一种体外准确检测KRAS基因突变的方法

摘要

本发明提供了一种体外准确检测KRAS基因突变的方法，以克服传统等位基因特异性PCR法特异性不足，存在假阳性现象的缺点。该体外准确检测KRAS基因突变的方法，包括以下步骤：（1）等位基因特异性引物的设计及合成，包括针对KRAS基因第二号外显子典型的7种突变分别设计的等位基因特异性引物，作为上游引物；共同的下游引物为延伸阻滞引物；（2）提取被测样本的KRAS基因组DNA；另制取野生型基因组DNA（作为野生型模板）；（3）实时荧光PCR反应。本发明的检测方法特异性强、灵敏度高、节省耗材和时间。

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测KRAS基因突变的方法。

背景技术

基因突变是指基因组DNA分子在结构功能上发生碱基组成或排列顺序 的改变，主要包括碱基的替代和片段的插入缺失，是导致基因型疾病的重要 原因之一。基因突变分析在生物医学研究中，尤其是在基因型疾病诊断及病 理研究中有着非常重要的作用。KRAS基因编码的蛋白参与由表皮生长因子受 体(EGFR)介导的细胞信号转导通路，影响细胞的增殖、生长和转移；正常的 KRAS基因编码的蛋白在接受上游信号活化后被激活，并将在信号传递给下游 细胞因子后恢复非激活状态；而突变的KRAS基因所编码的蛋白无需上游信号 活化便始终处于激活状态，导致细胞的非正常增殖和生长，引起恶性肿瘤。 抗EGFR类肿瘤药物通过特异性阻滞EGFR与受体结合，阻断细胞转导通路， 从而达到抑制癌细胞增殖的目的；多项研究发现，接受抗EGFR药物治疗的 结直肠癌患者中，KRAS基因野生型的病人较KRAS基因突变型病人更能从治 疗中受益：具有更高的药物客观反应率和较长的生存时间。因此，能够准确 检测KRAS突变状态对指导结直肠癌患者临床用药有重要意义。人类KRAS基 因的突变主要发生该基因第二号外显子上，其中最常见的突变有G12S、 G12R、G12C、G12A、G12D、G12V、G13D7种形式。

传统检测KRAS基因突变的方法多种多样，其中最为经典是双脱氧测序技 术，此外还包括等位基因特异性寡核苷酸杂交(ASO)、连接酶检测反应(LDR)、 多聚酶链限制性长度多态性分析(PCR-RFLP)和TaqMan技术。虽然这些方法 能够检测突变是否存在，但大多数方法不能确定突变的类型并且只能检测到 突变的一部分；同时大多数方法需要琼脂糖凝胶电泳等PCR后处理检测才能 分析结果，准确度和灵敏度受到限制。近年来，蝎型引物(Scorpion primers)、 高分辨溶解曲线(HRM)、变性高效液相色谱分析(dHPLC)和焦磷酸测序技术 (Pyrosequencing)等方法技术改善了检测的灵敏度和特异性，但仍存在耗材昂 贵，假阳性现象严重和操作繁琐等缺点。

等位基因特异性PCR(Allele-specific PCR)，也称为ARMS(Amplification  refractory mutation system)技术，是一种利用特异性引物对模板进行选择性扩 增而达到检测基因突变的方法。其原理是根据PCR过程中DNA聚合酶引导 的引物延伸从3'末端开始，所以引物3'末端的碱基与模板的互补程度强烈影响 聚合酶的识别作用和PCR反应的进行:若这个碱基与模板正常互补配对(A-T, G-C)，则引物可以不间断延伸，PCR得以高效进行，得到完整的产物；反之， 若这个碱基与模板非正常配对，则引物的延伸受到阻滞，PCR效率大大降低。 故只需将与突变位点对应的碱基放置在引物的3'末端，当用突变型特异性引 物进行PCR扩增时，只要突变型模板可以得到扩增，而野生型模板的扩增受 到了抑制。SYBR Green是一种DNA结合染料，可以非特异性与DNA双链小 沟结合。在游离状态下SYBR Green只有本底水平荧光，而与DNA结合后其 荧光强度增强1000倍以上。PCR反应过程中，产物成指数形式扩增，荧光强 度也随之倍增，起到实时监测作用。传统的等位基因PCR法特异性不足，常 常出现假阳性现象，使得检测结果不准确。

