具有多个除草剂抗性AHASL1等位基因的除草剂抗性向日葵植物及使用方法

摘要

描述了包含向日葵乙酰羟酸合酶大亚基1(AHASL1)基因的两种不同除草剂抗性等位基因的除草剂抗性向日葵植物。公开了用于制备这些向日葵植物的方法和用于控制这些向日葵植物附近生长的杂草或其它不需要的植物的方法。此类方法包括使用乙酰羟酸合酶抑制性除草剂。还描述了控制生长于向日葵植物上的寄生杂草的方法。另外还提供了测定向日葵植物AHASL1基因的基因型的方法。

说明书

本申请是申请日为2008年4月2日、发明名称为“具有多个除草剂抗性AHASL1等位基因的除草剂抗性向日葵植物及使用方法”的中国专利申请200880017562.X(国际申请号PCT/US2008/059125)的分案申请。 

发明领域

本发明涉及农业领域，尤其涉及包含向日葵乙酰羟酸合酶大亚基1(AHASL1)基因的两种不同除草剂抗性等位基因的除草剂抗性向日葵植物。 

发明背景 

乙酰羟酸合酶(AHAS；EC4.1.3.18，也称为乙酰乳酸合酶或ALS)是催化支链氨基酸缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物化学合成的第一个酶(Singh(1999)″Biosynthesis of valine，leucine and isoleucine，″in Plant Amino Acids，Singh，B.K.，ed.，Marcel Dekker Inc.New York，New York，pp.227-247)。AHAS是四种结构上和化学上不同的除草剂家族的作用位点，所述除草剂家族包括磺脲类(Tan等，(2005)Pest Manag.Sci.61：246-57；Mallory-Smith and Retzinger(2003)Weed Technology 17：620-626；LaRossa and Falco(1984)Trends Biotechnol.2：158-161)、咪唑啉酮类(Shaner等(1984)Plant Physiol.76：545-546)、三唑并嘧啶类(Subramanian 和Gerwick(1989)″Inhibition of acetolactate synthase by triazolopyrimidines，″in Biocatalys in Agricultural Biotechnology，Whitaker，J.R.and Sonnet，P.E..eds.，ACS Symposium Series，American  Chemical Society，Washington，D.C.，pp.277-288)、和嘧啶基氧基苯甲酸酯类(Subramanian等(1990)Plant Physiol.94：239-244)。由于它们在非常低的应用程度下的有效性以及在动物中的相对无毒性，咪唑啉酮和磺脲类除草剂被广泛用于现代农业。这些除草剂家族通过抑制AHAS活性阻止了包括多种杂草种类在内的敏感植物的生长和发育。商业上可获得的咪唑啉酮除草剂的几个例子有 (咪草烟)， (灭草喹)和 (灭草烟)。磺脲类除草剂的例子有绿黄隆、甲黄隆、嘧黄隆、氯嘧黄隆、噻吩磺隆、苯黄隆、苄嘧黄隆、烟嘧黄隆、胺苯黄隆、玉嘧黄隆、氟胺磺隆、醚苯黄隆、氟嘧黄隆、醚黄隆、磺氨黄隆、啶咪黄隆、吡啶磺隆和吡氯黄隆。 

由于它们的高效性和低毒性，偏向于将咪唑啉酮除草剂通过喷雾法应用于大范围植物的顶部。能够将除草剂喷于大范围植物的顶部降低了与植物建立和维护相关的费用，并降低了在使用此类化学试剂之前准备场所的需要。由于缺乏竞争种类，在目标耐受种类顶部的喷雾也致使获得了目标种类的最大产量潜力的能力。然而，使用此类喷雾技术的能力依赖于喷雾区域中目标植物的咪唑啉酮抗性种类的存在。 

在主要的农业作物中，一些豆科种类(例如大豆)由于其能够快速代谢除草剂化合物，对咪唑啉酮除草剂具有天然抗性(Shaner和Robinson(1985)Weed Sci.33：469-471)。其它作物例如玉米(Newhouse等(1992)Plant Physiol.100：882-886)和稻(Barrett等(1989)对咪唑啉酮除草剂是有些敏感的。对咪唑啉酮除草剂的差异敏感性取决于特定除草剂的化学性质和化合物在每种植物中从毒性至非毒性形式的差别代谢(Shaner等(1984)Plant Physiol.76：545-546；Brown等(1987)Pestic.Biochem.Physiol.27：24-29)。其它植物生理学差异例如吸收和转移也在敏感性中发挥着重要作用(Shaner和Robinson(1985)Weed Sci.33：469-471)。 

在玉米、拟南芥、油菜(即芸苔)、大豆、烟草、甜菜(甜萝卜)和稻中，利用种子、小孢子、花粉和愈伤组织诱变作用已经成功生产出了对咪唑啉酮、磺脲类、三唑并嘧啶和嘧啶基氧基苯甲酸酯有抗性的植物(Sebastian 等(1989)Crop Sci.29：1403-1408；Swanson等，1989 Theor.Appl.Genet.78：525-530；Newhouse等(1991)Theor.Appl.Genet.83：65-70；Sathasivan等(1991)Plant Physiol.97：1044-1050；Mourand等(1993)J.Heredity 84：91-96；Wright和Penner(1998)Theor.Appl.Genet.96：612-620；美国专利号5,545,822)。在所有的情况下，单一的、部分显性的核基因赋予了抗性。先前也在小麦Fidel栽培种种子诱变之后分离到了四种咪唑啉酮抗性小麦植物(Newhouse等(1992)Plant Physiol.100：882-886)。遗传研究确认单一的部分显性基因赋予了抗性。基于等位基因研究，作者推断出四种所鉴定的品系中的突变位于同一基因座。将Fidel栽培品种抗性基因之一命名为FS-4(Newhouse等(1992)Plant Physiol.100：882-886)。 

也已经将被发现对于咪唑啉酮和/或磺脲类除草剂具有抗性的天然存在的植物种群用于开发除草剂抗性向日葵育种品系。最近，利用来自于普通向日葵野生品系(向日葵)的种质作为除草剂抗性性状的来源开发了对磺脲类除草剂具有抗性的两种向日葵品系(Miller和Al-Khatib(2004)CropSci.44：1037-1038)。从前，White等((2002)Weed Sci.50：432-437)已经报道过，来自美国南达科他的普通向日葵种群的个体对咪唑啉酮和磺脲类除草剂具有交叉抗性。对该种群个体的乙酰羟酸合酶大亚基(AHASL)基因的部分编码区域的分析揭示出，向日葵AHASL蛋白质中导致Ala置换成Val氨基酸的点突变对应于野生型拟南芥AHASL蛋白质中的Ala₂₀₅(White等(2003)Weed Sci.51：845-853)。更早地，Al-Khatib和Miller((2000)Crop Sci.40：869)报道了四种咪唑啉酮抗性向日葵育种品系的产生。 

对AHAS抑制剂复合体三维构象的计算机建模预示，在作为引入突变的位点的建议的抑制剂结合袋中的几个氨基酸可能提供对咪唑啉酮类的选择抗性(Ott等(1996)J.Mol.Biol.263：359-368)。在AHAS酶建议的结合位点中具有一些这些合理设计的突变的烟草植物实际上显示出对单一种类除草剂的特异抗性(Ott等(1996)J.Mol.Biol.263：359-368)。 

对咪唑啉酮除草剂的植物抗性也已在下列一些专利中有所报告：美国专利号4,761,373、5,331,107、5,304,732、6,211,438、6,211,439和6,222,100 通常描述了使用改变的AHAS基因引起植物中的除草剂抗性，并特别公开了特定的咪唑啉酮抗性玉米品系。美国专利号5,013,659公开了因在一个或多个保守区的至少一个氨基酸的突变而显示除草剂抗性的植物。其中所述的突变编码对咪唑啉酮和磺脲类的交叉抗性，或者磺脲类特异抗性，但未描述咪唑啉酮特异抗性。美国专利号5,731,180和美国专利号5,767,361讨论了在野生型单子叶植物AHAS氨基酸序列中具有单个氨基酸替换的分离基因，其导致了咪唑啉酮特异抗性。另外，对干扰AHAS的除草剂具有抗性的稻类植物已经通过突变育种并另外通过从花药培养所产生的稻类植物库中筛选除草剂抗性植物而得以开发。参见，美国专利号5,545,822、5,736,629、5,773,703、5,773,704、5,952,553和6,274,796。 

在植物中，如同在所有其它有机体中所检测到的，AHAS酶由两个亚基组成：大亚基(催化作用)和小亚基(调节作用)(Duggleby和Pang(2000)J.Biochem.Mol.Biol.33：1-36)。AHAS大亚基(本文也称作AHASL)在拟南芥和甜菜中可由单个基因编码，在玉米、芸苔和棉花中通过多基因家族成员编码。大亚基中特异性单个核苷酸置换赋予了该酶对一类或多类除草剂的一定程度的不敏感性(Chang和Duggleby(1998)Biochem J.333：765-777)。 

例如，面包小麦(Triticum aestivum L.)含有三种同源乙酰羟酸合酶大亚基基因。每种基因显示出基于除草剂反应的显著表达，以及来自三种基因的每个中突变的生物化学数据(Ascenzi等(2003)International Society of Plant Molecular Biologists Congress，Barcelona，Spain，Ref.No.S10-17)。所有三种基因的编码序列在核苷酸水平上享有广泛的同源性(WO03/014357)。通过对来自小麦的几个品种的AHASL基因的测序，发现大多数IMI-耐受(咪唑啉酮耐受)品系中除草剂耐受的分子基础是突变S653(At)N，表明在等同于拟南芥中653位氨基酸的丝氨酸的位置上丝氨酸向天冬酰胺的置换(WO 03/01436；WO 03/014357)。该突变是由于编码AHASL蛋白的DNA序列中的单核苷酸多态性(SNP)。 

也已知多种AHASL基因存在于双子叶植物种类中。最近，Kolkman 等((2004)Theor.Appl.Genet.109：1147-1159)报道了来自除草剂抗性和野生型基因型的向日葵(Helianthus annuus L.)的三种AHASL基因(AHASL1、AHASL2和AHASL3)的鉴定、克隆和测序。Kolkman等报道了除草剂抗性是因为AHASL1蛋白中Pro197Leu置换(利用拟南芥AHASL氨基酸位置命名法)或Ala205Val置换，以及这些置换中的每种均提供对咪唑啉酮和磺脲类除草剂的双重抗性。 

由于其高效性和低毒性，咪唑啉酮除草剂被喜欢用于农业用途。然而，在特定农作物生产系统中使用咪唑啉酮除草剂的能力取决于目标农作物植物中咪唑啉酮抗性品种的存在。为生产此类咪唑啉酮抗性品种，植物育种者需要开发具有咪唑啉酮抗性特征的育种品系。因此，需要作物植物另外的咪唑啉酮抗性育种品系和品种，以及生产和使用咪唑啉酮抗性育种品系和品种的方法和组合物。 

发明概述 

本发明提供新的、除草剂抗性向日葵植物，其包含向日葵乙酰羟酸合酶大亚基1(AHASL1)基因的两个不同的除草剂抗性等位基因。特别是，当与野生型向日葵植物相比时，本发明的向日葵植物具有对乙酰羟酸合酶(AHAS)抑制性除草剂增加的抗性。本发明的除草剂抗性向日葵植物包含第一AHASL1等位基因和第二AHASL1等位基因，其中第一和第二AHASL1等位基因分别编码第一和第二除草剂抗性向日葵AHASL1蛋白质。第一AHASL1等位基因编码包含A122T氨基酸置换的向日葵AHASL1蛋白质。第二AHASL1等位基因编码包含A205V氨基酸置换或P197L氨基酸置换的向日葵AHASL1蛋白质。还提供了包含第一和第二AHASL1等位基因的向日葵植物部分、组织、细胞和种子。 

本发明进一步提供了生产包含对至少一种AHAS抑制性除草剂有抗性的杂种向日葵植物的方法。该方法包括将第一向日葵植物与第二向日葵植物异花授粉从而产生杂种向日葵种子，可种植该种子并允许其生长成杂交向日葵植物，特别是F1代杂交向日葵植物。第一向日葵植物在其基因 组中包含至少一个拷贝的AHASL1基因的第一等位基因，第二向日葵植物在其基因组中包含至少一个拷贝的AHASL1基因的第二等位基因。优选地，第一向日葵植物是第一等位基因纯合型的，第二向日葵植物是第二等位基因纯合型的。第一等位基因编码包含A122T氨基酸置换的向日葵AHASL1蛋白。第二AHASL1等位基因编码包含A205V氨基酸置换或P197L氨基酸置换的向日葵AHASL1蛋白。 

本发明另外提供用于控制本发明的向日葵植物附近的杂草或不需要的植物的方法。一种方法包括对杂草和向日葵植物应用有效量的AHAS抑制性除草剂，特别是咪唑啉酮或磺脲类除草剂。另一方法包括在播种之前和/或催芽之后使本发明的向日葵种子与有效量的AHAS抑制性除草剂特别是咪唑啉酮或磺脲类除草剂接触相接触。本发明另外提供了用有效量AHAS抑制性除草剂处理的本发明的向日葵种子。用于这些方法的向日葵植物和种子在其基因组中包含第一AHASL1等位基因和第二AHASL1等位基因。第一AHASL1等位基因编码包含A122T氨基酸置换的向日葵AHASL1蛋白质。第二AHASL1等位基因编码包含A205V氨基酸置换或P197L氨基酸置换的向日葵AHASL1蛋白质。 

本发明另外提供了控制受感染的向日葵植物上的寄生杂草Orobanche cumana和弯管列当(Orobanche cernua)(也称为列当)的方法。该方法包括对杂草和本发明的除草剂抗性向日葵植物，特别是包含两种A122T等位基因的向日葵植物、或包含一种AHASL1A122T等位基因和一种A205VAHASL1等位基因的向日葵植物使用有效量的咪唑啉酮除草剂。 

本发明提供鉴定个体向日葵中AHASL1基因的等位基因的诊断方法。该诊断方法包括利用经设计与AHASL1基因内特定位点(例如，位于AHASL1基因中突变或其附近的位点)退火的引物对向日葵AHASL1基因特定区域进行聚合酶链反应(PCR)扩增。另外提供了用于这些方法中的引物或完成这些方法的试剂盒。 

附图简述 

图1是在处理突变事件A122T和A205V的纯合型材料以及杂合基因型A205+A122T的材料之后14天，叶部施用灭草烟对植物高度的影响的图示。平均高度(未处理样地的％)通过标记来表示，误差线表示平均值的标准差。 

图2是处理突变事件A122T和A205V的纯合型材料以及杂合基因型A205+A122T的材料之后14天，叶部施用灭草烟对植物毒性指数(PI)的影响的图示。平均PI由标记来表述，误差线表示平均值的标准差。 

图3在处理突变事件A122T和A205V的纯合型材料以及杂合基因型A205+A122T的材料之后14天，叶部施用灭草烟对生物量积累的影响的图示。平均干生物量(未处理样地的％)通过标记来表示，误差线表示平均值的标准差。 

图4是利用引物p-AHAS18/pAHAS-19进行PCR扩增反应的产物在琼脂糖凝胶电泳后的照片示例。第1道：GM40(A122T突变)，第2道：L1(A205V突变)，第3和4道：H3，第5和6道：H4，第7和8道：H1，第9和10道：L2。 

图5是用BmgB I对PCR扩增产物进行限制酶消化的产物在琼脂糖凝胶电泳之后的照片示例。M道：分子量标准；第1道：BTK47(野生型)，第2道：GM40(A122T)，第3道：来自cmsBTK47×GM40杂交的F1代植物，第4道：cmsGM40(A122T)。 

图6是利用p-AHAS NIDF/AHAS 122TMU组合所获得的PCR扩增产物的照片示例。第1道：分子量标准(25bp标记)，第2道：分子量标准(100bp标记)，第3道：122纯合子个体，第4道：205纯合子个体，第5道：197纯合子个体，第6道：WT(单倍型1)，第7道：122/WT个体，第8道：122/205个体，第9道：122/197个体，第10道：水(阴性对照)，第11道：分子量标准(25bp标记)，第12道：分子量标准(100bp标记)。 

图7是利用p-AHAS NIDF/AHAS 122TMT组合所获得的PCR扩增产物的照片示例。第1道：分子量标准(25bp标记)，第2道：分子量标准(100bp标记)，第3道：122纯合子个体，第4道：205纯合子个体，第5道：197纯 合子个体，第6道：WT(单倍型1)，第7道：122/WT个体，第8道：122/205个体，第9道：122/197个体，第10道：水(阴性对照)，第11道：分子量标准(25bp标记)，第12道：分子量标准(100bp标记)。 

