刺果藤属物种的抗结核病组合物

摘要

在本研究中，讨论了来自于植物草质刺果藤（科-梧桐科）的，显示出抗结核活性的活性级分。在生合成试验的初步筛选中，草质刺果藤地上部分的甲醇提取物显示出对抗MtbGS的活性。在有机溶剂中进行后续分级。此外，两种级分（级分D和K）显示出对抗结核分支杆菌谷氨酰胺合成酶活性的抑制活性。这些级分D和K于7.5mg/ml的浓度分别抑制74%和44%。从对抗纯化的结核分支杆菌谷氨酰胺合成酶的剂量响应曲线中发现，级分K的测定的IC50值为4.5mg/ml。本研究的主要优势在于知道了化合物的作用方式，其增加了草质刺果藤成为抗结核草药的潜力。对于牛分支杆菌BCG的IC

说明书

技术领域

本发明涉及一种包含刺果藤属物种提取物的组合物，所述组合物用于 抑制引发结核病的结核分支杆菌的结核分支杆菌谷氨酰胺合成酶。更特别 地，本发明涉及刺果藤属物种通过抑制MtbGS酶（结核分支杆菌谷氨酰胺 合成酶）的抗结核活性。

背景技术

WHO估计，相比于2006年的924万新增病例，2007年产生了927 万例新增TB病例。在这些927万例新增病例中，估计有44%或者说410 万（每100000人口中有61例）是新涂阳病例。与其他任何国家相比，印 度每年有更多的新增TB病例。已知印度人口中具有最大的疾病发生率， 其中高达180万为已受感染者。人们估计，2007年有137万例HIV阳性 的TB发生（全部病例的14.8%）并且在HIV阳性的人群中，456000例死 于TB。针对该新兴威胁的唯一的世界范围内的研究发现，在灾情最严重 的地区，将近20%的多药耐药结核病（MDR-TB）病例为严重/广泛耐药结 核病（XDR-TB）。本领域需要有能够有效地对抗杆菌以降低结核病发生率 并且降低由于该疾病的发病率和死亡率的分子。此外，这能够成为克服多 药耐药杆菌的策略，所述多药耐药杆菌逐渐使常规治疗方案无效。

MtbGS酶（结核分支杆菌谷氨酰胺合成酶）被鉴定为该疾病的靶标， 并且其通过合成聚-L-谷氨酸-谷氨酰胺复合物，在细胞壁的生合成中发挥 重要作用。来自于结核分支杆菌、牛分支杆菌和其他类似细菌的GlnA1酶 的胞外定位与其参与细胞壁成分聚(L-谷氨酸谷氨酰胺)的合成有关。

B.A.Adeniyi等人在于2004年5月26日在线发表的，植物疗法研究 第18卷，第5期，414-418页（Phytotherapy Research,Volume 18,Issue 5, Pages 414-418）中题目为“In vitro anti-mycobacterial activities of three species  of Cola plant extracts(Sterculiaceae)”的文章中公开了使用放射性测量 （BACTEC）法，使用1000μg/ml的缓慢生长的牛分支杆菌ATCC 35738， 对获得自三种尼日利亚梧桐科植物：红可乐树（Cola accuminata）、白可乐 树（C.nitida）和千年可乐树（C.milleni）的提取物进行抗分支杆菌属性的筛选。另外，使用肉汤微稀释法（broth microdilution method）对于母牛分 支杆菌的六种快速生长的ATCC菌株测试所述提取物。来自于红可乐树的 树叶、茎皮和根皮以及来自于白可乐树和千年可乐树的树叶和茎皮的甲醇提取物在1000μg/ml的最高浓度下无活性。人们发现，只有白可乐树和千 年可乐树的根皮的甲醇提取物具有对抗牛分支杆菌和母牛分支杆菌菌株 的潜力。