发明内容

为了克服传统等位基因特异性PCR法特异性不足，存在假阳性现象的缺 点，本发明提供了一种体外准确检测KRAS基因突变的方法，通过设计高特 异性引物与延伸阻滞引物，结合快速PCR法实现体外准确检测KRAS突变。

为实现以上发明目的，本发明的基本技术方案如下：

一种体外准确检测KRAS基因突变的方法，包括以下步骤：

（1）等位基因特异性引物的设计及合成

针对KRAS基因第二号外显子典型的7种突变分别设计等位基因特异性引 物，作为上游引物；序列信息如下：

G12S5'-ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCcA-3'    (24nt)

G12R5'-ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCaC-3'    (24nt)

G12C5'-ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCcT-3'    (24nt)

G12D5'-ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTcA-3'   (25nt)

G12A5'-ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTaC-3'   (25nt)

G12V5'-ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTcT-3'   (25nt)

G13D5'-ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTcA-3'    (24nt)

针对KRAS基因第二号外显子典型的7种突变设计共同的下游引物为延伸 阻滞引物；序列信息如下

延伸阻滞引物(38nt)：

（2）模板的准备

提取被测样本的KRAS基因组DNA；另制取野生型基因组DNA（作为野 生型模板）；

（3）实时荧光PCR

针对步骤（1）中的7种特异性引物，建立被测样本、野生型模板的反应 体系；

被测样本的每个反应体系中均加入被测样本的KRAS基因组DNA、特异 性引物和延伸阻滞引物；野生型模板的每个反应体系中均加入野生型基因组 DNA、特异性引物和延伸阻滞引物；

将配制好的各反应体系在荧光实时定量PCR仪上进行扩增，观察比较特 异性引物对应的被测样本、野生型模板的反应体系的扩增曲线，判断被测样 本中是否发生了KRAS突变。

基于以上基本方案，为取得更佳的技术效果，本发明还可作出以下优化 限定。

上述所有反应体系中还均加有UNG酶(尿嘧啶-N-糖基化酶)和2×SYBR  Green Mastermix。UNG酶可用于消除PCR污染，2×SYBR Green Mastermix 是商品化的酶混合体系，属于PCR常用的试剂。

上述反应体系可以有两种模式：

a、针对每一种特异性引物，均分别建立被测样本、野生型模板的反应体 系；按照该模式，不仅能够判断被测样本中是否发生了KRAS突变，还能确定 具体是何种突变。

b、将7种特异性引物分为三类；其中，G12S、G12R、G12C为一类， G12A、G12D、G12V为一类，G13D为一类；针对这三类特异性引物，均分 别建立被测样本、野生型模板的反应体系。

以每个反应体系的总量20μl计，若采用上述a模式，则加入特异性引物 200nM-500nM、延伸阻滞引物200nM-500nM，UNG酶(尿嘧啶-N-糖基化 酶)0.2U，2×SYBR Green Mastermix10μl，ddH2O补足体积20μl；

以每个反应体系的总量20μl计，若采用上述b模式，则：将G12S、G12R、 G12C上游引物按200nM:200nM:300nM比例混合，再加入所述延伸阻滞引物 300nM构成混合引物体系；将G12A、G12D、G12V上游引物按 200nM:200nM:300nM比例混合，再加入所述延伸阻滞引物300nM构成混合引 物体系；G13D上游引物200nM-500nM与延伸阻滞引物300nM构成单独的 引物体系；这三类引物体系也均加入有UNG酶(尿嘧啶-N-糖基化酶)0.2U， 2×SYBR Green Mastermix10μl，ddH2O补足体积20μl；

在每个反应体系的总量确定的情况下（比如20μl），以上加入物的量纲均 为本领域技术人员的常规取量方式。

上述扩增过程的最佳扩增参数为：50℃，2~5min；95℃，12~15min； 95℃，8~10sec；60℃，8~10sec；65℃，8~10sec；50~55个循环。