图8是序列比对，其显示当利用引物对p-AHAS NIDF/AHAS122TWT或引物对p-AHAS NIDF/AHAS 122TMU扩增每种单倍型(Hap)的向日葵基因组DNA时，向日葵AHASL1单倍型的核苷酸序列中的区别。引物的位置用箭头显示。AHASL1核苷酸序列中编码(ACC)_n重复(编码推定的转运肽中的多聚-Thr区)和INDELS的核苷酸序列分别以粗体和高亮表示。(ACC)_n重复和INDELS被认为相应于编码AHASL1转运肽的AHASL1核苷酸序列的部分。A122T单核苷酸多态性(SNP)的位置通过箭头 来表示。序列末端的数字表示当用p-AHAS NIDF/AHAS122TWT(Hap1-5)或p-AHAS NIDF/AHAS 122TMU(Hap6)引物对扩增时，每个单倍型的预期片段大小。 

图9是利用来自AHASL1A122T等位基因(HET)杂合型、AHASL1A122T等位基因纯合型(突变体)、或AHASL1基因座上野生型(WT)植物的向日葵组织DNA提取物所获得的PCR扩增产物的照片示例。如实施例7中所述进行PCR扩增，并通过2％(w/v)琼脂糖凝胶上的凝胶电泳分离该PCR产物。 

图10是2007年在四处田间位置上对于四种不同类型的杂种，在处理后的9-12天(左图)和处理后的25-30天(右图)所测定的、在200g ai/ha咪草啶酸下的农作物损伤(平均％植物毒性)的图示。这四处位置为：Velva，ND，美国；Angers，法国；Saintes法国和Formosa，阿根廷。图10中所显示的四种不同类型的杂种为A122T纯合的(CLHA-Plus homo)、A122T/A205(CLHA-Plus/IMISUN hetero)、A122T杂合的(CLHA-Plus hetero)、和A205V纯合的(IMISUN homo)。左图。 

图11是在施用咪草啶酸(imazamox)后携带CLHA-Plus突变的不同类型向日葵杂种的农作物损伤的图示。图11中所表示的四种不同类型的杂种是A122T纯合型的(CLHA-Plus homo)、A122T/A205(CLHA-Plus/ IMISUN hetero)、A122T杂合型的(CLHA-Plus hetero)、和A205V纯合型的(IMISUN homo)。 

图12是在施用灭烟草后携带CLHA-Plus突变的不同类型向日葵杂种的农作物损伤的图示(CLHA-Plus纯合的：b＝0.20±0.06，P＜0.048CLHA-Plus/IMISUN杂合的：b：0.26±0.07，P＜0.0019；CLHA-Plus/WT：b：0.55±0.18，P＜0.0109)。图11中所表示的四种不同类型的杂种是A122T纯合型的(CLHA-Plus homo)、A122T/A205(CLHA-Plus/IMISUN hetero)、A122T杂合型的(CLHA-Plus hetero)、和A205V纯合型的(IMISUN homo)。 

图13是在100μM咪草啶酸(左图)或100μM灭草烟(右图)存在下四种向日葵品系的AHAS酶活性(以未处理对照的百分比来表达)的图示。 

图14是在升高水平的咪草啶酸的存在下五种向日葵品系的AHAS酶活性(以未处理对照的百分比来表达)的图示。 

序列表 

所附的序列表中列的核苷酸和氨基酸序列是利用标准的字母缩写表示核苷酸碱基、用三字母代码表示氨基酸来显示的。所述核酸序列遵循标准惯例，起始于序列的5’端并向3’端延伸(即每行中从左向右)。仅显示了每种核苷酸的一条链，但应当理解可通过参考所示的链而将其互补链包括在内。所述氨基酸序列遵循标准惯例，起始于序列的氨基端并向其羧基端延伸(即，在每行中从左向右)。 

SEQ ID NO：1表示p-AHAS18的核苷酸序列。 

SEQ ID NO：2表示p-AHAS19的核苷酸序列。 

SEQ ID NO：3表示p-AHAS NIDF的核苷酸序列。 

SEQ ID NO：4表示AHAS 122TWT的核苷酸序列。 

SEQ ID NO：5表示AHAS 122TMU的核苷酸序列。 

SEQ ID NO：6表示图8中所示的向日葵单倍型1(Hap1)的AHASL1一部分的核苷酸序列。 

SEQ ID NO：7表示图8中所示的向日葵单倍型2(Hap2)的AHASL1一部分的核苷酸序列。 

SEQ ID NO：8表示图8中所示的向日葵单倍型3(Hap3)的AHASL1一部分的核苷酸序列。 

SEQ ID NO：9表示图8中所示的向日葵单倍型4(Hap4)的AHASL1一部分的核苷酸序列。 

SEQ ID NO：10表示图8中所示的向日葵单倍型5(Hap5)的AHASL1一部分的核苷酸序列。 

SEQ ID NO：11表示图8中所示的向日葵单倍型6(Hap6)的AHASL1一部分的核苷酸序列。 

SEQ ID NO：12表示图8中所示AHASL1核苷酸序列内对应于引物p-AHAS NIDF的位置的核苷酸序列(参见图8中的上箭头)。引物p-AHASNIDF与SEQ ID NO：12所示核苷酸序列的互补核苷酸序列退火。 

SEQ ID NO：13表示引物AHAS 122TWT在图8所示的Hap1-Hap5的AHASL1核苷酸序列(分别为SEQ ID NOS：6-10)内退火位点的核苷酸序列(参见图8中的下箭头)。 

SEQ ID NO：14表示引物AHAS 122TWU在图8所示的Hap6的AHASL1核苷酸序列(SEQ ID NO：11)内退火位点的核苷酸序列(参见图8中的下箭头)。 

SEQ ID NO：15表示HA122CF的核苷酸序列。 

SEQ ID NO：16表示HA122wt的核苷酸序列。 

SEQ ID NO：17表示HA122mut的核苷酸序列。 

SEQ ID NO：18表示HA122CR的核苷酸序列。 

SEQ ID NO：19表示编码包含A122T氨基酸置换的除草剂抗性AHASL1蛋白质的部分长度核苷酸序列，所述AHASL1蛋白质来自WO2007005581中所述的向日葵品系S4897和GM40。SEQ ID NO：19对应于WO 2007005581的SEQ ID NO：1。 

SEQ ID NO：20表示除草剂抗性AHASL1蛋白质的部分长度氨基酸序 列，其由SEQ ID NO：19中所示的核苷酸序列编码。SEQ ID NO：20对应于WO 2007005581的SEQ ID NO：2。 

SEQ ID NO：21表示编码包含P197L氨基酸置换的成熟的除草剂抗性AHASL1蛋白质的核苷酸序列，所述AHASL1蛋白质来自WO2006024351中所述的向日葵品系MUT28。SEQ ID NO：21对应于WO 2006024351的SEQ ID NO：5。 

SEQ ID NO：22表示成熟的除草剂抗性AHASL1蛋白质的氨基酸序列，其由SEQ ID NO：21中所示的核苷酸序列编码。SEQ ID NO：21对应于WO 2006024351的SEQ ID NO：6。 

SEQ ID NO：23表示编码包含A205V氨基酸置换的成熟的除草剂抗性AHASL1蛋白质的核苷酸序列，所述AHASL1蛋白质来自GenBank检索号AY541455和Kolkman等(2004)Theor.Appl.Genet.109：1147-1159中所述的向日葵单倍型5。SEQ ID NO：23对应于GenBank检索号AY541455的核苷酸序列的核苷酸244-1959。 

SEQ ID NO：24表示成熟的除草剂抗性AHASL1蛋白质的氨基酸序列，其由SEQ ID NO：23中所述核苷酸序列编码。SEQ ID NO：24对应于GenBank检索号AY541455的核苷酸序列所编码的氨基酸序列的氨基酸82-652。 

发明详述 

本发明涉及除草剂抗性向日葵植物，在其基因组中包含向日葵AHASL1基因的两种不同的等位基因。两种不同等位基因的每种均编码向日葵AHASL1蛋白质，其包含与野生型向日葵AHASL1氨基酸序列有一个或多个氨基酸不同的氨基酸序列。已知本发明的每种AHASL1等位基因为向日葵植物提供了对AHAS抑制性除草剂，特别是咪唑啉酮和磺脲类除草剂增强的抗性或耐受性。本发明另外涉及制备这些向日葵植物的方法和控制生长于本发明向日葵植物附近的杂草或不需要的植物的方法。 

本发明是基于下列发现，包含向日葵AHASL1的两种不同除草剂抗性 等位基因中每种的单一拷贝的F1代杂交向日葵植物包含的对AHAS抑制性除草剂的商业上可接受水平的抗性。因而，本发明发现了通过允许植物育种工作者维持例如第一除草剂抗性AHASL1等位基因纯合型的第一向日葵品系和第二除草剂抗性AHASL1等位基因纯合型的第二向日葵品系来生产杂种向日葵植物的用途。 

在本发明特定的实施方案中，方法包括除草剂耐受的或除草剂抗性植物的使用。“除草剂耐受”或“除草剂抗性”植物，指的是对至少一种除草剂在通常杀死或抑制正常或野生型植物生长的水平上是耐受的或抗性的植物。在本发明的一项实施方案中，本发明的除草剂耐受植物包含除草剂耐受或除草剂抗性的AHASL蛋白。“除草剂耐受的AHASL蛋白”或“除草剂抗性的AHASL蛋白”指的是这样的蛋白质，当至少一种已知干扰AHAS活性的除草剂存在以及处于已知抑制野生型AHASL蛋白的AHAS活性的除草剂浓度或水平时，其显示出相对于野生型AHASL蛋白的AHAS活性更高的AHAS活性。另外，此类除草剂耐受或除草剂抗性AHASL蛋白的AHAS活性在本文中可称为“除草剂耐受”或“除草剂抗性”AHAS活性。 

对于本发明，术语“除草剂耐受”和“除草剂抗性的”可互换使用，并认为其具有相同的含义和相同的范围。同样，对于本发明，术语“除草剂耐受性”和“除草剂抗性”可互换使用，并认为其具有相同的含义和相同的范围。同样，术语“咪唑啉酮抗性的”和“咪唑啉酮抗性”可互换使用并认为其分别与术语“咪唑啉酮耐受的”和“咪唑啉酮耐受”为相同的含义和相同的范围。 

本发明提供了对至少一种除草剂特别是咪唑啉酮或磺脲类除草剂具有增强的抗性或耐受性的植物、植物组织、植物细胞和宿主细胞。优选的除草剂的量或浓度是“有效量”或“有效浓度”。“有效量”或“有效浓度”分别指的是有效杀死或抑制类似的野生型植物、植物组织、植物细胞、或宿主细胞的量和浓度，但所述量并不如此严重地杀死或抑制本发明的除草剂抗性植物、植物组织、植物细胞、和宿主细胞。通常，除草剂的有效量或有效浓度是农业生产系统中杀死目标杂草所常规使用的量或浓度。该量是本领域中普通技术人员已知的或可容易测定的。 

在特定实施方案中，本发明提供了包含对AHAS抑制性除草剂的商业上可接受水平的抗性或耐受性的向日葵植物。除非本文另有说明或另外从上下文可显而易见的，包含对AHAS抑制性除草剂的该水平的抗性或耐受性的向日葵植物对于有效量或有效浓度的至少一种AHAS抑制性除草剂的施用是抗性的或耐受的。如上所述，除草剂的有效量或浓度是农业生产系统中杀死杂草或目标杂草所常规使用的量或浓度，该量是本领域中普通技术人员已知的或可容易测定的。 

“类似的野生型植物、植物组织、植物细胞或宿主细胞”分别指的是缺少本文所述的本发明的除草剂抗性特征和/或特定多核苷酸的植物、植物组织、植物细胞或宿主细胞。因此，使用术语“野生型”并非有意暗示植物、植物组织、植物细胞或其它宿主细胞在其基因组中缺乏重组DNA，和/或缺乏不同于本文所述的除草剂抗性特征。 

除非另有清楚说明，本文中所用的术语“植物”指的是处于任何发育阶段的植物，以及可附着于或脱离整个完整植物的植物的任一部分或多个部分。此类植物部分包括但不限于植物的器官、组织和细胞。特定植物部分的例子包括茎、叶、根、花序、花、小花、果实、花梗、花序梗、雄蕊、花药、柱头、花柱、子房、花瓣、萼片、心皮、根尖、根冠、根毛、叶毛、种毛、花粉粒、小孢子、子叶、胚轴、上胚轴、木质部、韧皮部、薄壁组织、胚乳、伴细胞、保卫细胞、及任何其它已知的植物器官、组织、和细胞。此外，种子是植物这一点是公认的。 

一方面，本发明提供在其基因组中包含至少一拷贝的AHASL1 A122T突变型等位基因和至少一拷贝的AHASL1 A205T突变型等位基因的向日葵植物。此种向日葵植物包含针对至少一种AHAS抑制性除草剂特别是咪唑啉酮除草剂的商业上可接受水平的耐受性。此类植物被发现可用于农业中、特别是涉及使用如本文所述的咪唑啉酮除草剂控制杂草的方法中。 

另一方面，本发明提供在其基因组中包含至少一拷贝的AHASL1A122T突变型等位基因和至少一拷贝AHASL1 P197L突变型等位基因的向日葵植物。此种向日葵植物包含针对至少一种AHAS抑制性除草剂特别 是磺脲类和/或咪唑啉酮除草剂的商业上可接受水平的耐受性。此类植物被发现可用于农业中、特别是涉及使用如本文所述的咪唑啉酮和/或磺脲类除草剂控制杂草的方法中。 

本发明涉及包含AHASL1基因的向日葵植物的用途，所述AHASL1基因包含A122T突变。该AHASL1基因编码包含A122T氨基酸置换的AHASL1蛋白质。本发明并不依赖于包含具有A122T突变的AHASL1基因的特定向日葵品种、品系或植物的用途。可将任何包含至少一个具有A122T突变的AHASL1基因的等位基因的向日葵植物用于本文所述的方法中。在本发明的一项实施方案中，具有A122T突变的AHASL1基因包含含有SEQ ID NO：19所述核苷酸序列或编码SEQ ID NO：20所述氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸。 

包含至少一拷贝AHASL1 A122T突变型等位基因的向日葵品系的一个例子是GM40(参见，WO2007005581和2005年7月1日提交的美国临时专利申请系列号60/695,952，将二者均引入本文作为参考)。GM40向日葵种子于2005年5月17日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)(美国弗吉尼亚州马纳萨斯20110)的专利保藏所并分配ATCC专利保藏号PTA-6716。向日葵品系GM40保藏期限为至少30年并且在ATCC收到提供保藏样品的最近要求之后保藏至少5年。另外，申请人已满足了37C.F.R.§§1.801-1.809的所有要求，包括提供样品的存活证明。 

包含至少一拷贝AHASL1 A122T突变型等位基因的向日葵品系的另一例子为GM1606(参见，WO2007005581)。GM1606向日葵种子于2006年5月19日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)(美国弗吉尼亚州马纳萨斯20110)的专利保藏所并分配ATCC专利保藏号PTA-7606。向日葵GM1606保藏期限为至少30年、并在ATCC收到提供保藏样品的最近要求之后至少5年。另外，申请人已满足了37C.F.R.§§1.801-1.809的所有要求，包括提供样品的存活证明。 

本发明涉及使用包含AHASL1基因的向日葵植物的用途，所述AHASL1基因包含A205V突变。该AHASL1基因编码包含A205V氨基酸 置换的AHASL1蛋白质。本发明并不依赖于包含具有A205V突变的AHASL1基因的特定向日葵品种、品系或植物的用途。可将包含至少一个具有A205V突变的AHASL1基因的等位基因的任何向日葵植物用于本文所述的方法中。在本发明的一项实施方案中，具有A205V突变的AHASL1基因包含含有SEQ ID NO：23所述核苷酸序列或编码SEQ ID NO：24所述氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸。 

包含至少一种具有A205V突变的AHASL1基因等位基因的向日葵植物广泛用于商业化向日葵生产并很容易获得。任何此类商业可获得的向日葵植物品种均可用于本文所述的方法中。此类品种可从多个商品种子公司(例如Nidera S.A.，Buenos Aires，Argentina；Dekalb Genetics Corporation，Dekalb，IL，USA；Mycogen Seeds，Indianapolis，IN，USA；Seeds 2000，Breckenridge，MN，USA；Triumph Seed Company，Ralls，TX，USA)来源获得，并且其包括但不限于Paraíso 101CL，Paraíso 102CL，DKF38，-80CL，8H429CL，8H419CL，8H386CL，8H358CL，629CL，630，CL，4682NS/CL，4880NS/CL，Barracuda，Charger，Viper，620CL，650CL，和660CL。另外，包含至少一种具有A205V突变的AHASL1基因等位基因的向日葵植物种子由科罗拉多州、福特科林斯的国家遗传资源保藏中心保藏，可通过检索号PI633749和PI633750来获得。 

