用体外细胞培养方式鉴定“肾主骨”效应的测定方法

摘要

本发明属实验方法领域，涉及一种用体外细胞培养方式鉴定“肾主骨”效应的测定方法。该方法应用体外细胞培养的方式，将肾小球系膜细胞直接作用于成骨细胞，在细胞水平观察两者的内在联系。经实验结果表明，本方法有效地避免了体内复杂的影响因素，将肾小球系膜细胞直接作用于成骨细胞，并在细胞水平观察两者内在联系，证实肾系膜细胞能直接作用于成骨细胞，促进成骨细胞增殖；肾系膜细胞能直接作用于成骨细胞，促进成骨细胞分泌AKP。本发明的实验结果为“肾主骨”的中医理论提供了更直接及客观确切的现代科学理论依据。本发明方法还可用于制备成骨细胞培养液。

说明书

技术领域

本发明属实验方法领域，涉及体外细胞培养的测定方法，具体涉及一种用体外细胞 培养方式鉴定“肾主骨”效应的测定方法。该方法应用体外细胞培养的方式，将肾小球 系膜细胞直接作用于成骨细胞，在细胞水平观察两者的内在联系。本发明还包括建立该 方法的步骤和其应用领域。

背景技术

中医理论认为，肾藏精。精，是构成人体和维持人体生命活动的最基本物质。精生 髓，髓居于骨中，促进骨的生长发育，故肾具有“主骨生髓”的功能。中医古籍中记载 “肾生骨髓”(《素问·阴阳应象大论》)、“肾主身之骨髓”(《素问·痿论)、肾“其充在 骨”(《素问·六节脏象论》)。《圣济总录·诸痹门》大力提倡“补肝肾以壮骨”，强调补 肾填精药对骨及骨关节疾病的作用。目前，临床上多用补肾中药治疗多种骨代谢疾病。

当前对“肾主骨”现代机制进行的研究，主要从钙磷代谢、激素(如活性维生素D₃)、 细胞因子(如骨形态发生蛋白BMP7)及神经内分泌等方面，间接证实“肾主骨”的现 代理论依据。中医所说的肾是从功能上定义，包括了现代医学上的人体器官——肾脏， 肾脏是“肾主骨”理论体系的主要器官。胚胎学等方面的研究证实，肾与骨均发生于中 胚层，属于同源器官；肾小球系膜细胞是肾小球的主要固有细胞之一，具有分泌多种生 物活性物质的功能；成骨细胞来源于骨髓间充质干细胞，是骨形成过程中的重要功能细 胞，其主要功能是分泌骨基质，不仅与骨的形成密切相关，且在骨吸收过程中也起关键 性作用；所述的成骨细胞对骨组织的生长发育、骨代谢平衡、骨量维持和损伤修复起关 键作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种用体外细胞培养方式鉴定“肾主骨”效应的测定方法，该 方法应用体外细胞培养的方式，将肾小球系膜细胞直接作用于成骨细胞，在细胞水平观 察两者的内在联系。所述的方法能鉴定肾小球系膜细胞直接作用于成骨细胞的效应，为 证实中医“肾主骨”的理论提供现代科学理论依据。

本发明还提供了建立所述方法的步骤及其用途。

本发明的用体外细胞培养方式鉴定“肾主骨”效应的测定方法，是将源于实验幼鼠 的成骨细胞，在含有实验大鼠肾小球系膜细胞培养上清液的培养液中培养后，测定经培 养的成骨细胞的增值及碱性磷酸酶的浓度，在细胞水平分析所述成骨细胞和肾小球系膜 细胞的内在联系，鉴定“肾主骨”效应。本发明的一个实施例中：将取于幼鼠的成骨细 胞分成两组，一组用含有正常大鼠血清的培养液培养，另一组用含有大鼠肾的系膜细胞 培养后的培养液上清去培养；在培养的第一、第二、第三、第五天检测成骨细胞的增值 情况，以及在第三天检测培养上清液的碱性磷酸酶浓度，了解成骨细胞的生长及功能的 变化；实验结果显示，用含有大鼠肾的系膜细胞培养后的培养液上清培养的成骨细胞能 促进成骨细胞的生长分化及功能；表明所述的体外细胞培养的方法能为证实中医“肾主 骨”的理论提供直接简单明了的现代科学理论依据。

具体而言，本发明的用体外细胞培养方式鉴定“肾主骨”效应的测定方法，其特征 在于，其包括步骤：

(1)分离培养实验大鼠肾小球系膜细胞，

所得肾小球系膜细胞免疫组化法鉴定为抗结蛋白抗体阳性、抗细胞角蛋白抗体阴 性；

(2)提取分离成骨细胞，

所得成骨细胞鉴定结果显示：显微镜下见细胞贴壁生长呈三角形、纺锤形和多角形 等多种形态，培养3～5天，细胞体积增大，见较多细胞分裂相；胞浆丰富，向外伸展，伸 出多个突起，与周围细胞的突起相互连结；培养1周左右，细胞融合，多呈立方形；行 碱性磷酸酶染色，倒置相差显微镜下观察细胞的细胞核及细胞质上形成了灰黑至深黑色 颗粒状或片状沉淀；