本发明与现有技术相比具有明显的优点和有益效果：

1.特异性强。在本发明中，针对KRAS突变位点设计的特异性引物和延 伸阻滞引物具有很高的特异性；同时延伸阻滞引物对野生型模板扩增起到阻 滞作用，二者共同保证了检测的特异性。

2.灵敏度高。在本发明中，延伸阻滞引物在其基础功能之外起到了阻碍 野生型模板扩增，富集突变的效果；同时所用的聚合酶具有很高的酶活力， 可以在极短的时间内(5~10秒)高效扩增突变型模板，两种效果共同保证了该 发明具有很高的灵敏度。

3.节省耗材和时间。基于本实验中设计和反应程序的特殊性，使得该方 法可以很大程度上节省实验时间和耗材，PCR反应过程总共只需要60-70min； 尤其是按照b模式，检测7个突变位点可以只需要3个反应孔。

附图说明

图1为KRAS突变位点序列信息，等位基因特异性引物和延伸阻滞引物 信息示意图。

图2为该发明实验流程和设计原理示意图。

图3、4、5为本发明应用于KRAS突变检测实验结果图。

具体实施方式

本发明是一种利用荧光等位基因特异性PCR和延伸阻滞引物检测KRAS 基因突变的技术，应用于体外KRAS基因序列分析和突变检测。

延伸阻滞引物(Extension-Refractory primes)是一种可以和自身延伸产物形 成“颈环”结构的引物；除了普通引物序列部分之外，延伸阻滞引物5’端额 外包含的一段碱基序列，这段序列可以与自身延伸得到的产物单链中包含突 变位点在内的一段碱基序列互补，形成“颈环”结构；由于野生型和突变型 模板间序列的不同，故形成的“颈环”结构强度(Tm值)有明显差别。

本发明针对KRAS基因第二号外显子典型的7种突变分别设计等位基因特 异性引物，7种引物均作为上游引物。各引物的3’末端碱基对应不同突变位点， 同时将其临位碱基(3’端倒数第二位)人为改变，使其和模板序列形成错配以提 高引物的特异性。下游引物为延伸阻滞引物，其基础引物部分对模板没有选 择性，但其5’端额外序列部分与野生型模板延伸得到产物完全互补配对，该 配对区域与上游引物结合位置有重叠部分。同时延伸阻滞引物与野生型模板 所得到的延伸产物形成的“颈环”结构的Tm值为70℃，而上游引物的Tm 值为61℃，因此延伸阻滞引物二级结构的形成能够阻碍上游引物与模板的结 合或导致结合后不能扩增，并且这种阻碍作用主要对野生型模板起作用，而 对突变型模板扩增几乎无影响，因此达到富集突变，提高灵敏度的作用。在 PCR反应完成后通过扩增曲线便可以准确判断样本中是否发生了KRAS突变。

图1为KRAS基因部分序列(含突变位点在内95nt)信息以及本发明中用到 的延伸阻滞引物的示意图。

请参阅图1-1所示，为本发明中所涉及到KRAS序列信息及引物和探针位 置示意图。其中左上部分黑色半箭头指代针对7个突变位点设计的特异性上 游引物，长度为25nt左右;左下方折叠式半箭头指代延伸阻滞引物，其基础 引物部分为26nt，5’端额外序列(颈环形成所需)为12nt；箭头指示碱基(3个 G)为KRAS突变发生位点，其中前两个位点可以发生G>T、G>A、G>C突变， 第三个位点发生G>A突变；7种特异性引物的3’末端碱基分别对应7种突变 形式，同时临位碱基故意设计为与模板错配。

请参阅图1-2所示，为本发明中延伸阻滞引物的延伸产物所形成的颈环结 构示意图。其中“颈”由其5’端额外序列与其自身延伸产物(野生型模板)包含 突变位点在内的序列互补配对形成，Tm≈70℃。延伸阻滞引物与突变型模板 延伸得到的产物在PCR延伸时不能形成类似二级结构。