本发明涉及使用包含AHASL1基因的向日葵植物的用途，所述AHASL1基因包含P197L突变。该AHASL1基因编码包含P197L氨基酸置换的AHASL1蛋白质。本发明并不依赖于包含具有P197L突变的AHASL1基因的特定向日葵品种、品系或植物的用途。可将包含至少一个具有P197L突变的AHASL1基因的等位基因的任何向日葵植物用于本文所述的方法中。包含至少一种具有P197L突变的AHASL1基因等位基因的向日葵植物已在WO2006024351和美国国家阶段专利申请系列号11/659,007(国际申请日2005年7月29日)中公开；将二者均引入本文作为参考。在本发明的一项实施方案，具有P197L突变的AHASL1基因包含含有SEQ ID NO：21所述核苷酸序列或编码SEQ ID NO：22所述氨基酸序 列的核苷酸序列的多核苷酸。 

包含至少一种具有P197L突变的AHASL1基因等位基因的向日葵品系已由美国农业研究服务部所公开分发。三种品系是HA469、RHA470、和RHA471。三种品系中每种的种子均可从美国北达科他州58105Fargo北达科他州立大学Loftsgard Hall植物科学系种畜项目获得。 

本发明涉及在向日葵AHASL1基因中具有突变的向日葵植物。这些突变产生了向日葵AHASL1蛋白质，当将该蛋白与野生型向日葵AHASL1蛋白质的氨基酸序列相比时，其氨基酸序列中包含了特定的氨基酸置换。此类氨基酸置换包括例如，A122T、A205V、和P197L。“A122T”指的是在与拟南芥AHASL1蛋白质中122位氨基酸相对应的向日葵AHASL1蛋白质位置上用苏氨酸置换丙氨酸。“A205V”是指在与拟南芥AHASL1蛋白质中205位氨基酸相对应的向日葵AHASL1蛋白质位置上用缬氨酸置换丙氨酸。“P197L”是指在与拟南芥AHASL1蛋白质中197位氨基酸相对应的向日葵AHASL1蛋白质位置上用亮氨酸置换脯氨酸。 

除非另外指出或从上下文显而易见，本文所述的向日葵AHASL1蛋白质中的氨基酸位置是在已详细研究的拟南芥AHASL1蛋白质中的相应位置。相应于拟南芥AHASL1氨基酸位置122、197和205的向日葵AHASL1蛋白质中的氨基酸位置分别是107、182和190。参见WO2007005581(其中表4)获得有关已知氨基酸置换位置的其它信息，以及它们在向日葵和拟南芥AHASL1蛋白质中的相应位置，所述置换赋予了AHASL蛋白的除草剂抗性。 

本发明提供了在本文所公开的向日葵AHASL1蛋白质保守区内的特定氨基酸位置上具有氨基酸置换的AHASL蛋白。另外，普通技术人员将认识到，此类氨基酸位置可取决于是否在例如氨基酸序列的N末端添加或除去氨基酸而改变。因此，本发明包含在所述位置或等同位置上的氨基酸置换。“等同位置”是指与例举的氨基酸位置相同的保守区内的位置。此类保守区是本领域中已知的(参见WO20070055581中的表4)、或可通过多序列比对或通过本领域已知的其它方法来测定。 

本发明另外提供了生产包含对至少一种AHAS抑制性除草剂具有抗性的杂种向日葵植物的方法。该方法包括将第一向日葵植物与第二向日葵植物异花受粉从而产生杂种向日葵种子，可种植该种子并促使其生长成杂交向日葵植物，特别是F1代杂交向日葵植物。第一向日葵植物在其基因组中包含至少一个拷贝的AHASL1基因的第一等位基因，第二向日葵植物在其基因组中包含至少一个拷贝的AHASL1基因的第二等位基因。优选地，第一向日葵植物是第一等位基因纯合型的，第二向日葵植物是第二等位基因的纯合型的。第一等位基因编码包含A122T氨基酸置换的向日葵AHASL1蛋白质。第二AHASL1等位基因编码包含A205V氨基酸置换或P197L氨基酸置换的向日葵AHASL1蛋白质。 

生产杂种向日葵植物的方法可进一步包括收获从所述杂交获得的种子并从所述杂交筛选至少一个子代向日葵植物，该植物在其基因组中包含所述第一和所述第二等位基因。该子代可通过本领域中已知的任何方法来筛选，包括PCR扩增AHASL1基因的全部或部分来确定存在于植物中的等位基因。用于此PCR扩增中的DNA可从杂交所获得的向日葵种子部分或从该种子生长出的植物部分得到。在下面的实施例2中，提供了包括PCR扩增的用于筛选目标子代植物的本发明优选方法。备选地，可通过如下文所述的在温室或田间条件下的除草剂抗性测试中评估子代植物的性能来筛选子代植物。 

在本发明优选的实施方案中，通过将A205V AHASL1等位基因纯合型的第一向日葵植物与AHASL1A122T等位基因纯合型的第二向日葵植物杂交来生产本发明的杂种向日葵植物。预期所有获得的杂种种子和从该种子生长出的杂种植物均在其基因组中包含一个A205V AHASL1等位基因和一个AHASL1A122T等位基因。在此优选的实施方案中，第一或第二向日葵均可作为杂交的花粉供体。 

在本发明的另一优选实施方案中，通过将P197L AHASL1等位基因纯合型的第一向日葵植物与AHASL1A122T等位基因纯合型的第二向日葵植物杂交来生产本发明的杂种向日葵植物。预期所有获得的杂种种子和从 该种子生长出的杂种植物均在其基因组中包含一个P197L AHASL1等位基因和一个AHASL1A122T等位基因。在此优选的实施方案中，第一或第二向日葵均可作为杂交的花粉供体。 

对于本发明，除非另外清楚指出或从上下文中显而易见，“子代植物”是从本发明的至少一株植物遗传得到的任何植物，包括但不限于本发明植物的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、和第十代后代。优选地，此类子代或后代包含与野生型植物相比时对至少一种咪唑啉酮除草剂增强的抗性，且此类子代或后代进一步包含至少一种选自A122T、A205V和P197L等位基因的突变AHASL1等位基因。甚至更优选地，此类子代或后代包含与野生型植物相比时对至少一种咪唑啉酮除草剂增强的抗性，且此类子代或后代进一步包含两种不同的选自A122T、A205V和P197L等位基因的突变AHASL1等位基因。 

在本发明的一项实施方案中，本发明的向日葵植物包含A122T等位基因并产生包含可提取的种子油的种子，所述种子油包含至少85％(w/w)的油酸或每千克油850g油酸。 

优选地，通过分析植物油的标准方法(例如，Official Methods of Analysis of Association of the Official Analytical Chemists(1990)W.Horwitz，ed.，第14版，Washington，D.C.和/或AOCS-American Oil Chemists’Society，Official and Tentative Methods of the American Oil Chemists’Society(1998)第5版，Chicago，Illinois中所述的方法)来测定本发明向日葵种子油中％油酸含量。 

本发明提供了用于增强植物、植物组织、植物细胞、或其它宿主细胞对至少一种干扰AHAS酶活性的除草剂的耐受性或抗性的方法。优选地，该除草剂为咪唑啉酮除草剂、磺脲类除草剂、三唑并嘧啶除草剂、嘧啶基氧基苯甲酸酯除草剂、磺酰氨基-羰基三唑啉酮除草剂、或其混合物。更优选地，该除草剂是咪唑啉酮除草剂、磺脲类除草剂、或其混合物。对于本发明，咪唑啉酮除草剂包括但不限于 (咪草烟)、 (甲基咪草烟)， (咪草啶酸)， (灭草喹)， (imazethabenz)， (灭草烟)，任何前述除草剂的衍生物，以及两种或多种前述除草剂的混合物，例如，灭草烟/咪草啶酸 更特别地，咪唑啉酮除草剂可选自，但不限于，2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-烟酸、[2-(4-异丙基)-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-3-喹啉羧酸、5-乙基-2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-烟酸、2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-5-(甲氧基甲基)-烟酸、[2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-5-甲基烟酸、以及6-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-间-甲苯甲酸甲酯和2-(4-异丙基-4-甲基-5-]氧代-2-咪唑啉-2-基)-对-甲苯甲酸甲酯的混合物。使用5-乙基-2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-烟酸和2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-5-(甲氧基甲基)-烟酸是优选的。使用2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-5-(甲氧基甲基)-烟酸是特别优选的。 

对于本发明，磺脲类除草剂包括但不限于绿黄隆、甲黄隆、嘧黄隆、氯嘧黄隆、噻吩磺隆、苯黄隆、苄嘧黄隆、烟嘧黄隆、胺苯黄隆、玉嘧黄隆、氟胺磺隆、醚苯黄隆、氟嘧黄隆、醚黄隆、磺氨黄隆、啶咪黄隆、吡啶磺隆、吡氯黄隆、四唑黄隆、环丙嘧磺隆、乙氧嘧黄隆、啶嘧黄隆、氟啶嘧黄隆、甲酰胺黄隆、碘黄隆、环丙氧黄隆、磺胺磺隆、氟丙黄隆、乙黄黄隆、三氟啶磺隆、氟胺黄隆、任一上述除草剂的衍生物、以及两种或多种上述除草剂的混合物。本发明的三唑并嘧啶除草剂包括但不限于，唑嘧磺胺盐、唑嘧磺胺、双氟磺草胺、氟唑啶草、唑草磺胺、和五氟磺草胺。本发明的嘧啶基氧基苯甲酸酯除草剂包括但不限于，双嘧苯甲酸、嘧硫苯甲酸、肟啶草、嘧苯草肟和环酯草醚。磺酰氨基-羰基三唑啉酮除草剂包括但不限于，氟酮磺隆和丙苯黄隆。 

公认嘧啶基氧基苯甲酸酯除草剂与嘧啶基硫代苯甲酸除草剂是密切相关的，且由美国杂草科学协会将其统一概括在后者的标题下。因此，本发明的除草剂进一步包括嘧啶基硫代苯甲酸除草剂，包括但不限于上述嘧啶基氧基苯甲酸酯除草剂。 

本发明的除草剂抗性向日葵植物被发现可用于控制杂草的方法中。因 此，本发明另外提供了控制本发明除草剂抗性向日葵植物附近的杂草的方法。该方法包括对杂草和除草剂抗性向日葵植物施用有效量的除草剂，其中所述植物当与野生型向日葵植物相比时具有对至少一种除草剂特别是咪唑啉酮或磺脲类除草剂增强的抗性。 

在一项实施方案中，本发明提供了控制感染的向日葵植物上称为列当的寄生杂草(列当属)的方法。该列当属包括例如Orobanche cumana和弯管列当。该方法包括对杂草和本发明的除草剂抗性向日葵植物施用有效量的咪唑啉酮除草剂，特别是包含两拷贝AHASL1A122T等位基因的向日葵植物、或包含一拷贝AHASL1A122T等位基因和一拷贝A205V AHASL1等位基因的向日葵植物。在优选的实施方案中，咪唑啉酮除草剂时灭草烟。优选地，在生长阶段晚期或生殖阶段早期施用AHAS抑制性除草剂。更优选地，在生殖阶段早期施用除草剂。最优选地，在R1生长阶段施用除草剂。 

除非另有说明，本文中向日葵生长状态指的是Schneiter和Miller(1981)Crop Sci.21：901-903中所述的生长阶段。 

通过提供具有对除草剂特别是咪唑啉酮和磺脲类除草剂具有增强的抗性的向日葵植物，很多种制剂可用于保护植物免受杂草干扰，从而增强植物生长和减少营养竞争。除草剂本身可用于出苗前、出苗后、种植前和种植时对本文所述植物周围区域中杂草的控制，或者咪唑啉酮除草剂制剂可包含其它添加剂来使用。也可将除草剂用作种子处理。咪唑啉酮或磺脲类除草剂制剂中所发现的添加剂包括其它除草剂、去污剂、佐剂、铺展剂、粘着剂、稳定剂等等。除草剂制剂可为湿的或干的制剂，可包括但不限于可流动的粉末、可乳化的浓缩物、和液体浓缩物。除草剂和除草剂制剂可根据常规方法例如通过喷雾、灌溉、撒粉等等来施用。 

本发明提供了对至少一种除草剂特别是AHAS抑制性除草剂、更特别地是咪唑啉酮和磺脲类除草剂具有增强的耐受性的非转基因和转基因种子。此类种子包括例如非转基因向日葵种子，其包含向日葵植物S4897、向日葵植物GM40、向日葵植物GM1606、具有ATCC专利保藏号 PTA-6716的向日葵植物、或具有ATCC专利保藏号PTA-7606的向日葵植物的除草剂耐受特性，以及包含编码除草剂抗性AHASL蛋白的本发明多核苷酸分子的转基因种子。 

本发明提供了涉及使用至少一种选自下列的AHAS抑制性除草剂的方法：咪唑啉酮除草剂、磺脲类除草剂、三唑并嘧啶除草剂、嘧啶基氧基苯甲酸酯除草剂、磺酰氨基-羰基三唑啉酮除草剂、及其混合物。在这些方法中，AHAS抑制性除草剂可通过本领域已知的任何方法来施用，包括但不限于种子处理、土壤处理和叶处理。 

在施用之前，可将AHAS抑制性除草剂转换为常规制剂，例如溶液剂、乳剂、混悬剂、粉尘剂、粉剂、糊剂和粒剂。使用形式取决于特定的预期目的，在每种情况下，均应确保本发明化合物的良好和均匀分布。 

以已知的方式制备制剂(参见，例如US 3,060,084，EP-A 707445(有关液体浓缩物)，Browning，″Agglomeration″，Chemical Engineering，Dec.4，1967，147-48，Perry′s Chemical Engineer′s Handbook，第4版，McGraw-Hill，New York，1963，pages 8-57以及下列等等，WO 91/13546，US 4,172,714，US 4,144,050，US 3,920,442，US 5,180,587，US 5,232,701，US5,208,030，GB 2,095,558，US 3,299,566，Klingman，Weed Control as a Science，John Wiley and Sons，Inc.，New York，1961，Hance等.，Weed Control Handbook，等8版，Blackwell Scientific Publications，Oxford，1989and Mollet，H.，Grubemann，A.，Formulation technology，Wiley VCH Verlag GmbH，Weinheim(Germany)，2001，2.D.A.Knowles，Chemistryand Technology of Agrochemical Formulations，Kluwer Academic Publishers，Dordrecht，1998(ISBN 0-7514-0443-8)，例如通过利用适于农用化学品制剂的辅料(例如溶剂和/或载体，需要的话，乳化剂、表面活性剂和分散剂、防腐剂、消泡剂、防冻剂，对于种子处理制剂还任选着色剂和/或粘合剂和/或胶凝剂)来配制活性化合物。 

合适溶剂的例子有水、芳族溶剂(例如，Solvesso产品、二甲苯)、石蜡(例如矿物油馏分)、醇(例如甲醇、丁醇、戊醇、苯甲醇)、酮(例如环己酮、 γ-丁内酯)、吡咯烷酮(NMP，NOP)、乙酸酯(二乙酸乙二醇酯)、二元醇、脂肪酸二甲基酰胺、脂肪酸和脂肪酸酯。原则上，也可使用溶剂混合物。 

合适载体的例子有碾磨的天然矿物(例如高岭土、粘土、滑石、白垩)和碾磨的合成矿物(例如高度分散的硅土、硅酸盐)。 

合适的乳化剂有非离子和阴离子乳化剂(例如聚氧乙烯脂肪醇醚、烷基磺酸盐和芳基磺酸盐)。 

分散剂的例子有木质素-亚硫酸盐废液和甲基纤维素。 

所使用的合适的表面活性剂有木质素磺酸、萘磺酸、酚磺酸、二丁基萘磺酸的碱金属盐、碱土金属盐和铵盐、烷基芳基磺酸盐、烷基硫酸盐、烷基磺酸盐、脂肪醇硫酸盐、脂肪酸和硫酸化脂肪醇乙二醇醚，另外磺酸萘和萘衍生物与甲醛的缩合物、萘或萘磺酸与酚和甲醛的缩合物、辛基酚聚氧乙烯醚、乙氧基化异辛基酚、辛基酚、壬基酚、烷基酚聚乙二醇醚、三丁基苯基聚乙二醇醚、三硬脂酰苯基聚乙二醇醚、烷基芳基聚醚醇、醇和脂肪醇环氧乙烷羧化物、乙氧基化蓖麻油、聚氧乙烯烷基醚、乙氧基化聚氧丙烯、十二醇聚乙二醇醚乙缩醛、山梨醇酯、木质素亚硫酸盐废液和甲基纤维素。 