(3)分组培养成骨细胞，

先用无血清培养液培养24h，然后分为正常血清组和系膜细胞组，正常血清组予含 10％的正常大鼠血清RPMI-1640培养液；系膜细胞组予含20％的系膜细胞上清液的正 常大鼠血清RPMI-1640培养液；

(4)制备培养液；

正常血清组培养液：SD雄性大鼠常规取血，离心，收集上清液，-20℃冷藏，使用 前4℃解冻过夜，56℃水浴灭活，过滤除菌，用RPMI-1640培养液稀释至10％；

系膜细胞组培养液：取第3代系膜细胞接种培养瓶中，每周3次换液至细胞铺占瓶 底约80％，换用含10％的正常小鼠血清RPMI-1640培养液，继续培养，取上清备用， 使用时用正常血清组培养液稀释至20％；

(5)采用成骨细胞增殖(MTT法)、碱性磷酸酶(ELISA法)，测定观察指标，

在酶标仪上检测成骨细胞光密度(OD)值，检测波长490nm；

ELISA法测定碱性磷酸酶，在450nm处测吸光值；

所有计量资料采用均数±标准差表示，利用SPSS15.0软件进行统计分析， 采用单因素方差分析，应用Levene检验进行方差齐性检验，P＜0.05为差异有统计学意 义。

经测定，结果显示：

(1)所述的系膜细胞组和正常血清组的成骨细胞的增殖均随时间而逐步增加，表 明肾系膜细胞能直接作用于成骨细胞，促进成骨细胞的增殖；

(2)所述的系膜细胞组的第三天AKP的浓度浓度明显高于正常血清组30.5％， P＜0.05，表明肾系膜细胞能直接作用于成骨细胞，促进成骨细胞分泌AKP。

表1是成骨细胞增殖的OD值(n＝8)。

表2是成骨细胞第三天分泌AKP的浓度(n＝8)。

表1

^*系膜细胞组在各时间点的增殖均明显高于正常血清组(P＜0.05)

表2

^*与正常血清组比较，P＜0.05

本发明中，所采用的实验动物：出生24h以内红皮SD大鼠和100g SD雄性大鼠 (上海中医药大学实验动物中心提供，符合SPF级标准)。

本发明所述方法中的操作技术为本领域技术人员所知悉的操作技术，结合本发明所 描述的内容，可进行操作。

上述实验结果表明，本发明首次应用体外细胞培养的方式，有效地避免了体内复杂 的影响因素，将肾脏的主要细胞——肾小球系膜细胞，直接作用于骨的主要细胞——成 骨细胞，并在细胞水平观察了两者的内在联系，证实了肾系膜细胞能直接作用于成骨细 胞，促进成骨细胞的增殖；肾系膜细胞能直接作用于成骨细胞，促进成骨细胞分泌AKP。 本发明的实验结果为“肾主骨”的中医理论提供了更直接及客观确切的现代科学理论依 据，同时为临床研发和防治骨及骨关节疾病提供了新的实验方法。

本发明还可用于提供促进成骨细胞的生长分化的方法。

本发明方法还可用于制备成骨细胞培养液。

为了便于理解，下面通过附图和具体实施例对本发明的用体外细胞培养方式鉴定 “肾主骨”效应的测定方法进行详细的描述。需要特别指出的是，具体实施例和附图仅 是为了说明，显然本领域的技术人员可以根据本文说明，对本发明进行各种修正或改变， 这些修正和改变也将纳入本发明范围之内。

附图说明

图1显示了本发明中各时间点成骨细胞的增殖情况。

图2显示了本发明中第三天AKP的浓度(ug/L)。

具体实施方式

实施例1

材料与方法

1.1 实验动物新生(出生24h以内)红皮SD大鼠和100g SD雄性大鼠，由上海中医 药大学实验动物中心提供。上海中医药大学附属曙光医院实验动物中心为标准的SPF级 实验动物中心。

1.2 系膜细胞提取分离在无菌条件下分离SD雄性大鼠肾脏，采用系列筛网法分离 肾小球，经胶原酶消化后，分装至25cm²塑料培养瓶，加入RPMI-1640培养液，静置于5 ％CO2、37℃培养箱内；2-3周后传代，选择3代系膜细胞用于实验；采用免疫组化法进 行鉴定，抗结蛋白抗体阳性、抗细胞角蛋白抗体阴性证实为系膜细胞。