Tullius,M.V.,G.Harth和M.A.Horwitz.2001.High extracellular  levels of Mycobacterium tuberculosis glutamine synthetase and superoxide  dismutase in actively growing cultures are due to high expression and  extracellular stability rather than to a protein-specific export mechanism.Infect. Immun.69:6348-6363。

发明目的

本发明的主要目的是提供一种包含刺果藤属物种提取物的组合物。所 述提取物用于抑制引发结核病的结核分支杆菌的结核分支杆菌谷氨酰胺 合成酶。

本发明的另一个目的是提供一种刺果藤属植物的提取物，所述提取物 抑制引发结核病的结核分支杆菌的结核分支杆菌谷氨酰胺合成酶 （MtbGS）的活性。

本发明的另一个目的是提供有效对抗结核分支杆菌的抗菌提取物。

本发明的另一个目的是提供一种抑制MtbGS的草质刺果藤（Byttneria  herbecea）提取物，进而提供一种治疗结核病的方法。

发明内容

因此，本发明涉及一种包含刺果藤属物种提取物的组合物，所述组合 物用于抑制引发结核病的结核分支杆菌的结核分支杆菌谷氨酰胺合成酶。 另外，本发明涉及抑制处于休眠期和生长期的结核分支杆菌。本发明进一 步涉及一种通过向患者施用刺果藤属物种的化学处理提取物治疗结核病 的方法。

另外，本发明公开了刺果藤属本身的用途，经过化学处理以形成提取 物和提取物的抑制作用，因此具有对抗疾病症状，特别是处于分支杆菌的 休眠期和生长期的结核病的活性。

在本发明的一个实施方案中，提取物的纯化的级分抑制MtbGS。

在本发明的另一个实施方案中，刺果藤属植物部分本身抑制MtbGS。

在本发明的另一个实施方案中，刺果藤属植物、植物部分、提取物及 其级分对于处于生长期和休眠期的结核分支杆菌有效。

在本发明的另一个实施方案中，刺果藤属植物、植物部分、提取物及 其级分用于治疗疾病症状。

在本发明的另一个实施方案中，刺果藤属植物、植物部分、提取物及 其级分用于治疗疾病症状，其中刺果藤属抑制MtbGS。

在本发明的另一个实施方案中，组合物包含至少3μg/ml的用于抑制 结核分支杆菌谷氨酰胺合成酶的刺果藤属物种提取物。

在本发明的另一个实施方案中，所述组合物用于治疗结核病。

在本发明的一个实施方案中，所述提取物对于由处于杆菌的生长期和 休眠期的分支杆菌引起的结核病有效。

在本发明的一个实施方案中，所述提取物用于制备治疗结核病的药物 组合物和剂型。

在本发明的一个实施方案中，所使用的刺果藤属物种是草质刺果藤。

附图说明

图1-收集自柱色谱法的25个级分的TLC。使用5:95MeOH:CHCl₃作为用于收集自柱色谱法的级分的展开体系。将显示出相似的化合物TLC 模式的级分合并以获得11个级分。

图2-级分D的合并亚级分的TLC。使用10:3:87乙腈:甲醇:氯仿作 为用于在进行级分D的柱色谱法之后收集的这些亚级分的展开体系。将显 示出相似的化合物TLC模式的级分合并并且进行最终的TLC。

图3-获得自制备TLC（PLC）的级分D4的主要成分的TLC。

进行该TLC以检查在PLC之后获得的主要成分的纯度。为此，使用 甲醇:氯仿（5:95）作为展开相。

图4-测定级分K对纯化的结核分支杆菌谷氨酰胺合成酶的生合成活 性的剂量响应曲线。使用0.23-15mg/ml的不同浓度的级分K测定IC₅₀值。 测定的IC₅₀值为4.5mg/ml。