适合制备可直接喷雾的溶液剂、乳剂、糊剂或油分散体的物质有中等至高沸点的矿物油馏分，例如煤油或柴油，另外有煤焦油和植物或动物来源的油、脂肪烃、环烃和芳香烃，例如甲苯、二甲苯、石蜡、四氢萘、烷基化萘、或其衍生物、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、环己醇、环己酮、异佛尔酮、高极性溶剂，例如二甲基亚砜、N-甲基吡咯烷酮或水。 

另外可将防冻剂例如甘油、乙二醇、丙二醇和杀菌剂加入制剂中。 

合适的消泡剂有例如基于硅或硬脂酸镁的消泡剂。 

合适的防腐剂有例如二氯酚和enzylalkoholhemiformal。 

种子处理制剂可另外包含粘合剂和任选地着色剂。 

可加入粘合剂以促进处理后活性物质对种子的粘附。合适的粘合剂有嵌段共聚物EO/PO表面活性剂，还有聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丁烯、聚异丁烯、聚苯乙烯、聚乙烯胺、聚 乙烯酰胺、聚乙烯亚胺 聚醚、聚氨基甲酸酯、聚乙烯乙酸酯、甲基纤维素以及衍生自这些聚合物的共聚物。 

任选地，着色剂可包括在制剂中。用于种子处理制剂的合适的着色剂有罗丹明B、C.I.颜料红112、C.I.溶剂红1、颜料蓝15:4、颜料蓝15:3、颜料蓝15:2、颜料蓝15:1、颜料蓝80、颜料黄1、颜料黄13、颜料红112、颜料红48:2、颜料红48:1、颜料红57:1、颜料红53:1、颜料橙43、颜料橙34、颜料橙5、颜料绿36、颜料绿7、颜料白6、颜料棕25、碱性紫10、碱性紫49、酸性红51、酸性红52、酸性红14、酸性蓝9、酸性黄23、碱性红10、碱性红108。 

合适的胶凝剂的例子有角叉菜胶 

粉剂、用于散布的材料、以及粉尘化产品可通过混合或伴随研磨活性物质与固体载体来制备。 

粒剂，例如包衣粒剂、浸渍粒剂和均一粒剂，可通过将活性化合物结合至固体载体来制备。固体载体的例子有矿物土例如硅胶、硅酸盐、滑石、高岭土、镁质粘土(attaclay)、石灰石、石灰、白垩、红玄武土、黄土、粘土、白云石、硅藻土、硫酸钙、硫酸镁、氧化镁、碾磨的合成材料、肥料、例如硫酸铵、磷酸铵、硝酸铵、尿素，以及蔬菜来源的产品，例如谷粉、树皮粉、木粉粉、坚果壳粉、纤维素粉和其它固体载体。 

通常，制剂包含按重量计0.01-95％、优选按重量计0.1-90％的AHAS抑制性除草剂。在此方面，AHAS抑制性除草剂以按重量计90％-100％、优选以重量计95％-100％(根据核磁共振光谱)的纯度被使用。为进行种子处理，可将各个制剂稀释2-10倍，达到直接应用制剂时的浓度为活性化合物以重量计0.01-60％，优选以重量计0.1-40％。 

AHAS抑制性除草剂可以其制剂的形式或从该形式中制备的使用形式来使用，例如以直接可喷雾溶液、粉剂、悬浮液或分散体、乳剂、油分散体、糊剂、粉尘化产品、用于分散的材料、或颗粒的形式，通过喷雾、雾化、撒粉、散布或倾析的方式来使用。使用形式完全取决于其预期目的，在每种情况下均预期确保本发明的AHAS抑制性除草剂最好的可能分布。 

通过向乳剂浓缩物、糊剂或可湿性粉剂(可喷雾粉剂，油分散体)添加水可制备水性使用形式。为制备乳剂、糊剂或油分散体，可将所述的物质或溶解于油或溶剂中的物质通过湿润剂、增粘剂、分散剂或乳化剂在水中匀化。然而，还能够制备由活性物质、湿润剂、增粘剂、分散剂或乳化剂以及如果合适的话溶剂或油组成的浓缩物，此类浓缩物适合用水进行稀释。 

直接应用制剂中活性化合物的浓度可在相对宽的范围内变动。通常，它们可为每份重量0.0001-10％，优选0.01-1％。 

AHAS抑制性除草剂还可用超低容量方法(ULV)成功使用，能够施用包含以重量计超过95％的活性化合物的制剂，或甚至施用无添加剂的活性化合物。 

下面是制剂的例子： 

1.用于叶面施用的用水稀释的产品。为进行种子处理，可将稀释的或未稀释的此类产品施用于种子。 

A)水溶性浓缩物(SL，LS) 

将以重量计的10份AHAS抑制性除草剂溶解于以重量计90份的水中或水溶性溶剂中。备选地，加入湿润剂或其它辅助物。一旦用水稀释，AHAS抑制性除草剂便溶解，从而获得了具有10％(w/w)的AHAS抑制性除草剂的制剂。 

B)可分散浓缩物(DC) 

将以重量计的20份AHAS抑制性除草剂溶解于以重量计的70份环己酮，加入以重量计的10份分散剂，例如聚乙烯吡咯烷酮。用水稀释使其分散，从而获得具有20％(w/w)AHAS抑制性除草剂的制剂。 

C)可乳化的浓缩物(EC) 

将以重量计的15份AHAS抑制性除草剂溶解于以重量计的7份二甲苯，加入十二烷基苯磺酸钙和蓖麻油乙氧基化物(以重量计每种5份)。用水稀释得到乳液，从而获得具有15％(w/w)AHAS抑制性除草剂的制剂。 

D)乳剂(EW、EO、ES) 

将以重量计的25份AHAS抑制性除草剂溶解于以重量计的35份二甲苯，加入十二烷基苯磺酸钙和蓖麻油乙氧基化物(以重量计每种5份)。通过乳化器(例如Ultraturrax)在该混合物中引入以重量计30份的水，制成均匀乳剂。用水稀释使其乳化，从而获得具有25％(w/w)AHAS抑制性除草剂的制剂。 

E)悬浮液(SC、OD、FS) 

在搅拌式球磨机中，将以重量计20份的AHAS抑制性除草剂研磨成粉剂，加入以重量计的10份分散剂、湿润剂，以及以重量计70份水或有机溶剂从而产生优良的AHAS抑制性除草剂悬浮液。用水稀释产生了AHAS抑制性除草剂的稳定悬浮液，从而获得具有20％(w/w)AHAS抑制性除草剂的制剂。 

F)水可分散粒剂和水溶性粒剂(WG、SG) 

将以重量计的50份AHAS抑制性除草剂进行精细研磨，加入以重量计50份的分散剂和湿润剂，通过技术器具(例如，挤压、喷雾塔、流化床)将其制成水可分散的或水溶性的粒剂。用水稀释产生了AHAS抑制性除草剂的稳定的分散体或溶液，从而获得具有50％(w/w)AHAS抑制性除草剂的制剂。 

G)水可分散粉剂和水溶性粉剂(WP、SP、SS、WS) 

将以重量计75份的AHAS抑制性除草剂在转子-定子研磨机中研磨，加入以重量计的25份分散剂、湿润剂和硅胶。用水稀释产生了AHAS抑制性除草剂的稳定分散体或溶液，从而获得具有75％(w/w)AHAS抑制性除草剂的制剂。 

H)凝胶制剂(GF) 

在搅拌式球磨机中，将以重量计20份的AHAS抑制性除草剂研磨成粉，加入以重量计10份分散剂、以重量计1份胶凝剂湿润剂和以重量计70份水或有机溶剂，从而产生细小的AHAS抑制性除草剂悬浮液。用水稀释产生了AHAS抑制性除草剂的稳定悬浮液，从而获得具有20％(w/w)AHAS抑制性除草剂的制剂。该凝胶制剂适合用于种子处理。 

2.用于叶面施用的非稀释用产品。为进行种子处理，可对种子施用稀释的此类产品。

A)粉尘化的粉剂(DP、DS) 

将以重量计5份的AHAS抑制性除草剂精细研磨，并与以重量计95份细分的高岭土紧密混合。这产生了具有5％(w/w)AHAS抑制性除草剂的粉尘化产品。 

B)粒剂(GR、FG、GG、MG) 

将以重量计的半份AHAS抑制性除草剂精细研磨，并与以重量计95.5份的载体结合，从而获得具有0.5％(w/w)的AHAS抑制性除草剂的制剂。目前的方法有挤压、喷雾干燥或流化床。这产生了非稀释施用于叶面的粒剂。 

常规种子处理制剂包括例如可流动的浓缩物FS、溶液LS、用于干燥处理的粉剂DS、用于浆液处理的可分散粉剂WS、水溶性粉剂SS和乳剂ES和EC以及凝胶制剂GF。这些制剂可稀释或非稀释地施用于种子。对种子的施用在播种前进行，或直接施用于种子。 

在优选的实施方案中，将FS制剂用于种子处理。通常，FS制剂可包含1-800g/l活性成分、1-200g/l表面活性剂、0-200g/l防冻剂、0-400g/l粘合剂、0-200g/l颜料和达到1升的溶剂，优选水。 

对于种子处理，用除草剂处理根据本发明的除草剂抗性植物的种子，除草剂优选选自下列AHAS抑制性除草剂，例如磺氨黄隆、四唑黄隆、苄嘧黄隆、氯嘧黄隆、绿黄隆、醚黄隆、环丙黄隆、胺苯黄隆、乙氧嘧黄隆、啶嘧黄隆、氟啶嘧黄隆、氟定黄隆、甲酰胺黄隆、吡氯黄隆、啶咪黄隆、碘黄隆、磺胺磺隆、甲黄隆、烟嘧黄隆、环丙氧黄隆、氟嘧黄隆、氟丙黄隆、吡嘧黄隆、玉嘧黄隆、嘧黄隆、乙黄黄隆、噻黄隆、醚苯黄隆、苯黄隆、三氟啶磺隆、氟胺黄隆、tritosulfuron、咪草酯、咪草啶酸、灭草烟、灭草喹、咪草烟、唑嘧磺胺盐、唑嘧磺胺、双氟磺草胺、氟唑啶草、唑草磺胺、五氟磺草胺、双嘧苯甲酸、肟啶草、丙苯黄隆、氟酮磺隆、嘧苯草肟、环酯草醚、嘧硫苯甲酸、及其混合物、或用包含AHAS抑制性除草剂 的制剂处理。 

术语种子处理包含本领域已知的所有合适的种子处理技术，例如拌种、种子包衣、干式种子消毒、浸种、和种子丸化。 

根据本发明的一种变型，本发明的另一主题是通过特别是在播种机中施用任一颗粒制剂来处理土壤的方法：所述颗粒制剂含有以组合物/制剂形式(例如，颗粒制剂)存在的AHAS抑制性除草剂，任选一种或多种固体或液体，农业上可接受的载体和/或任选一种或多种农业上可接受的表面活性剂。该方法有利地用于例如谷类、玉米、棉花和向日葵的苗床。 

本发明还包含用种子处理制剂包被的或含有该处理制剂的种子，所述制剂包含至少一种选自下列的AHAS抑制性除草剂：磺氨黄隆、四唑黄隆、苄嘧黄隆、氯嘧黄隆、绿黄隆、醚黄隆、环丙黄隆、胺苯黄隆、乙氧嘧黄隆、啶嘧黄隆、氟啶嘧黄隆、甲酰胺黄隆、吡氯黄隆、啶咪黄隆、碘黄隆、磺胺磺隆、甲黄隆、烟嘧黄隆、环丙氧黄隆、氟嘧黄隆、氟丙黄隆、吡嘧黄隆、玉嘧黄隆、嘧黄隆、乙黄黄隆、噻黄隆、醚苯黄隆、苯黄隆、三氟啶磺隆、氟胺黄隆、咪草酯、咪草啶酸、甲基咪草烟、灭草烟、灭草喹、咪草烟、唑嘧磺胺盐、唑嘧磺胺、双氟磺草胺、氟唑啶草、唑草磺胺、五氟磺草胺、双嘧苯甲酸、肟啶草、丙苯黄隆、氟酮磺隆、嘧苯草肟、环酯草醚、和嘧硫苯甲酸。 

术语种子包括所有种类的种子和植物繁殖体，包括但不限于真正的种子、种子块、吸根、球茎、鳞茎、果实、块茎、谷粒、插条、切枝等等，在优选实施方案中指的是真正的种子。 

术语“包被有和/或含有”通常表示施用时活性成分很大程度上在繁殖产品表面，尽管取决于施用方法的不同，或多或少的该成分渗入该繁殖产品。当所述繁殖产品(再)种植时，其可吸收活性成分。 

利用AHAS抑制性除草剂或含有该除草剂的制剂的种子处理应用可通过在植物播种前和植物出苗前对种子进行喷雾或撒粉来完成。 

种子的处理中，通过用有效量的AHAS抑制性除草剂或含有该除草剂的制剂处理种子来施用相应制剂。这里，施用比率通常是每100kg种子0.1g 至10kg的活性成分(或活性成分的混合物、或制剂)，优选每100kg种子1g至5kg，特别是每100kg种子1g至2.5kg。对于特定的作物例如莴苣，该比率可更高。 

本发明提供了用于抑制不需要的植物或控制杂草的方法，其包括在播种前和/或催芽后将根据本发明的抗性植物的种子与AHAS抑制性除草剂接触。该方法可进一步包括播种种子，例如在田间的土壤中、或在温室的盆栽介质中。该方法被发现在抑制种子附近的不希望的植物或控制杂草方面特别有用。 

可将控制不需要的植物理解为杀死杂草和/或另外延缓或抑制杂草的正常生长的意思。杂草，广义而言，应理解为所有生长在不期望的位置的那些植物。 

本发明的杂草包括例如，双子叶和单子叶杂草。双子叶杂草包括但不限于下列属的杂草：白芥属、独行菜属、猪殃殃属、繁缕属、母菊属、春黄菊属、牛膝菊属、藜属、荨麻属、千里光属、苋属、马齿苋属、苍耳属、旋花属、番薯属、蓼属、田菁属、豚草属、蓟属、飞廉属、苦苣菜属、茄属、蔊菜属、节节菜属、母草属、野芝麻属、婆婆纳属、苘麻属、Emex、曼陀罗属、堇菜属、骆驼刺属、罂粟属、矢车菊属、三叶草属、毛茛属、和蒲公英属。单子叶杂草包括但不限于下列属的杂草：稗属、狗尾草属、黍属、马唐属、梯牧草属、早熟禾属、羊茅属、椮属、臀形草属、黑麦草属、雀麦草属、燕麦草属、莎草属、高粱属、冰草属、狗牙根属、雨久花属、Fimbristyslis、慈姑属、荸荠属、莞草属、雀稗属、鸭嘴草属、尖瓣花属、龙爪茅属、剪股草属、看麦娘属、和Apera。其它双子叶杂草包括但不限于，感染向日葵的寄生植物，特别是，列当属(列当)，例如，Orobanche cumana和弯管列当。 

另外，本发明的杂草可包括例如，生长在不期望位置的作物植物。例如，生长在主要包含大豆植物的田间中的自生型玉米可被视为杂草，如果该玉米植物并不被期望在该大豆植物的田间中的话。 

本发明的向日葵植物可用一种或多种目的基因转化。本发明的目的基 因依目标结果而不同。例如，表型的多种变化可以是重要的，包括改变植物中的脂肪酸组成、改变植物的氨基酸含量、改变植物的昆虫和/或病原体防御机制、等等。可通过提供异源产物的表达或植物中内源产物的增加表达来获得这些结果。备选地，可通过提供一种或多种内源产物特别是植物中的酶或辅因子的表达降低来获得。这些改变导致转化植物的表型改变。 

在本发明的一项实施方案中，目的基因包括昆虫抗性基因例如，苏云金芽孢杆菌毒素蛋白基因(美国专利号5,366,892；5,747,450；5,736,514；5,723,756；5,593,881；和Geiser等(1986)Gene 48：109)。 

本发明提供了鉴定个体向日葵中AHASL1基因的等位基因的诊断方法。下面所述的此类诊断方法被发现可用于培育对咪唑啉酮除草剂具有增强抗性的商业化向日葵栽培品种的方法中。下面对本文在这些方法的描述中所使用的下列术语进行定义。 

“引物”是单链寡核苷酸，具有5’端和3’端，其能够与靶DNA链上的退火位点退火，并且引物充当DNA聚合酶进行的DNA合成的起始点，特别是在聚合酶链式反应(PCR)扩增中。该引物可与靶DNA上其退火位点完全互补或不完全互补。 

靶DNA链上的“退火”位点是引物在本发明的方法中能够退火的位置。 

通常对于用PCR进行的基因片段的扩增，使用与双链DNA分子的相反链退火的一对引物。按照标准惯例和本文所用的，除非另有说明或从上下文中显而易见的，“正向引物”与基因的非编码链退火，而“反向引物”与编码链退火。 