1.3 成骨细胞提取分离取新生SD大鼠，无菌操作取下颅盖骨；剔除骨膜、血管和 结缔组织，并用无菌冷PBS液反复冲洗至颅骨呈白色，剪碎颅盖骨成约1mm2大小的骨 片；0.25％胰蛋白酶振荡消化30min，弃去消化液；用0.1％Ⅱ型胶原酶振荡消化5次；收 集5次消化的上清液，以1500r/min，5min离心，吸弃上清液；加入RPMI-1640基础培养 液，用1mL移液枪轻轻吹打50次，制成细胞悬液，接种到培养瓶中，置入5％CO2、37 ℃培养箱培养；选择3代成骨膜细胞用于实验。细胞鉴定：显微镜下见细胞贴壁生长呈 三角形、纺锤形和多角形等多种形态，培养3～5天，细胞体积增大，见较多细胞分裂相； 胞浆丰富，向外伸展，伸出多个突起，与周围细胞的突起相互连结。培养1周左右，细胞 融合，多呈立方形。行碱性磷酸酶染色，倒置相差显微镜下观察细胞的细胞核及细胞质 上形成了灰黑至深黑色颗粒状或片状沉淀。

1.4 成骨细胞的分组培养先用无血清培养液培养24h，然后分为正常血清组和系膜 细胞组；正常血清组予含10％的正常大鼠血清RPMI-1640培养液；系膜细胞组予含20％ 的系膜细胞上清液的正常大鼠血清RPMI-1640培养液。

1.5 培养液的制备正常血清组培养液：SD雄性大鼠用巴比妥腹腔注射麻醉后，在 无菌条件下由腹主动脉取血，离心(3000r/min，20min)，收集上清液，-20℃冷藏，使用 前4℃冰箱解冻过夜，56℃水浴灭活20min，过滤除菌，用RPMI-1640培养液稀释至10 ％；系膜细胞组培养液：取第3代系膜细胞均匀接种于25cm2培养瓶中，每周3次换液 至细胞铺占瓶底约80％，换用含10％的正常小鼠血清RPMI-1640培养液，10ml/瓶，继 续培养，3天后吸取上清液备用。使用时用正常血清组培养液稀释至20％。

1.6 观察指标的测定

1.6.1 成骨细胞增殖(MTT法)取第3代成骨细胞以5×10⁴个/mL，100ul/孔接种于 96孔培养板内，细胞贴壁后更换含0.5％FBS的RPMI-1640培养液培养12h，然后更换为 两种培养液，每组8孔。隔天换液1次，各组分别在培养第2、3、4、5天后，加入20 μL新鲜配制过滤除菌的MTT(5mg/mL)，继续培养4h后弃去培养液，倒置96孔板于吸 水纸上，轻轻拍打使其干燥，加入100μL DMSO，振荡孵育10min，在酶标仪上检测光 密度(OD)值，检测波长490nm。

1.6.2 碱性磷酸酶(ELISA法)两组在培养3d后，每组取8孔，吸取培养液。ELISA 步骤按说明书操作，简要步骤为：建立标准曲线；加样混匀；将反应板粘上封板纸静 置；用洗涤液将反应板充分洗涤，在滤纸上印干；加第一抗体工作液，静置；再洗板； 加酶标抗体工作液，将反应板静置；同前洗板；加入底物液A、B，静置避光反应；加 入终止液混匀；在450nm处测吸光值。

1.7 统计学方法所有计量资料采用均数±标准差表示，利用SPSS15.0软 件进行统计分析，采用单因素方差分析，应用Levene检验进行方差齐性检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 成骨细胞增殖的情况 系膜细胞组和正常血清组的成骨细胞的增殖都随着时间 而逐步增加，但系膜细胞组在各时间点的增殖要明显高于正常血清组(P＜0.05)，系膜 细胞组比正常血清组各时间点分别高72.4％、52.1％、60.0％、12.6％(如表1所示)。

表1 成骨细胞增殖的OD值(n＝8)

^*系膜细胞组在各时间点的增殖均明显高于正常血清组(P＜0.05)；

2.2 成骨细胞分泌AKP的情况在第三天，系膜细胞组的AKP浓度高于正常血清组 30.5％，明显高于正常血清组，P＜0.05(如表2所示)。

表2 第三天AKP的浓度(n＝8)

^*与正常血清组比较，P＜0.05

上述实验结果表明，本发明应用体外细胞培养技术，能有效避免体内复杂的影响因 素，将肾脏的主要细胞——肾小球系膜细胞，直接作用于骨的主要细胞——成骨细胞； 在细胞水平观察两者的内在联系，为“肾主骨”提供更直接及客观确切的现代科学理论 依据，为临床研发和防治骨及骨关节疾病提供新的实验方法。