图5-测试本发明的化合物对处于生长期的杆菌的活性。使用0.78-100 g/ml的不同浓度的级分K测定IC₅₀值。测定的IC₅₀值为1.56μg/ml。

具体实施方式

在2002年9月通过网络工程从阿萨姆邦收集植物。收集地上部分， 即刺果藤属植物（科：梧桐科，属：刺果藤属，种：草质刺果藤）的小枝。 制备刺果藤属植物的地上部分在选自水性和非水性溶剂，水、乙醇、氯仿 中的一种或其组合的溶剂中的提取物，并且如本文实施例1所举例，评价 所述提取物对于MtbGS的抑制活性。所述提取物的特点在于其成分并且通 过本领域熟知的技术来纯化。

鉴定刺果藤属植物、植物部分、提取物及其级分以及进一步纯化的级 分的成分，并且评价它们对MtbGS的抑制作用。参考图5，其中IC₅₀值被 测定为1.56μg/ml，所述提取物的最低抑菌浓度（MIC）被测定为是IC₅₀值的两倍，即所述MIC至少为3μg/ml。

在本发明的一个方面中，包含至少3μg/ml的刺果藤属植物部分提取 物的药物组合物用于抑制MtbGS。

本发明的药物组合物用于治疗病症，其中需要抑制MtbGS。

在本发明的一个实施方案中，所述药物组合物用于治疗结核病。在另 一个实施方案中，所述组合物用于治疗处于生长期以及休眠期的，引发结 核病的生物体的结核病。

所述药物组合物包含本发明的刺果藤属植物部分的提取物和药学上 可接受的成分，所述成分选自但不限于填充剂、粘合剂、调味剂、崩解剂、 润滑剂、溶出度控制剂、甜味剂、载体等。可选地，本发明的组合物可以 是常规剂型或者是缓慢释放、定时释放、控制释放或脉冲式释放剂型。

在一个实施方案中，本发明提供一种通过向受试者施用刺果藤属植物 提取物来治疗结核病的方法。

在另一个实施方案中，本发明提供一种通过向受试者施用包含刺果藤 属植物提取物的组合物来治疗结核病的方法。

在另一个实施方案中，本发明提供一种使用包含刺果藤属植物提取物 的组合物抑制MtbGS的方法。

在另一个实施方案中，本发明提供一种使用刺果藤属植物提取物抑制 MtbGS的方法。

在另一个实施方案中，本发明提供刺果藤属植物提取物在制备抑制 MtbGS和/或治疗结核病的药物组合物中的用途。

在另一个实施方案中，本发明提供刺果藤属植物提取物用于抑制 MtbGS和/或治疗结核病的用途。

在另一个实施方案中，本发明提供包含刺果藤属植物提取物的组合物 用于抑制MtbGS和/或治疗结核病的用途。

本发明将进一步通过下面给出的实施例来说明，但是这些实施例不应 该被解释为限制本发明的范围。

实施例

实施例1：用于鉴定MtbGS抑制剂的方案：

试验混合物含有50mM HEPES（4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)、pH6.8 的缓冲剂、220mM L-谷氨酸（pH被调节至6.8）、7.5mM氯化铵、32.5mM 氯化镁和62.5μg/ml酶（结核分支杆菌谷氨酰胺合成酶）。向85μl反应混 合物中加入5μl样品（刺果藤提取物）。在对照中加入5μl DMSO（二甲亚 砜）并且在空白中加入5μl 420mM EDTA（乙二胺四乙酸）。通过在反应 混合物中加入7.6mM ATP（pH被调节至~6.8）来启动反应并且于25℃孵育 2小时。通过加入停止试剂然后加入柠檬酸盐以阻断ATP的进一步水解来终 结反应。将全部混合物于室温放置另外的30分钟以通过SpectraMax平板读 取器于655nm处读取颜色。发现刺果藤属物种的甲醇提取物对于MtbGS有 活性。

[Ref-Singh.U,Sarkar.D.,Development of a Simple High-Throughput  Screening Protocol Based on Biosynthetic Activity of Mycobacterium  tuberculosis Glutamine Synthetase for the Identification of Novel Inhibitors, Journal of Biomolecular Screening 11(8);2006.]