图2为该发明所涉及到的实验流程和设计原理示意图。

请参阅图2-1所示，为本发明中检测KRAS基因突变的实验原理图。由于 等位基因特异性引物的3’末端碱基与突变位点碱基正常互补配对，即使存在 临位错配，DNA聚合酶依然可以同引物模板形成复合体，延伸得以进行。而 特异性引物的3’末端碱基与野生型位点不能正常互补配对，在同时存在临位 错配的情况下，DNA聚合酶不能识别引物，延伸难以进行。综合以上两点， 等位基因特异性引物可以在野生型模板的干扰下选择性扩增突变型模板。

请参阅图2-2所示，为本发明中延伸阻滞引物对突变模板进行富集的示意 图。图中左部分为延伸阻滞引物与突变型模板产生的延伸产物，由于其额外 序列与产物序列不能完全互补(突变位点错配)，在延伸时不能形成“颈环”结 构，所以上游引物可以正常的延伸。右部分所示为延伸阻滞引物与突变型模 板产生的延伸产物，其额外序列可以和产物序列完全互补，在延伸时形成了 “颈环”结构，因“颈环”结构与上游引物的结合位置有重叠部分，所以引 物的的结合与延伸均受到阻碍，PCR不能正常进行。因此，样本中的突变型 模板可以得到富集，而野生型模板的扩增受到了抑制。

本发明的体外准确检测KRAS基因突变的方法，包括以下步骤：

（1）等位基因特异性引物的设计及合成

针对KRAS基因第二号外显子典型的7种突变分别设计等位基因特异性引 物，作为上游引物；序列信息如下：

G12S5'-ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCcA-3'    (24nt)

G12R5'-ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCaC-3'    (24nt)

G12C5'-ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCcT-3'    (24nt)

G12D5'-ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTcA-3'   (25nt)

G12A5'-ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTaC-3'   (25nt)

G12V5'-ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTcT-3'   (25nt)

G13D5'-ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTcA-3'    (24nt)

针对KRAS基因第二号外显子典型的7种突变设计共同的下游引物为延伸 阻滞引物；序列信息如下

延伸阻滞引物(38nt)：

（2）模板的准备

提取被测样本的KRAS基因组DNA；另制取野生型基因组DNA（作为野 生型模板）；

（3）实时荧光PCR

针对步骤（1）中的7种特异性引物，建立被测样本、野生型模板的反应 体系；

被测样本的每个反应体系中均加入被测样本的KRAS基因组DNA、特异 性引物和延伸阻滞引物；野生型模板的每个反应体系中均加入野生型基因组 DNA、特异性引物和延伸阻滞引物；

将配制好的各反应体系在荧光实时定量PCR仪上进行扩增，观察比较特 异性引物对应的被测样本、野生型模板的反应体系的扩增曲线，判断被测样 本中是否发生了KRAS突变。

上述所有反应体系中还均加有UNG酶(尿嘧啶-N-糖基化酶)和2×SYBR  Green Mastermix。UNG酶可用于消除PCR污染，2×SYBR Green Mastermix 是商品化的酶混合体系，属于PCR常用的试剂。

上述反应体系可以有两种模式：

a、针对每一种特异性引物，均分别建立被测样本、野生型模板的反应体 系；按照该模式，不仅能够判断被测样本中是否发生了KRAS突变，还能确定 具体是何种突变。

b、将7种特异性引物分为三类；其中，G12S、G12R、G12C为一类， G12A、G12D、G12V为一类，G13D为一类；针对这三类特异性引物，均分 别建立被测样本、野生型模板的反应体系。

以每个反应体系的总量20μl计，若采用上述a模式，则加入特异性引物 200nM-500nM、延伸阻滞引物200nM-500nM，UNG酶(尿嘧啶-N-糖基化 酶)0.2U，2×SYBR Green Mastermix10μl，ddH2O补足体积20μl；

以每个反应体系的总量20μl计，若采用上述b模式，则：将G12S、G12R、 G12C上游引物按200nM:200nM:300nM比例混合，再加入所述延伸阻滞引物 300nM构成混合引物体系；将G12A、G12D、G12V上游引物按 200nM:200nM:300nM比例混合，再加入所述延伸阻滞引物300nM构成混合引 物体系；G13D上游引物200nM-500nM与延伸阻滞引物300nM构成单独的 引物体系；这三类引物体系也均加入有UNG酶(尿嘧啶-N-糖基化酶)0.2U， 2×SYBR Green Mastermix10μl，ddH2O补足体积20μl；