贯穿于整个说明书中，术语“突变型等位基因”、“突变型AHASL1等位基因”或“AHASL1基因”，除非本文另有说明或从上下文中显而易见，这些术语指的是编码咪唑啉酮耐受性AHASL1蛋白质的多核苷酸，所述蛋白在与野生型AHASL1蛋白质相比较时，包含单个氨基酸置换。此类单个氨基酸置换包括，例如，A122T、A205V、和P197L。通常，该氨基酸置换是由AHASL1编码序列中单个核苷酸置换导致。 

相反，除非另有说明，术语“野生型等位基因”、“野生型AHASL1等 位基因”或“野生型AHASL1基因等位基因”指的是编码AHASL1蛋白质的多核苷酸。 

本发明涉及多种引物在PCR扩增中的用途。下面对这些引物进行详细描述。 

“正向AHASL1引物”是能够用于涉及PCR扩增向日葵AHASL1等位基因片段的本发明方法中的引物，其中该片段从产生A122T氨基酸置换的突变位点向5’方向延伸。优选地，“正向AHASL1引物”退火位点的互补序列在如图8所示的(ACC)_n重复序列的5’侧。 

“反向野生型AHASL1引物”是能够用于下述方法中的反向引物，该方法涉及对不包含产生A122T氨基酸置换的突变的AHASL1等位基因片段的PCR扩增。反向引物的退火位点显示于图8中。反向野生型AHASL1引物的3’末端(或3’端)核苷酸与图8的Hap1-Hap5中SNP位点的G退火。反向野生型AHASL1引物的3’末端核苷酸是C。 

“反向突变型AHASL1引物”是可用于下述方法中的反向引物，该方法涉及对包含产生A122T氨基酸置换的突变的突变型AHASL1等位基因片段的PCR扩增。反向引物的退火位点在图8中显示。反向突变型AHASL1引物的3’末端(3’端)核苷酸与位于图8中SNP位点的Hap6中的A退火。反向野生型AHASL1引物的3’末端核苷酸是T。 

本发明提供了用于向日葵AHASL1基因分型的方法。该方法包括从向日葵植物获得基因组DNA并利用其基因组DNA或样品或其部分作为模板进行第一次聚合酶链反应(PCR)扩增，其中包含基因组DNA、聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸、正向AHASL1引物和反向野生型AHASL1引物。反向野生型AHASL1引物包含与包含SEQ ID NO：13所示核苷酸序列的核苷酸序列退火的核酸分子，其中位于所述反向野生型AHASL1引物3’端核苷酸的核苷酸是SEQ ID NO：13所示核苷酸序列的第1位核苷酸的互补序列。该方法进一步包括利用基因组DNA或其样品或部分作为模板进行第二次PCR扩增，其中包含所述DNA、聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸、所述正向AHASL1引物和突变型反向AHASL1引物。反向突变型AHASL1 引物包含与包含SEQ ID NO：14所示核苷酸序列的核苷酸序列退火的核酸分子，其中位于所述反向突变型AHASL1引物3’端核苷酸的核苷酸是SEQ ID NO：14所示核苷酸序列的第1位核苷酸的互补序列。该方法进一步包括检测所述第一和第二PCR扩增的产物。 

在适合于图8所示的向日葵AHASL1基因的部分进行PCR扩增的条件下，本发明的反向野生型AHASL1和反向突变型AHASL1引物分别与包含SEQ ID NO：13和14所示核苷酸序列的核苷酸序列退火。反向野生型AHASL1和反向突变型AHASL1引物另外具有由引起A122T氨基酸置换突变的位置上的核苷酸组成的3’端核苷酸。每种反向引物可以但并不需要与其退火位点完全互补，不需要延伸至退火位点的全长。另外，反向野生型和突变型AHASL1引物可在其退火位点之外的5’端包含另外的核苷酸。此类另外的核苷酸可以但不需要与向日葵AHASL1基因的部分完全或甚至部分互补。所述另外的5’核苷酸可包括例如限制酶识别序列。在本发明的一项实施方案中，反向野生型AHASL1和反向野生型AHASL1引物分别包含SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。 

进行向日葵AHASL1基因分型的方法包括正向AHASL1引物的使用。与在引起A122T氨基酸置换突变的位点退火的反向野生型AHASL1和反向突变型AHASL1引物不同，正向AHASL1引物核苷酸的退火位点对应于图8所示的(ACC)_n区域5’的向日葵AHASL1基因的区域，从而可通过所获得的PCR产物长度(即bp)的不同区别单倍型1-6。A122T突变位点附近的这些单倍型序列显示于图8中。在本发明的一项实施方案中，正向AHASL1引物与包含SEQ ID NO：12所示核苷酸序列的互补核苷酸的核苷酸序列退火。在本发明优选的实施方案中，正向AHASL1引物包含包含SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的核苷酸分子，并且在甚至更优选的实施方案中，正向AHASL1引物具有如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，任选在引物的5’端具有另外的核苷酸。此类另外的核苷酸可以但并不需要与向日葵AHASL1基因的部分完全或甚至部分互补。所述另外的5’核苷酸可包括例如限制酶识别序列。 

本发明进一步提供了鉴定向日葵植物中AHASL1等位基因的方法。该方法包括从向日葵植物中获得基因组DNA并利用基因组DNA或其样品或部分进行至少一次PCR扩增。PCR扩增包括利用基因组DNA作为模板进行聚合酶链反应扩增，其中包含基因组DNA、聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸、包含SEQ ID NO：15所示核苷酸序列的第一正向引物、包含SEQ IDNO：16所示核苷酸序列的第一反向引物、包含SEQ ID NO：17所示核苷酸序列的第二正向引物、和包含SEQ ID NO：18所示核苷酸序列的第二反向引物。该方法进一步包括检测PCR扩增的产物。 

备选地，两次或甚至三次单独的PCR扩增可用于本发明的方法中。当使用两次单独的PCR扩增时，第一次PCR扩增涉及利用基因组DNA作为模板进行第一聚合酶链反应扩增，其中包含基因组DNA、聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸、包含SEQ ID NO：15所示核苷酸序列的第一正向引物、和包含SEQ ID NO：16所示核苷酸序列的第一反向引物。第二PCR扩增反应涉及利用基因组DNA作为模板进行第二次聚合酶链反应扩增，其中包含基因组DNA、聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸、包含SEQ ID NO：17所示核苷酸序列的第二正向引物、和包含SEQ ID NO：18所示核苷酸序列的第二反向引物。第一PCR扩增可任选包含包含SEQ ID NO：18所示核苷酸序列的第三引物，而第二PCR扩增可任选包含包含SEQ ID NO：15所示核苷酸序列的第三引物。向第一和第二PCR扩增之一或二者添加该任选引物允许对照条带的产生，该条带是通过包含SEQ ID NOS：15和18所示核苷酸序列的引物对所扩增出来的。该方法进一步包括检测第一和第二PCR扩增的产物。 

当使用三次单独的PCR扩增时，第一和第二PCR扩增如上所述。第三PCR扩增包括利用基因组DNA作为模板进行第三聚合酶链反应扩增，其中包含基因组DNA、聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸、包含SEQ ID NO：15所示核苷酸序列的第一正向引物、和包含SEQ ID NO：18所示核苷酸序列的第二反向引物。该方法进一步包括检测第一、第二和第三PCR扩增的产物。 

在本发明的一个实施方案中，第一正向引物具有基本上由SEQ ID NO：15组成的核苷酸序列，第一反向引物具有基本上由SEQ ID NO：16组成的核苷酸序列，第二正向引物具有基本上由SEQ ID NO：17组成的核苷酸序列，和/或第二反向引物具有基本上由SEQ ID NO：18组成的核苷酸序列。对于本发明，“基本上由”示例序列组成的引物是指由完整的示例序列组成但可在引物的5’端另外包括核苷酸的引物。此类另外的核苷酸可以但并不需要与扩增的靶基因完全或部分互补。因为DNA合成起始于引物的3’端，当与除另外的核苷酸之外的序列相一致的引物相比时，此类另外的核苷酸不会改变DNA合成的起始位点。 

在本发明优选的实施方案中，第一正向引物具有由SEQ ID NO：15组成的核苷酸序列，第一反向引物具有由SEQ ID NO：16组成的核苷酸序列，第二正向引物具有由SEQ ID NO：17组成的核苷酸序列，和/或第二反向引物具有由SEQ ID NO：18组成的核苷酸序列。 

除非本文另有说明，“聚合酶”是指DNA聚合酶，特别是适合用于本发明的一种或多种PCR扩增中的DNA聚合酶。 

在本发明的方法中，PCR扩增的结果可通过例如PCR产物的琼脂糖凝胶电泳、随后通过对凝胶中的DNA进行溴化乙锭染色并在紫外线存在下进行观察来检测。 

本发明的方法包括使用PCR扩增DNA。可设计寡核苷酸引物用于PCR反应中从而从提取自任何目的生物体的基因组DNA或cDNA扩增相应的DNA序列。设计PCR引物的方法是本领域中公知的并在Sambrook等(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)中公开，将其引入本文作为参考。另外参见，Innis等，eds.(1990)PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications(Academic Press，New York)；Innis和Gelfand，eds.(1995)PCR Strategies(Academic Press，New York)；Innis和Gelfand，eds.(1999)PCR Methods Manual(Academic Press，New York)；Dietmaier等.eds.(2002)Rapid Cycle Real Time PCR-Methods and Applications，(Springer  Verlag，New York)；Theophilus和Raphley，eds.(2002)PCR Mutation Detection Protocols(Humana Press，New York)；以及Bartlett和Stirling，eds.(2003)PCR Protocols(Humana Press，New York)，将所有这些均引入本文作为参考。其它已知的可用于本发明方法中的PCR方法包括但不限于，利用成对引物、嵌套引物、单个特异性引物、简并引物、基因特异性引物、混合的DNA/RNA引物、载体特异性引物、部分错配的引物等等。 

本文术语“引物”或“PCR引物”的使用并不是有意将本发明限制为包含DNA的引物。本领域普通技术人员将认可，此类引物可包含例如脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、及其组合。此类脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸包括天然存在的分子和合成类似物。 

尽管本发明并不依赖于特定数量核苷酸的PCR引物，还是应当认识到，与模板DNA上其互补的靶标退火的PCR引物部分通常在大约10至50个连续核苷酸之间，优选10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个连续核苷酸。然而，本发明的PCR引物可进一步在其5’端包含并不打算将与靶退火的另外的核苷酸，例如包含一个或多个限制酶识别位点的DNA序列。 

本发明的方法包括使用DNA聚合酶进行DNA的PCR扩增。任何本领域已知的能够通过PCR扩增靶DNA的DNA聚合酶均可用于本发明的方法中。本发明的方法并不依赖于特定的DNA聚合酶进行DNA的PCR扩增，只要此类聚合酶能够扩增一种或多种植物AHASL基因或其片段。优选地，本发明的DNA聚合酶是热稳定的DNA聚合酶，包括但不限于：Taq聚合酶、Pfu聚合酶、也已被称为Tgo DNA聚合酶的来自Thermococcus gorgonarious的热稳定DNA聚合酶、来自Thermococcus litorali的热稳定DNA聚合酶，例如被称为 DNA聚合酶(Perler，F.等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，5577)的那些，来自焦球菌属(Pyrococcus)GB-D种的热稳定DNA聚合酶，例如被称为Deep DNA聚合酶的那些(Xu，M.等(1993)Cell 75，1371-1377)，以及其修饰形式和混合物。 

本发明的方法包括通过PCR扩增靶DNA序列。在本发明的一些实施 方案中，靶DNA序列将直接从包含基因组DNA的样品中扩增，所述基因组DNA分离自至少一种植物或其部分、器官、组织、或细胞。本领域普通技术人员将认识到，基因组DNA的量或浓度将取决于很多因素，包括但不限于PCR条件(例如，退火温度、变性温度、循环数目、引物浓度、dNTP浓度等等)、热稳定DNA聚合酶、引物的序列、和靶的序列。通常，在本文所述发明的实施方案中，基因组DNA的浓度是至少约5ng/μL至约100ng/μL。 

除了PCR扩增，本发明的方法可包括多种分子生物学技术，包括例如，DNA分离，特别是基因组DNA分离、通过限制酶和核酸酶对DNA或PCR产物的消化、DNA连接、DNA测序、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、用于电泳分离DNA的任何其它合适基质中的凝胶电泳、通过溴化乙锭染色对DNA的检测等等。此类技术是本领域公知的并已公开在例如Sambrook等(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)中。 

本发明的方法包括分离自植物的基因组DNA的使用。本发明的方法并不依赖于通过任何特定方法分离的基因组DNA。本领域已知的用于从植物中分离或纯化基因组DNA的任何方法均可用于本发明的方法中，所述基因组DNA可用作上述PCR扩增的模板DNA的来源。参见，例如，Stein 等((2001)Plant Breeding，12：354-356)；Clark，ed.((1997)Plant Molecular Biology-A Laboratory Manual，Springer-Verlag，New York，pp.3-15)；Miller等，((1988)Nucleic Acids Research，16：1215)，将所有这些均引入本文作为参考。优选地，用于分离植物基因组DNA的此类方法适合、或可由本领域普通技术人员改良后用于从相对大量的植物组织样品分离基因组DNA。在本发明的实施方案中，利用 试剂盒(Qiagen Inc.，Valencia，CA，USA)根据厂家说明书从向日葵植物中分离基因组DNA。在另一实施方案中，利用 试剂盒(Promega Corp.，Madison，WI，USA)根据厂家说明书从向日葵植物中分离基因组DNA。 

对于本发明的方法，基因组DNA可从完整植物或其部分、器官、组 织或细胞分离。例如，基因组DNA可分离自幼苗、叶、茎、根、花序、种子、胚、分蘖、胚芽鞘、花药、柱头、培养细胞、等等。另外，本发明并不依赖于从处于任何特定发育阶段的植物或其部分、器官、组织或细胞分离基因组DNA。该方法可使用分离自例如幼苗或成熟植物或其部分、器官、组织或细胞的基因组DNA。另外，本发明并不依赖于在任何特定条件下生长的植物。植物可例如在田间条件下、在温室或生长室中培养，栽培或甚至在温室或生长室中水栽。通常，将植物在有利于植物生长和发育的光、温度、营养和湿度的条件下培养。 

本发明的方法包括检测PCR扩增的产物。通常，通过首先基于分子量从基质中分离产物、然后检测基质中每种分离的PCR产物来对PCR产物进行检测。在本发明优选的实施方案中，通过PCR产物的琼脂糖凝胶电泳、随后通过凝胶中DNA的溴化乙锭染色并在紫外线存在下通过荧光显示凝胶检测PCR产物。然而，任何适合分离多核苷酸的检测方法均可用于检测本发明的PCR产物，包括但不限于凝胶电泳、高效液相层析、毛细管电泳等等。用于此类方法的基质包括例如琼脂糖、聚丙烯酰胺、二乙基氨基乙基纤维素、羟基烷基纤维素、琼脂糖、聚氧乙烯等等。本发明的PCR扩增可包括使用一种或多种标记的引物，所述标记例如为放射性标记、或用荧光染料、发光标记、顺磁标记、或任何其它适合检测核酸的标记。当PCR扩增包括一种或多种此类标记的引物时，检测步骤可包括通过任何本领域已知的用于检测该标记的方法对放射性、荧光、发光、顺磁、或其它标记进行检测。 

本发明还提供了实施对本文所述向日葵AHASL1进行基因分型的方法的试剂盒。此类试剂盒包含如本文所述的本发明的引物，特别是正向AHASL1引物、反向野生型AHASL1引物、和反向突变型AHASL1引物。优选地，正向AHASL1引物包含与图8所示的(ACC)_n区域5’的向日葵AHASL1基因区域相对应的核苷酸序列，反向野生型AHASL1引物与包含SEQ ID NO：13所示核苷酸序列的核苷酸序列退火，反义突变型AHASL1引物与包含SEQ ID NO：14所示核苷酸序列的核苷酸序列退火。 更优选地，正向AHASL1引物包含与图8所示的(ACC)_n区域5’的向日葵AHASL1基因相对应的核苷酸序列，反向野生型AHASL1引物与包含SEQ ID NO：13所示核苷酸序列的核苷酸序列退火，反向突变型AHASL1引物与包含SEQ ID NO：14所示核苷酸序列的核苷酸序列退火。更优选地，正向AHASL1引物、反向野生型AHASL1引物、和反向突变型AHASL1引物分别包含具有SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、和SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的核苷酸分子。本发明的试剂盒可任选包含下列的一种或多种：聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸、和实施该方法的说明书。 