实施例2：实施例1的甲醇提取物的柱色谱法：

使用根据表-1的梯度流动相，通过200gms的硅胶（100-200目）对 19gms的样品进行色谱法。在该阶段收集25个级分。使用5:95MeOH:CHCl₃ 展开相在氧化铝包被的硅胶TLC板上进行所有这些收集的级分的TLC以 检查纯度。将显示出相似TLC（图-I）模式的级分合并，并将其置于15ml 玻璃测试管中以获得11个级分（A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K）。 在除去溶剂之后，使用实施例1中提到的方案评价这些级分的生物活性。 发现级分D（第4级分）和K（第11级分）显示出对抗MtbGS的活性。

表I

实施例3：级分D（第4级分）的纯化：

使用36gms的硅胶（100-200目）和如表II所描述的流动相对100mg 的级分D进行再次色谱法。进行所有收集的级分的TLC（图-2）。在分析 TLC板之后，将级分合并成10个最终级分D1-D10。进行如实施例1的试 验以鉴定活性级分。发现级分D4是有活性的。

表-II

实施例4：级分K（第11级分）的纯化：

通过使用RP C₄柱，用甲醇:水（50:50）作为流动相，分离9gms的级分 K。取出含有主要化合物的色带并且使用100%的甲醇提取。蒸发溶剂并且 评价级分K1-K25的生物活性。发现级分K1-K19对于MtbGS有活性。通过使 用RP C₁₈柱，使用如表III所述的流动相来进一步分离级分K1和K19，并且 通过RP C₁₈玻璃TLC板来评估纯度。应用标准技术鉴定活性化合物的结构。

表-（III）

实施例-5：使用上述优化的方法测定对于由MtbGS催化的生合成反应 的抑制作用（Singh.U,Sarkar.D.,Development of a Simple High-Throughput  Screening Protocol Based on Biosynthetic Activity of Mycobacterium  tuberculosis Glutamine Synthetase for the Identification of Novel Inhibitors, Journal of Biomolecular Screening 11(8);2006）（表-IV）。应用0.25mg/ml- 15mg/ml的不同浓度的级分K测定级分K对MtbGS生合成活性的剂量响 应作用。从剂量响应曲线测定的IC₅₀值为4.5mg/ml（图-IV）。

[Ref-Singh.U,Sarkar.D.,Development of a Simple High-Throughput  Screening Protocol Based on Biosynthetic Activity of Mycobacterium  tuberculosis Glutamine Synthetase for the Identification of Novel Inhibitors, Journal of Biomolecular Screening 11(8);2006.

表（IV）

实施例-6：使用能够鉴定活性结核杆菌抑制剂的方案筛选化合物。简 单地说，使用培养物于620nm处的吸光度来表示该筛选方案中杆菌的活 跃的生长阶段。将具有在DMSO中0.78-100μg/ml的不同浓度的样品的 2.5μl化合物溶液无菌转移至无菌96孔板的单独的孔中。将每ml含有10⁵个细胞的，在草分支杆菌（M.pheli）介质中补充有L-谷氨酸作为氮源的， 247.5μl牛分支杆菌BCG培养物无菌转移至每一个孔中，以达到250μl的 总体积，并且采用密封层覆盖平板。在每一个孔中留下125μl的空间以形 成顶端空间与培养物之间的体积比为精确的0.5。在密封之后，将这些培 养物板在孵育器中于37℃孵育。8天的孵育之后，于620nm处读取培养 物的OD。从剂量响应曲线测定的IC₅₀值为1.56□g/ml（图-V）。

优点

1.提供了用于抑制MtbGS的生物源。

2.本发明的提取物抑制处于生长期以及休眠期的分支杆菌。

3.所述提取物有用于多药耐药结核病以及严重/广泛耐药结核病。