAW264.7细胞的细胞毒性。 

实验结果表明CATH_BRALE对两株细胞的半数致死浓度（IC50）值均为47.25 μM，远远高于其对绝大多数细菌的MIC值。说明CATH_BRALE在平均MIC值浓度下对人体正常细胞或者鱼类正常细胞不具有毒性作用，使CATH_BRALE的开发应用成为可能。