本发明进一步提供了实施鉴定向日葵植物中AHASL1等位基因的方法的试剂盒。该试剂盒包含如上所述的本发明的引物，特别是第一正向引物、第一反向引物、以及第二正向引物和第二反向引物。第一正向引物包含SEQ ID NO：15所示的核苷酸序列、第一反向引物包含SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列、第二正向引物包含SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列、第二反向引物包含SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列。试剂盒可任选包含下列一种或多种：聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸、和实施该方法的说明书。 

另外，本发明提供了用于包括本文所述PCR扩增的方法的引物。此类引物包含选自SEQ ID NOS：3、4、5、15、16、17和18所示核苷酸序列的核苷酸序列。

本文所用的冠词“一个”和“一种”是指一种或多于一种(即至少一种)的该冠词的语法对象。例如，“一种元素”意味着一种或更多种元素。 

如本文所用，词语“包含”或变型例如“包括”将被理解为将所述成分、整数或步骤、或成分、整数或步骤的组包括在内的意思，但是不排除任何其他成分、整数或步骤，或者成分、整数或步骤的组。 

以举例说明的方式但不以限制的方式提供下列实施例。 

实施例1：向日葵AHASL1中的咪唑啉酮抗性突变的表型相互作用 

GM40和GM1606是向日葵的突变衍生品系，其因AHASL1的密码子122(拟南芥命名法)上的点突变而显示出对咪唑啉酮的高水平耐受性 (WO2007005581和2005年7月1日提交的美国临时专利申请序号60/695952)。这证实A122T突变以及对于该突变纯合的衍生品系和杂种显示出比已知的商业上可获得的AHASL1上A205V突变纯合型的Clearfield向日葵对咪草啶酸更好的耐受性(WO2007005581)。两种突变体相对野生型均呈现不完全显性，敏感性等位基因，如文献中的许多其它例子一样。本发明是基于下述发现，在0.5X至6X商业剂量的除草剂应用范围内A122T突变对于针对咪唑啉酮的抗性相对A205V呈现出接近完全显性。本发明提供了杂合型A122T/A205T向日葵植物，其针对增加剂量的咪唑啉酮其显示出与纯合型A122T向日葵植物相同的耐受性水平和反应模式。因此，在Clearfield向日葵的仅一个亲本品系中通过用A122T对A205V的等位基因置换可获得对咪唑啉酮类较高水平的耐受性，这又允许该新的等位基因在向日葵作物中更快地部署。 

为确定已在IMI-R向日葵(HA425)中描述的抗性基因A122T和Imrl基因(A205V)的表型相互作用，在两种除草剂施用比率下(80和320g.a.i.Ha^-1的灭烟草)对来自杂交GM40(A122T)/HA425(A205V)的F1、F2和BC1F1种群进行了评估。当在较低的除草剂比率下评估后代时，在从该杂交获得的F2和BC1F1种群中未观察到敏感性植物，这表明GM40和HA425中的抗性基因是相同基因座的等位基因，且二者在1×比率的除草剂施用下对咪唑啉酮类具有相同水平的抗性。当在区分两亲本的更高除草剂比率下(320g.a.i.Ha-1)评估F2和BC1F1种群时，观察到了敏感性的分离。仅能检测到两种表型类别：植物无任何损伤或有轻微症状的抗性类别、以及如同对照品系HA425一样被杀死的敏感性表型。在所筛选的450株F2代植物中观察到的分离比率并未显著区别于3∶1的分离比率。为证实这些结果，将F1代植物与HA425回交并在320g.a.i.ha^-1的灭草烟下筛选所获得的BC1F1植物。所观察到的分离比率给出了1∶1 R∶S比率的良好拟合，这证明GM40中的抗性基因显示了对HA425中抗性基因的完全显性，并且这两者为同一基因座AHASL1的等位基因。 

为进一步确认这些结果，使用了分子标记方法。向日葵中AHASL1 基因呈现出单一序列重复(SSR)多态性，这将携带Imr1等位基因的品系从任何其它向日葵表型中区分出来(Kolkman等(2004)Theor.Appl.Genet.109：1147-1159)。利用引物p-AHAS18和p-AHAS19对含有这种SSR的AHASL1基因片段的PCR扩增在GM40和BTK47(原有的诱变品系)中获得了321bp的产物，在HA425中获得了312bp的片段。研究了GM40和HA425中检测到的长度变体多态性，以便探索来源于两品系杂交的F2和BC1F1群体中的分离。随机选择了来自F2种群的80株植物和来自BC1F1种群的50株植物，对其取样进行DNA分离，用320g.a.i.ha-1的灭草烟施用比率进行处理，并利用该标记物进行基因分型。在F2种群中，22株植物被除草剂杀死(S)，58株植物无症状或轻微损伤(R)。所观察到的该抗性分离比率与所期望的F2中的完全显性因子分离的抗性分离比率(3R∶1S)并无显著差异(P＜0.61)。对于AHASL1 SSR标记所观察到的分离(19A/A:39A/B:22B/B)与F2中共显性标记分离的所期望的分离比率相符合(1∶2∶1，P＜0.87)。对AHASL1 SSR基因分型的所有敏感性植物对于HA425单倍型(B/B)均是纯合的，尽管R植物对于GM40单倍型是杂合的(A/B)或纯合的(A/A)(表4，图1)。进一步对50株抗性分离的BC1F1后代评估了除草剂抗性表型和AHASL1单倍型的共分离。观察到的抗性分离比率符合1∶1的比率(P＜0.78)，如同对BC1中一个基因座的分离所期望的。AHASL1SSR单倍型与除草剂反应的表型完全共分离，23A/B:27B/B。敏感性后代对于HA425单倍型是纯合的(B/B)，而抗性后代对于HA425和GM40单倍型则是杂合的(A/B)。 

结果证实GM40中的抗性基因不同于HA425中的抗性基因，两者都是基因座AHASL1的等位基因变体，并且最后，存在于GM40的基因对Imr1等位基因是完全显性的。 

实施例2：纯合型A122T/A122T和A205V/A205V以及杂合型A122T/A205V事件在整个植物水平上对于灭草烟的反应 

进行该实验以在不同的遗传背景下和整个植物水平上定量和对比以纯合(A122T/A122T或A205V/A205V)和杂合(A122T/A205V)状态携带A122T和A205V突变的向日葵杂种的灭草烟敏感性。 

材料 

在田间条件下获得不同向日葵品系(表1)的种子。 

表1.所利用向日葵材料、其家系、和突变事件的类型。 

  代码   家系   品系(L)或杂种(H)   突变事件   L1    L   A205V   L2    L   A205V   H1   L1x L2   H   A205V   L3   cmsGM40   L   A122T   L4    L   A122T   H2   L3x  L4   H   A122T   L5   BTK 47   L   敏感的   H3   L3x L2   H   A205V+A122T   H4   L1x L4   H   A205V+A122T

品系L1和L2分别是雄性不育和恢复系育种品系，其以纯合状态携带A205V等位基因。用作开发GM40品系的初始材料的L5、BTK47是保持系。GM40是以纯合状态携带A122T突变的原始品系(ATCC专利保藏号PTA-6716，参见WO2007005581)。L4是来源于杂交R701＊3/GM40的BC2F4恢复系，所述杂交是利用标记辅助回交以便选择与各回交世代的回交亲本最相似的植物。R701是具有良好的组合能力的敏感性恢复系。在回交两代后，将与R701最相似的植物自交并筛选对灭草烟有抗性的后代。利用下文所述的A122T突变的分子标记诊断在抗性后代中筛选纯合型A122T植物。CMS GM40是GM40的雄性不育形式，其由来自杂交cmsBTK47/＊2GM40的BC1F1代发育而来，所述杂交利用相同的诊断标记以区分A122T等位基因的纯合型和杂合型植物。

方法

A122T突变的诊断标记 

描述了用于在AHASL1中携带A122T突变的向日葵植物进行高通量基因分型的等位基因特异性PCR测定。该测定使人们能够(1)检测携带该突变的个体；(2)确定这些个体的接合性；以及(3)区分携带该突变的抗性植物和含有A205V突变的植物。 

PCR引物来自Kolkman等((2004)Theor.Appl.Genet.109：1147-1159)所提供的那些，用于扩增包括A122T突变和插入-缺失多态性(″INDEL″)的向日葵AHASL1序列的片段，该片段可用于区分A122T突变的序列和已知突变A205V的序列。 

这些引物的名称和序列为： 

p-AHAS185′-ttcctcccccgtttcgcattac-3′(SEQ ID NO：1) 

p-AHAS195′-cgccgccctgttcgtgac-3(SEQ ID NO：2) 

反应混合物如下：1U Taq DNA聚合酶、70ng基因组向日葵DNA、25μg BSA、和终浓度100μM的每种dNTP、0.25μM的每种引物、90mMTris-HCl pH8、20mM(NH₄)₂SO₄和2.5mM MgCl₂。PCR程序组成如下：94℃2分钟的初始变性步骤、随后是40个循环的94℃30秒、56℃30秒和72℃30秒，然后是72℃10分钟的最后延伸步骤。 

利用上述引物获得的BTK47(或GM40)预期片段大小是321bp，携带A205V突变的向日葵单倍型的基于GenBank检索号AY541455的预期片段大小是312bp。图4显示，所述PCR反应使得A122T和A205V突变体均基于它们序列之间存在的INDEL多态性而得以区分。 

将扩增产物进行限制性酶切并在琼脂糖凝胶中分离所获片段。限制性反应由10μl扩增产物、BSA1×(100μg/ml)、NE缓冲液31X(100mM NaCl、50mM Tris HCl、10mM MgCl2、1mM二硫苏糖醇pH 7，9)和2.5U BmgBI组成。37℃下孵育该混合物3小时。野生型和A122T植物在限制性反应后的预期片段大小如下： 

野生型将显示183+138bp的片段。GM40(A122T)显示183+76+62bp的片段。杂合型个体将显示183+138+76+62bp的片段。图5显示，利 用该方法获得了预期大小的片段并且能够从野生型植物中检测出A122T携带者，另外还可能区分A122T突变的纯合型和杂合型个体。 

除草剂处理 

将种子种植在培养皿中，并在发芽后将小植株移植至直径10cm的盆中由相等份额的蛭石、土壤和沙组成的盆栽培养基中。将植物种植在温室中自然光条件下，添加400W卤化钠灯以提供16小时日长。昼/夜温度分别为25和20℃。在V2-V4阶段(Schneiter&Miller(1981)Crop Sci.21：901-903)，将每种基因型的10株植物随机分配至由八种灭草烟剂量(0、40、80、160、240、320、400和480g ai/ha，分别对应于未处理的、0.5x、1x、2x、3x、4x、5x和6x)组成的每项处理、以及零时间生物量测定中。按照随机区组设计来安排实验，进行处理和10个重复的完全因子(向日葵品系×处理)排列。 

除草剂施用之日，在子叶节处切割每种基因型的10株植物，并在60℃干燥48小时以进行零时间干重测定。在用灭草烟处理后将剩余的植物保持14天，并记录其高度、植物毒性指数(PI)和地上部分干生物量。将每株植物的子叶节和顶端之间的距离确定为其高度。通过从每个样品中减去合适的平均零时间生物量将每个品系的地上部分生物量数据转化成了施用后的生物量积累。将干生物量转化成了每个品系内未处理对照的百分比，从而允许各组间直接进行比较。PI是0至9的表型等级，其用于通过目视检查来评价每株植物的植物毒性。将不具有任何症状的植物记录为“0”，将相对于未处理的对照植物增加水平的生长迟缓和萎黄病记录为“1”至“4”，将增加水平的叶子异常和叶子坏死记录为“5”至“8”，并将具有顶端完全坏死的死亡植物纪录为“9”。 

高度 

在较低比率的灭草烟施用下(0.5×)敏感性品系的高度降低85％。在该品系内从1×至6×高度降低为未处理对照植物的大约85％。当以0.5×或1×的比率施用灭草烟时，向日葵品系和携带纯合状态A205V突变的杂种的高 度与未处理对照并无不同。从2×至6×，这些品系显示出高度上的显著降低，其达到未处理对照的69.6％+/-3.9(表2和图1)。相比，携带纯合状态A122T突变的向日葵品系显示出减少的高度降低(对于0.5x和6×比率的灭草烟分别为未处理对照的0.1％至18.8％)。两组品系对于除草剂比率从2×增加至6×的反应显示出彼此之间的显著差异(表2和图1)。 

对于0.5×至6×比率的除草剂施用，具有AHASL1(杂合型A122T/A205V)处两种突变型等位基因的材料显示出未处理对照的0.6％至38.2％+/-2.7的高度降低。杂合材料的高度降低与纯合型A122T/A122T所观察到的降低并无不同，但低于纯合型A205V/A205V所记录的高度降低(图1)。事实上，杂合材料的平均高度降低在施用任何剂量的除草剂时均未与纯合型A122T/A122T植物中所观察到的有所不同，但在施用2×至6×比率的除草剂时与纯合型A205V/A205V植物所观察到的具有统计学差异(表2)。 

植物毒性指数 

纯合状态的两种突变体在对除草剂比率从0.5×增加至6×的反应方面显示出显著差异(图2)。携带纯合状态的A122T突变的向日葵品系随除草剂比率增加显示出比对照植物叶子大小的稍微减小和更浅的绿色(表3)。相反，携带A205V突变的植物在0.5×或1×的除草剂比率下并未显示出任何损伤，但从2×至6×其损伤水平(萎黄病、叶变形和叶坏死)快速增加(表3)。从2×至6×，纯合状态的两种突变体在植物毒性指数上彼此之间显著不同(表3)。杂合型A122T/A205V材料显示出与纯合型A122T/A122T材料相同模式的反应。事实上，在任何除草剂施用比率下它们仅显示出比对照植物更浅的绿色，在5×和6×比率下显示出比对照植物更小的叶子大小，其在较高的剂量下测定PI仅为1(图2)。 

地上部分干重生物量 

突变体A122T和A205V的干重的剂量反应曲线显示于图3中。在4×、5×和6×比率下，纯合状态的事件A122T的生物量重量相对于对照植物有所降低，而这种降低在更高剂量时达到25％。同时，从0.5×(40g ai/ha)至 6×，事件A205V的干重相对于对照植物有所降低。从0.5×至6×，相对于此变量两种突变体显示出显著的不同(表4)。杂合型A122T/A205V材料显示出与纯合型A122T材料完全相同的趋势(图3，表4)。对于0.5×至6×的除草剂施用比率，它们显示出生物量降低0.3％至33％，这与任何比率下纯合型A122T个体所记载的并无差异。然而，从3×至6×的除草剂施用比率下，杂合材料相对纯合型A205V个体在干物质积累方面显示出显著差异(表4)。 

结论 

对于增加的灭草烟施用比率，携带AHASL1基因座上的两种突变体等位基因的杂合型材料显示出与纯合型A122T材料相同水平的耐受性和植物高度的反应模式、植物毒性指数以及干物质积累，该耐受性水平比纯合型A205V材料所表达出的水平更好。 

表2.对于携带A205V突变事件的三种向日葵基因型、携带A122T突变事件的三种基因型、携带A205V/A122T突变事件的两种基因型和一种敏感性品系，处理后14天不同剂量的灭草烟对植物高度的影响。 

＊，＊＊平均值与未处理对照分别在0.05和0.01的显著性水平上具有统计 学差异。 

表3.对于携带A205V突变事件的三种向日葵基因型、携带A122T突变事件的三种基因型、携带A205V/A122T突变事件的两种基因型和一种敏感性品系，处理后14天不同剂量的灭草烟对植物毒性指数的影响。 

＊，＊＊平均值与未处理对照分别在0.05和0.01的显著性水平上具有统计学差异。 

表4.不同剂量的灭草烟对处理14天后对于携带A205V突变事件的三种向日葵基因型、携带A122T突变事件的三种基因型、携带A205V/A122T突变事件的两种基因型和一种敏感性品系的生物量积累的影响。 

＊，＊＊平均值与未处理对照分别在0.05和0.01的显著性水平上具有统计学差异。 

实施例3：在田间条件下A122T和A205V纯合和杂合的品系与两突变的杂合品系(A122T/A205V)的除草剂耐受性 

在田间条件下实施该实验以比较以纯合(A122T/A122T或A205V/A205V)、杂合(A122T/-或A205V/-)和双叠加杂合(A122T/A205V)状态携带A122T和A205V突变的不同基因型的向日葵杂种和品系的除草剂耐受性。 

材料

所使用的向日葵材料列于表5中。 

表5：项目列表 

方法

2005-2006年生长期中在南美洲的最佳种子生产条件下生产了表5中每个项目的种子。田间试验于2006年在美国北达科他州的一处场所进行。利用每个处理组合由3个重复组成的裂区设计，以随机完全区组来安排这些项目。因子A(表6)为除草剂处理，因子B为向日葵项目。试验区大小为4行×12英尺，播种率与当地农业习惯相一致。 