上述扩增过程的最佳扩增参数为：50℃，2~5min；95℃，12~15min； 95℃，8~10sec；60℃，8~10sec；65℃，8~10sec；50~55个循环。

下面以制备的7种突变型KRAS基因克隆质粒（作为样本），按照本发明 的突变检测方法，进行实验说明，以体现本发明的技术效果。

将野生型KRAS基因克隆质粒（野生型模板）及7种突变型KRAS基因克 隆质粒（突变型模板）进行提取，并使用Nanodrop核酸定量仪定量，并将所 有质粒模板使用TE缓冲液进行稀释，至浓度为0.00001ng/μl。取部分稀释好 的野生型KRAS基因克隆质粒和7种突变型KRAS基因克隆质粒，分别按照一 定梯度比例混合制备得到混合型模板（该梯度比例将直接体现最终的检测灵 敏度），具体可将稀释好的7种突变型质量与野生型质粒按1:1(50%)， 1:9(10%)，1:19(5%)，1:99(1%)混合制备混合型模板；扩增体系为20μl。

若采用a模式，每反应体系中均加入特异性引物和延伸阻滞引物 200nM-500nM，UNG酶(尿嘧啶-N-糖基化酶)0.2U，2×SYBR Green Mastermix 10μl，ddH2O补足体积20μl。每种特异性引物配制多管体系，一管中加入野 生型模板，另一管中加入相应的突变型模板；另外四管分别加入各混合型模 板（四种比例梯度）。

若采用b模式，则将G12S、G12R、G12C引物按200nM:200nM:300nM 比例混合，再加入延伸阻滞引物300nM制备混合引物体系，分为三组；第一 组加入G12S突变型模板和野生型模板以及1:1(50%)，1:9(10%)，1:99(1%)混 合型模板，第二组与第三组分别加入G12R与G12C系列模板；G12A、G12D、 G12V混合引物配制及加样同上所述。

将配制好的体系在荧光实时定量PCR仪上进行扩增。扩增参数为:50℃， 2~5min；95℃，12~15min；95℃，8~10sec；60℃，8~10sec；65℃，8~10sec； 50~55个循环；观察扩增曲线。结果如图3所示。

请参阅图3所示，使用上述反应体系，可以保证7种突变型模板的顺利 扩增，同时抑制野生型模板的扩增，与理论结果完全符合。图中每一条线代 表一个反应，呈现明显“S”型的曲线对应的反应体系中加入的是各突变型模 板，而未呈“S”型的曲线对应的反应体系中加入的是野生型模板(WT)；

请参阅图4所示，以G12S突变型和G12V突变型为例，在使用上述反应 体系，混合型突变模板均有扩增，检测的灵敏度均可以达到1%。图中每一条 线代表一个反应，呈现明显“S”型的曲线对应的反应体系中加入的是突变型 模板和混合型模板，而未呈“S”型的曲线对应的反应体系中加入的是野生型 模板(WT)；

请参阅图5所示，将G12S/R/C突变特异性引物按比例混合（b模式）后， 使用上述反应体系，突变型模板依然可以顺利扩增，同时在保持1%的检测灵 敏度情况下达到在一管中对3种突变型进行检测的目的；G12A/D/V突变特异 性引物按比例混合后，使用上述反应体系得到类似结果。图中每一条线代表 一个反应，呈现明显“S”型的曲线对应的反应体系中加入的是突变型模板和 各混合型模板，而未呈“S”型的曲线对应的反应体系中加入的是野生型模板 (WT)。

以上实施例不应视为对本发明保护范围的限制，本发明在模板的准备和 实时荧光PCR的环节确定了最佳的实施方式和参数，但本领域技术人员基于 本发明技术思想和设计的引物体系，按照常规的操作方式（如试剂、配比、 扩增过程参数等）足以准确地检测KRAS突变，较之于现有技术有显著进步。