表6：因子A-除草剂处理列表 

  处理编号   处理   1   未处理   2   50g ai/ha咪草啶酸+0.25％(v/v)NIS   3   100g ai/ha咪草啶酸+0.25％(v/v)NIS   4   200g ai/ha咪草啶酸+0.25％(v/v)NIS   5   160g ai/ha灭草烟+0.25％(v/v)NIS

NIS＝非离子表面活性剂 

喷雾体积：对于背包式喷雾器每英亩10加仑(GPA)(或100升/公顷)，或对于拖拉机悬挂式喷雾器为20GPA(或200升/公顷)。 

除草剂施用时的生长阶段：2-4叶 

在所有处理区组中使项目15(野生型保持系)保持不喷雾。 

在施用除草剂后第7天和第21天评价植物毒性等级。将植物毒性记录为植物损害的量(以百分比的形式)，其中“0”等级表示相对于未处理试验区该试验区中的植物无损害。“100”等级表示相对于未处理试验区该试验区中的植物完全坏死(死亡)。 

将数据进行ANOVA分析并将3个重复的平均值在表7(处理后7天的植物毒性)和表8(处理后21天的植物毒性)中给出。 

结果

在160g ai/ha的灭草烟下，在处理后第7天和第21天(DAT)A205V/A122T双杂合项目与纯合的A205V和A122T项目之间在植物毒性中无显著差异。对于7和21DAT等级，杂合型A205V项目的植物毒性均显著高于双杂合型A205V/A122T和纯合型项目(杂合型A205V的21DAT在20-43％范围内)。从进行7DAT评估的时间至进行21DAT的时间，杂合型项目的植物毒性也有所增加。对于A205V/A122T双杂合型以及A122T/A122T和A205V/A205V纯合型项目，从7DAT至21DAT，植物毒性无显著增加。 

对所有项目(除了项目15之外)测试三种水平的咪草啶酸，50g ai、100g ai、和200g ai/ha。在200g ai/ha的咪草啶酸下，杂合型A205V/A122T品系(在21DAT时，2-3％的植物毒性)显示出比纯合型A205V/A205V品系(在21DAT时15-22％的植物毒性)更低的植物毒性，以及与纯合型A122T/A122T品系相当(在21DAT时3-5％的植物毒性)的植物毒性。 

讨论

如通过最高咪草啶酸处理水平(200g ai/ha)所证实的，双杂合型A205V/A122T项目显示出与纯合型A122T/A122T项目等同的除草剂耐受性，以及比纯合型A205V/A205V项目更高的除草剂耐受性。 

灭草烟的单一处理水平160g ai/ha不足够高以显示双杂合型A205V/A122T项目与纯合型项目之间在植物毒性上的显著差异，但其足以说明通过叠加的两杂合型A205V/A122T突变一起所获得的耐受性要高于每种杂合型突变单独获得的耐受性。 

基于咪草啶酸处理数据，当A122T突变与A205V突变以杂合状态叠加时，其提供了比以纯合状态存在的A205V突变更强的除草剂耐受性。 

上述实验揭示了向日葵中AHASL1的两等位基因突变体之间的相互作用。向日葵中密码子122的突变比以往所报道的任何AHAS突变具有显著更高的除草剂耐受性，然而密码子205中的突变提供了中间抗性水平。由于等位基因122相对等位基因205显示为显性，携带两突变型的杂合基因型具有与纯合型122相同的耐受性水平。 

由于增强的除草剂耐受性，本发明提供了为向日葵生产开发新的且高效的除草剂产品的方法。由于本发明通过在目前的Clearfield向日葵杂种(其为A205V/A205V)中进行单基因置换提供了具有商业水平的除草剂耐受性的向日葵植物，本发明发现了在增强除草剂耐受性向日葵杂种生产的育种效率方面的用途，还提供了商业化向日葵杂种中A122T突变的更快速部署。 

表7.处理后第7天(DAT)所记录的植物毒性等级(％作物损害)。 

LSD＝9.64    CV＝54.70 

标准差＝6.03    总平均＝11.02 

表8.处理后21天(DAT)所记录的植物毒性等级(％作物损害) 

LSD＝8.89    CV＝56.78 

标准差＝5.55    总平均＝9.78 

实施例4：针对在植物发育的生长阶段晚期或生殖阶段早期叶部施用的用于控制列当的灭草烟，纯合型A122T/A122T或A205V/A205V和杂合型A122T/A205V事件的除草剂耐受性 

Orobanche cumana和弯管列当(列当)是在世界上许多生产区域感染向日葵的两种寄生植物。这两种植物从V6至开花期(R5)连续感染向日葵植物。已建议使用咪唑啉酮除草剂例如咪草烟通过在发育的V10至R1期对含有A205的向日葵植物施用除草剂来控制列当(WO1999065312)。利用该方法，成功控制了列当且植物毒性可忽略不计。 

这里我们证实当在发育的生殖阶段早期(R1)以2×施用比率施用咪唑啉酮除草剂例如灭草烟时，A122T/A122T或A122T/A205V杂种的耐受性比A205V纯合型植物的耐受性更好。在本报告中，我们证实了 A122T/A122T和A122T/A205V对于控制向日葵中的列当的有用性。 

材料

品系H1、H2和H3在表9中进行了描述。杂种H5是来源于L3×R701杂交的F1代，杂种H6是来源于L1×R701杂交的F1代。 

方法

2005年在Laguna Blanca(Formosa，阿根廷)的最佳种子生产条件下生产了各项目的种子。2006年在Venado Tuerto(圣达菲，阿根廷)的一处场所开展了田间试验。以每个处理组合由3个重复组成的随机完全区组设计来安排这些项目。因子A是向日葵发育的个体发育阶段(V8和R1)，因子B为向日葵项目。试验区大小为5行×6英尺，在每行内每25cm分布植物。在V8和R1阶段，利用背包式喷雾器以100升/公顷的喷雾体积来施用160g ai/ha灭草烟+0.25％(v/v)NIS。 

在施用除草剂后的第14天和第21天评价植物毒性等级。将植物毒性记录为植物损伤的量，其中“0”等级表示相对于未处理的对照试验区，试验区中的植物无损伤。1至15等级表示试验区中萎黄病程度的增加，其中“15”表示试验区中全身的淡黄色。“20”至“49”等级表示生长迟缓、变形和坏死程度增加。“50”等级表示植物死亡(完全坏死)。 

将数据进行ANOVA分析。利用LSD检验在0.01的概率水平上对各项目平均值进行比较。 

结果

在处理后第14天和21天(DAT)时平均植物毒性指数(PI)得分显示于表9和10中。 

当在植物发育的V8阶段喷雾时，几乎所有杂种显示出轻微的萎黄病症状。唯一的例外是杂合型122/WT杂种，其在14DAT显示出完全黄化(表9)。在21DAT该黄化消失(表10)。另外，在21DAT，各品系间在PI方面无差异(表10)。 

另一方面，当在植物发育的R1阶段对杂种进行喷雾并在14DAT进 行评估时，识别出两组边界明确的材料。一组仅显示出萎黄病症状(PI小于11.7)，而第二组显示出萎黄病症状以及生长迟缓和变形(PI大于35)。第一组由携带至少一个等位基因A122T的品系组成(即，杂种A122T/A122T，A122T/A205V，和A122T/WT)，第二组由以纯合型和杂合型状态(A205V/A205V，A205V/WT)携带A205V突变事件的杂种组成。两组之间的PI差异是非常显著的(p＜0.01，表9)。然而在21DAT，A122T/WT杂种提高了其PI评分(从11.7至23.3)，同时，A122T/A122T和A122T/A205V杂种其PI评分从2.3-4.3降低至1.7-0.7。最后这两种杂种和A122T/WT杂种之间的差异在21DAT是非常显著的(表10)。含有A205V/A205V和A205V/WT的品系也显示出非常高的PI分值，许多植物显示出顶端烧伤和生长点损伤的症状(表10)。 

结论

结果表明，杂种A205V/A205V或A205V/WT不能在V8时用灭草烟喷雾，因为它们在施用后显示出增强的植物毒性和严重的损伤。杂种A122T/A122T和A122T/A205V在施用灭草烟后仅显示出轻微的萎黄病症状。这证明，当在R1阶段施用时A122T/A122T和A122T/A205V向日葵植物表现出比A205V/A205V或A205V/WT材料对咪唑啉酮除草剂更高水平的耐受性。总之，含有A122T/A122T和A122T/A205V叠加的品系可用于通过在植物发育的R1阶段(生长晚期或生殖早期)施用除草剂来用灭草烟控制列当。 

表9.在植物发育的两个不同阶段(V8和R1)用灭草烟(160gr ai/ha)对突变事件A122T和A205V以及杂合基因型A122/A205、A122/WT和A205/WT进行处理后的第14天(DAT)所评定的平均植物毒性指数。不同字母表明p＜0.01时的显著差异。 

LSD-值(p＜0，01)＝10.04 

剩余均方＝20.0 

基因型均方＝476.22(p＜2.2e^-16) 

表10.在植物发育的两个不同阶段(V8和R1)用灭草烟(160g ai/ha)对突变事件A122T和A205V以及杂合基因型A122/A205、A122/WT和A205/WT进行处理后的第21天(DAT)所评定的平均植物毒性指数。不同字母表明p＜0.01时的显著差异。 

LSD-值(p＜0.01)＝16.39 

剩余均方＝53.3 

基因型均方＝806，33(p＜2.2e^-16) 

实施例5：纯合型A122T/A122T或P197L/P197L以及杂合型A122T/P197L事件在整个植物水平上对磺脲类除草剂的反应 

在来自堪萨斯州的野生向日葵种群种中发现了向日葵对磺脲类的抗性(USA，(Al-Khatib等(1998)Weed Sci.46：403-407)。为了开发和使用除草剂抗性栽培品种和杂种，已将抗性基因(Ar-kan)从野生种群渐渗到良种近交系中(Al-Khatib和Miller(2000)Crop Sci.40：869；Miller和Al-Khatib(2002)42：988-989；Miller和Al-Khatib(2004)Crop Sci.44：1037-1038)。已证实来自磺脲类抗性基因型的AHASL1在密码子197上具有C至T突变，其导致该位点上Pro变为Leu(Kolkman等(2004)Theor.Appl.Genet.109：1147-1159)。 

甲黄隆(2E[C[(4-甲氧基-6-甲基-l，3，5-三嗪-2-基)氨基羰基]氨基]磺酰基.]苯甲酸甲酯])是一种磺脲类除草剂，其已被注册用于小麦和大麦以及非耕地场所例如道路用地(EPA Pesticide Fact Sheet Metsulfuron methyl(1986)Collection of pesticide chemistry，US Government Printing Office461-221/24041)。 

本研究的目标是在温室条件下定量和比较以纯合(A122T/A122T或P197L/P197L)和杂合(A122T/P197L)状态携带A122T和P197L突变的向日葵杂种在整个植物水平上对甲黄隆的敏感性。 

材料

使用了下列材料：B770、GM1606、GM40、L4、cmsGM40×L4、cmsGM40×BTSu-R1、和BTSu-R1。B770是用作诱变品系GM1606的亲本来源的敏感性向日葵品系。GM1606是A122T突变纯合型的，GM1606 和B770是仅在AHASL1基因座上不同的等价品系。GM40、L4和cmsGM40x L4如上所述。BTSu-R1是我们实验室开发的恢复系，通过谱系选择从复合种群SURES-2获得，其已由Miller和Al-Khatib(2004)CropSci.44：1037-1038发表。 

方法

将种子种植在培养皿中，并在发芽后将小植株移植至含有盆栽培养基的10cm盆中，所述培养基由相等份额的蛭石、土壤和沙组成。将植物种植在温室中自然光条件下，添加400W卤化钠灯以提供16小时日长。日/夜温度分别为25和20℃。在V2-V4阶段(Schneiter&Miller(1981)Crop Sci.21：901-903)，将每种基因型的20株植物随机分配至由三种甲黄隆剂量组成(0或无处理、5g ai/ha或1×比率、和10g ai/ha或2×比率)的每项处理中。另外进行了零时间生物量测定。按照随机完全区组设计(RCBD)来安排实验，进行处理和20个重复的完全因子(向日葵品系×处理)排列。 

为进行零时间干重测定，在施用除草剂之日，在子叶节处切割每种基因型的10株植物，并在60℃干燥48小时。在用除草剂处理后将剩余的植物保持14天(DAT)，并记录其高度、植物毒性指数(PI)和地上部分干生物量。将每株植物的子叶节和顶端之间的距离确定为其高度。通过从每个样品中减去合适的平均零时间生物量将每个品系的地上部分生物量数据转化成了施用后的生物量积累。将每个品系的高度和干生物量转化成了未处理对照的百分比，从而允许各组间直接进行对比。PI是0至9的表型等级，其通过目视检查评价每株植物的植物毒性。将不具有任何症状的植物记录为“0”，将相对于未处理的对照植物增加水平的生长迟缓和萎黄病记录为“1”至“4”，将增加水平的叶子异常和叶子坏死记录为“5”至“8”，并将具有顶端完全坏死的死亡植物纪录为“9”。 

将数据进行ANOVA并通过LSD检验比较平均值。 

结果

野生型和A122T/A122T纯合型植物的高度、干物质积累和PI反映了常规向日葵和突变事件A122T在两个施用比率下对磺脲类的高敏感性(表 11)。相比，突变事件P197L呈现了更高水平的耐受性，在两种除草剂比率下均具有接近80％的未处理对照的高度。同样，该事件的干物质积累在1×和2×甲黄隆比率下分别为88％和77％。最后，P197L/P197L纯合品系的PI在两种除草剂比率下为0和0.1，这反映了这些植物实际上不具有植物毒性症状(表11)。 

叠加的杂种A122T/P197L显示出与纯合型P197L品系相同的耐受性模式，并且对于所分析的所有变量均呈现出比所有纯合型A122T材料更好的性能(表11)。为举例说明这一点，当用1×甲黄隆处理时，A122T/P197L品系显示出与纯合型P197L抗性品系相同的PI和高度降低。在2×甲黄隆比率下，A122T/P197L表现出与P197L纯合品系相同的干物质积累。杂合型P197L/A122T杂种与抗性品系P197L在下列参数上有显著不同：1×下的DMA(分别为74.4对88.1)、PH(62对80.9％)、以及在2×下的PI(1对0.1)。然而，当与A122T/P197L杂合型材料与所有纯合型A122T和野生型品系之间所观察到的差异相比较时，这些差异的大小是非常小的。 

结论

基于这些结果，证实了双杂合型A122T/P197L具有比纯合型A122T/A122T和野生型材料更好的甲黄隆抗性，以及与P197L/P197L纯合品系几乎相同水平的耐受性。 

表11.纯合型A122T/A122T、P197L/P197L、杂合型P197L/A122T和野生型材料在叶部施用两种比率的甲黄隆之后的平均高度降低(PH)、干物质积累(DMA)和植物毒性指数(PI)。 

不同字母表示在p＜0.01概率水平上的显著差异。 

实施例6：向日葵AHASL1基因座的除草剂抗性等位基因的诊断性PCR标记 

提供单核苷酸多态性(SNP)测定用于本文上述的以及美国临时专利申请号60/695，952(2005年7月1日提交)中所述的携带AHASL1向日葵突变的向日葵植物的高通量基因分型。该测定允许(1)检测携带A122T突变的个体，(2)确定这些个体中A122T突变的接合性，和(3)在杂合型情况下，检测植物中存在的A122T突变以及其它叠加的AHAS抗性等位基因(A205V或P197L)。 

1)PCR引物和扩增条件 

基于本文和上述专利申请中所公开的DNA序列设计PCR引物。这些引物的名称和序列如下： 

正向保守引物： 

p-AHAS NIDF  5′-TGT TCT CTC CGA CTC TAA A-3′(SEQ ID NO：3)

反向“野生型”引物 

AHAS 122TWT  5′-TGG TGG ATC TCC ATT GAG TC-3′(SEQ ID NO：4)

反向“突变型”引物 

AHAS 122TMU  5′-TGG TGG ATC TCC ATT GAG TT-3′(SEQ ID NO：5) 

反应混合物如下：1U Taq DNA聚合酶(Biotools，10.047)、70ng基因组向日葵DNA、25微克BSA、以及具有终浓度为100μM的每种dNTP、0.25μM的每种引物p-AHAS NIDF/AHAS122TWT或p-AHAS NIDF/AHAS122TMU、90mM Tris-HCl pH8、20mM(NH4)₂SO₄和2.5mM MgCl₂。 

PCR程序由下列组成：94℃2min的初始变性步骤、随后是45个循环的94℃30秒、55℃30秒和72℃30秒，然后是72℃10分钟的最后延伸步骤。 

2)检测携带A122T突变的植物及其接合性 

为检测携带所述突变的个体，使用了p-AHAS NIDF/AHAS 122TMU引物组合。具有至少一个拷贝(即，纯合型和杂合型个体)的A122T等位基因的个体产生195bp的片段。野生型个体或具有AHASL1任何其它单倍型的个体利用该引物组合不产生任何片段(参见图6和表12)。总之，该引物组合可用于诊断A122T突变。 

使用引物组合p-AHAS NIDF/AHAS 122TWT来(a)确认前面结果的特异性，因为A122T等位基因用该引物组合不应当产生扩增产物，以及(b)确定每种植物中存在的另一等位基因(如果不同于A122T)(参见图7和表12)。 

当使用引物组合p-AHAS NIDF/AHAS 122TWT时，野生型个体、A205V和P197L突变体产生了特异性片段(表12)，而A122T纯合子未产生扩增产物。 

将1)中的扩增产物在4％的琼脂糖凝胶中分离(Methaphor Agarose)。 

表12中提供了多种向日葵单倍型(Hap)在AHASL1基因处的PCR产物的预期大小。图8中提供了Hap1-Hap6序列的比对，并包括上述p-AHASNIDF、AHAS122TWT和AHAS 122TMU引物的退火位点、以及A122T突变位点和(ACC)_n区域，该区域产生了不同单倍型之间PCR产物的大小差异。 

表12.利用引物对p-AHAS NIDF/AHAS122TWT和p-AHAS NIDF/AHAS 122TMU获得的扩增产物的预期大小。 

1单倍型(Hap)1至5对应于Kolkman等(2004)Theor.Appl.Genet.109：1147-1159)中所提供的那些。 

2AHASL1突变的类型(如果有的话)在括号中注明。 

实施例7：用于检测向日葵AHASL1A122T等位基因的等位基因特异性聚合酶链反应 

为促进CLEARFIELD向日葵的育种，开发了下列用于检测向日葵AHASL1A122T等位基因的SNP测定。用于测定开发和验证的IMI耐受性品种包括多种常规的和除草剂耐受性品种。该测定使用等位基因特异性聚合酶链反应(PCR)以检测和确定向日葵AHASL1A122T等位基因的接合性。利用四种引物的单轮扩增提供了检测接合性的三种可能状态：野生型、杂合型和突变性(A122T/A122T)所需的产物。由于AHASL1和AHASL2基因座在含有突变的区域中是相同的，设计了一组引物从而特异性扩增AHASL1基因座(参见下列HA122CF和HA122CR)。另外，设计了等位基因特异性引物以便特异性地从单核苷酸“G”退火/延伸成“A”，这导致了从丙氨酸至苏氨酸的相应密码子改变。野生型等位基因特异性引物是反向引物。因此，如下所述末端碱基是“C”。无论突变位点为何种碱基均产生由HA122CF和HA122CR所形成的794个碱基对的对照条带，并用作阳性对 照(图9)。 

由引物HA122CF和HA122wt扩增形成的野生型状态的诊断条带，获得了258个碱基对的片段(图9)。该引物在实际突变的上游4个碱基含有预设的错配，其用于产生对野生型样品的增强的特异性。突变状态下的诊断条带产生576个碱基对的片段(图9)。该576个碱基对产物由HA122mut和HA122CR的扩增形成，并表明了突变型等位基因的存在。突变体特异性引物在其实际突变的上游3个碱基含有预设的错配，其用于产生对突变型样品增强的特异性。因此，当通过琼脂糖凝胶电泳观察时，突变杂合的样品将产生三条带：对照条带以及两条诊断条带。纯合型样品将显示两条带。凝胶图式取决于密码子122中的碱基call。PCR引物在下面提供： 

通用正向引物(HA122CF)： 

5′GTTTCGCATTACCCATCACT3′(SEQ ID NO：15) 

野生型特异引物(HA122wt)： 

5′GGTGGATCTCCATTAACGC3′(SEQ ID NO：16) 

突变体特异引物(HA122mut)： 

5′GCCTACCCCGGCTGCA3′(SEQ ID NO：17) 

通用反向引物(HA122CR)： 

5′CAAAACCGGCCTCTTCGC3′(SEQ ID NO：18) 

实施例8：表达A122T性状的高油酸咪唑啉酮抗性向日葵品系 

生产了下述向日葵植物，该植物表达AHASL1A122T突变体等位基因也称作CLHA-plus性状)，其赋予向日葵植物针对咪唑啉酮除草剂的高水平抗性、并产生包含可提取的种子油的种子，所述种子油包含至少85％的油酸。这些向日葵植物是通过常规育种方法，通过将来自GM40的IMI抗性品系与高油酸(HO)品系(VB141)杂交并利用分子标记在近交的F2代和更后几代中筛选两种性状而获得的。包含至少一个拷贝的AHASL1A122T突变型等位基因的GM40和另一向日葵品系在上文和WO2007005581中有所描述。GM40和GM1606的种子已在ATCC保藏并 分别指定了ATCC专利保藏号PTA-6716和PTA-7606。 

材料

品系BTI-OL-M1511、BTI-OL-M1709和BTI-OL-2201是三种因其高油酸含量和对咪唑啉酮的耐受性而被选出的实验向日葵品系。VB141、HA445和OB712是高油酸品系，B770和BTK112是两个常规品系，GM40是A122T常规品系。 

方法 

种子的脂肪酸组成：按照具有3个重复的完全随机区组设计，将所有植物种植在Laguna Blanca(Formosa，阿根廷)的田间条件下。将来自每个重复的10g种子用于分析。根据标准方法通过气相色谱法测定每个样品的脂肪酸组成。每个材料的3个重复的平均值在表16中提供。 

对咪唑啉酮的耐受性：在温室条件下将9个品系的种子种植在盆中。在V4阶段用灭草烟以160gr/ha的剂量对每个品系的至少20株小植株进行喷雾(Schneiter&Miller，1981)。处理后的第14天，利用植物毒性指数(PI)对每株植物进行表型评分。PI是通过目视检查为每棵植物评价的从0至9的表型等级。将不具有任何症状的植物记录为“0”，将相对于未处理的对照植物增加水平的生长迟缓和黄化记录为“1”至“4”，将增加水平的叶子异常和叶子坏死记录为“5”至“8”，并将顶端完全坏死的死亡植物记录为“9”。 

结果 

高油酸品系显示出种子中85.79-89.97％的油酸含量范围，另一方面，常规材料显示出少得多的含量(范围：18.62-24.2％)。品系BTI-OL-M1511、BTI-OL-M1709和BTI-OL-2201显示出种子中89.58-90.83的油酸浓度，类似于HO品系所获得的浓度(表16)。 

品系HA445、VB141，OB712、B770和BTK112被除草剂处理所杀死，而品系BTI-OL-M1511、BTI-OL-M1709和BTI-OL-2201显示出类似于抗性品系GM40中所观察到的抗性水平(表17)。 

总之，品系BTI-OL-M1511、BTI-OL-M1709和BTI-OL-2201在其种子中组合了对咪唑啉酮的高水平抗性和高水平的油酸。 

表16.9种向日葵品系的种子的脂肪酸组成(每个值均为3个重复的平均值)。 

表17.9种向日葵品系的平均植物毒性指数(每个值均为20个重复的平均值)。 

实施例9：A122T/A122T、A205V/A205V和A122T/A205V事件的田间评估和AHAS活性评估 

为测定AHASL1基因为A122T/A122T、A122T/A205V或A205V/A205V的向日葵植物的相对咪唑啉酮耐受性水平，在几个场地进行了田间评估。用不同剂量的咪草啶酸和灭草烟在一系列环境条件下处理每 种不同基因型的向日葵植物。另外，在增强水平的除草剂存在下测定来自三种向日葵基因型的每种的向日葵植物的体外AHAS活性。 

材料和方法

对特别选择出的缺失E-因子(imr1 imr1/imr2 imr2)的向日葵品系BTK47进行EMS种子诱变。选择了在灭草烟田间选择中存活下来的M2:4品系进行后续的杂交和酶活性研究。将该品系命名为GM40。 

A122T性状的田间评估 

将A122T突变型等位基因渐渗入不同的保持系、恢复系和不育的近交系。将纯合型A122T近交系与野生型(WT)近交系(不含除草剂耐受性突变)、纯合型A122T近交系、或纯合型A205V近交系杂交，从而产生不同的F1代突变型等位基因接合性组合(表18)。2005至2008年在北美洲、南美洲和欧洲的多个地方对这些项目以及几种地方适应性 A205V商业品种对照进行咪唑啉酮耐受性的田间测试(表19)。 

表18.除草剂耐受性田间评估的项目列表(2007) 

表19.除草剂耐受性田间评估的地点列表(2005-2007) 

以随机双因子裂区设计来安排在2007和2007/2008年每个场所中的项目，所述设计对于每个处理组合均由3个重复组成。因子A为除草剂处理(表20)，因子B为向日葵项目(表18)。试验区大小是2行×7m且播种率与当地农业惯例相一致。用拖拉机悬挂式喷雾器在2-4叶期实施除草剂处理(20加仑/英亩或200升/公顷)。处理2仅在法国的两个场所实施。 

表20.除草剂耐受性田间评估的咪唑啉酮处理列表(2007) 

＊NIS＝非离子型表面活性剂＝诱导90SC(90％) 

在处理后6-10天和处理后16-21天评估作物损伤(％植物毒性)等级。将百分比植物毒性记录为给定试验区中的植物损伤的平均量，其中“0％”的等级表示植物相对于未处理试验区无损伤。10％至40％的等级表示增加水平的萎黄病(其中40将是叶子全部黄化)。50％或更高等级表示植物表现 出完全黄化以及增加水平的叶子坏死。“100％”的等级表示植物的完全坏死(死亡)。 

对于每个场所的每个试验区还要评估其出苗、开花日期、开花结束的日期、和成熟日期(数据未显示)。将这些数据进行ANOVA分析。 

AHAS活性的酶测定 

通过Singh等(1988)Anal.Biochem.171：173-179的方法，将表21中所述的来自每个品系的12株温室种植的向日葵植物合并并进行AHAS酶活性测定。每种活性测定重复两次。由于样品量大，将实验分为两组进行(表21)。 

表21.品系描述和相应的AHASL1突变等位基因接合性 

将来自四周龄小植株的未成熟的、活跃生长的叶子在研杵中用液氮磨碎，并用由100mM丙酮酸盐、200mM KH₂PO₄、20mM MgCl₂、2mM焦磷酸硫胺素和20μM黄素腺嘌呤二核苷酸组成的缓冲液提取。然后按照厂家的建议将植物提取物旋转通过10mL的Zeba TM脱盐旋转柱(Pierce#89893)。如Singh等(1988)Anal.Biochem.171：173-179所述进行抑制测定。以96孔板形式进行该测定。将50μl的抑制剂加入含有50μl可溶性蛋白质提取物的每孔中，从而得到0.78、1.56、3.125、6.25、12.5、25、50和100μM咪草啶酸或者0.78、1.56、3.125、6.25、12.5、25、50和100μM 灭草烟的终浓度。每种品系还包括零除草剂对照。按照Singh等(1988)Anal.Biochem.171：173-179所述的进行反应。在530nm处测定吸光度。将表达为每项处理的平均吸光度值的AHAS活性以零除草剂对照平均值的百分比形式给出。 

结果和讨论

在除草剂耐受性作物中，可将作物损伤表型归因于基因型和环境(G×E)之间的相互作用。除草剂耐受性的环境成分是非生物(即，天气、土壤)和生物因素(即昆虫、疾病和杂草压力)联同除草剂剂量影响的总和。该环境影响的例子参见图10，其中证实了种植在四种不同场所(Velva，ND，USA；Angers，FR；Saintes FR；Formosa，AR)的相同基因型在相同剂量比率(200g ai/ha咪草啶酸)下的植物毒性的变化。除草剂耐受性(HT)植物中的基因型因素是HT基因加上其余的遗传背景以及两者之间相互作用的总和。 

为评估HT基因的相对耐受性水平，使用了两种方法。第一种方法在一系列环境严格条件(场所和年代结合不同的除草剂剂量)下检测除草剂损伤，第二种方法用增强水平的除草剂来测试靶酶(体外)。利用第一种方法，通过在施用除草剂后的6-10天计算当前商业的地方适应性的A205V对照的平均植物毒性指数(PI)，我们定量了于该性状相关的环境因子。以携带A122T突变的不同杂种的PI值对A205V对照的平均PI值作图，评估新的突变在一系列环境因素中的相对抗性水平(图11和12)。如图11和12的X轴所见，场所与除草剂剂量的组合产生了环境条件的多种排列，其对于咪草啶酸处理的PI平均值在5.9至78的范围内，而对于灭草烟处理则为2至100。Y＝x线代表了所有环境因素下A205V对照的平均PI值。 

图11显示了咪草啶酸处理后获得的结果。A122T纯合型杂种随环境因素变得更严格而显示出PI的增长。然而，回归线的斜率(b＝0.149±0.0667，P＜0.0375)表明，作为环境严格性的函数的作物损伤水平以比A205V对照更低的速率增加。以杂合状态组合A122T突变与A205V等位基因的杂种，显示出与纯合状态下的A122T杂种相比对环境严格性相似的反应 (b＝0.39±0.05，P＜0.0001)。另一方面，以杂合状态(A122T/WT)含有A122T突变的杂种表现出比A205V对照在更低水平的环境严格性下更高的作物损伤等级，如通过回归线的更高y-截距值所示的(a＝15.3±2.67)。当环境因素的严格性增加时，这些A122T杂合型杂种显示出比A205V对照更好的性能，如通过线性方程的斜率所示的(b＝0.45±0.062，P＜0.0001)。当在相同的环境下用灭草烟处理相同项目时，同样适用图12。 

灭草烟处理的环境严格性可通过图12中每种基因型的图例所示的回归线来概括。 

为证实田间中的除草剂耐受性效果，将相同的除草剂耐受性基因组合进行AHAS酶抑制性研究。对来自表18中各项目的12个个体的总体进行这些研究。第一项实验(第1组，表21)的两个重复的平均值在图13中显示，第二项实验(第2组，表21)的在图14中显示。包括了未处理对照样品以提供100％AHAS酶活性的基线。用100μM咪草啶酸处理的A122T纯合型杂种中的AHAS活性是未处理对照的69％，对于100μM灭草烟，其为未处理对照的64％(图13)。对于分别用100μM咪草啶酸和100μM灭草烟处理过的提取物，A122T/A205V杂合型杂种中AHAS酶的活性为59％和60％(图13)。作为当前的商业化A205V产品，A205V纯合型杂种品系在100μM咪草啶酸和100μM灭草烟下分别表现出未处理对照的36％和未处理对照的42％的AHAS活性(图13)，比A122T纯合型杂种和A122T/A205V杂合型杂种的活性均低。 

在第二组数据中，A205V纯合型杂种表现与A122T杂合型杂种几乎相同(图14)。两种类型的杂种均表现出在50μM咪草啶酸下30％的AHAS活性，而A205V杂种在100μM咪草啶酸下具有26％的活性，A122T杂合型杂种在100μM咪草啶酸下具有30％的活性。相比，从A122T纯合型杂种中提取的AHAS酶表现出在增高水平的咪草啶酸下最小的抑制量，在50μM和100μM咪草啶酸下分别表现为相对于未处理对照的63％和60％的活性。WT品系(B7)在两实验组中是基因型上一致的，在100μM咪草啶酸水平下两组实验之间显示出6％活性的差异(相对于第1组中未处理 对照17％AHAS活性(图13)，相对于第2组中未处理对照11％的AHAS活性(图14))。 

基于田间和AHAS酶活性数据，确定了新的A122T突变提供了比当前A205V突变更强的对咪唑啉酮类的耐受性。由于Imr1赋予了中等水平的抗性，A205V向日葵中的除草剂抗性的商业水平需要以纯合状态组合两种遗传因子。相比，通过单独利用A122T突变，则不再需要Imr2增强子(或通过基因型相互作用的基因)来获得商业水平的耐受性。最重要地是，结果证实A122T既可以纯合型单基因HT性状来使用，也可与A205V HT性状一起杂合叠加使用，提供了增强的耐受性水平、杂草控制中更好的灵活性并促进了CLEARFIELD生产系统中该新型突变的部署。 

本说明书中所述的所有出版物和专利申请均表明了本发明所属技术领域技术人员的水平。将所有出版物和专利申请引入本文作为参考，其程度如同表明每份单独的出版物或专利申请均特别地且各自地引入作为参考。 

尽管为清楚理解，已通过举例说明和实施例的方式详细描述了上述发明，但很明显可在所附权利要求的范围内实施某些改变和修饰。