血管活性肠肽1型受体的高亲和力结合多肽及其应用

摘要

本发明涉生物技术领域，特别涉及血管活性肠肽1型受体的结合多肽，血管活性肠肽1型受体的高亲和力结合多肽，所述高亲和力结合多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述的高亲和力结合多肽在制备血管活性肠肽或血管活性肠肽类似物的竞争性抑制剂中的应用；所述高亲和力结合多肽与阳性克隆竞争结合的IC

说明书

技术领域

本发明涉生物技术领域，特别涉及血管活性肠肽1型受体的高亲和力结合 多肽。

背景技术

血管活性肠肽受体(vasoactive intestinal peptide receptor，VIPR)属于七次 跨膜G蛋白偶联受体家族，整个受体包括3个部分：N-末端胞外域，含一个疏 水的N端信号肽以及VIP结合位点；跨膜域，含七个疏水的跨膜片段；C-末端 胞浆域，与信号转导相关。目前发现血管活性肠肽受体有VPAC1(血管活性肠 肽1型受体)、VPAC2和PAC1三种亚型，在人体组织中，内源性VIP主要通 过与VPAC1和VPAC2两种受体亚型结合发挥生物效应，并且VIP能够诱导 VPAC1的内化和核定位，通过信号转导调节肿瘤相关因子VEGF和EGFR等基 因的表达，从而促进肿瘤生长进展。研究证实，VPAC1在结直肠癌等多种肿瘤 细胞及其转移灶中呈高水平表达，而VPAC2仅表达于良性平滑肌瘤等少数肿 瘤，并且VPAC1与天然配体VIP的结合亲和力是VPAC2的20倍。

目前全球结直肠癌(colorectal cancer，CRC)的发病率和死亡率呈持续上 升趋势，已成为严重危害人类健康的疾病之一，针对CRC的分子核医学显像对 于CRC的早期诊断和治疗具有重要意义。由于肿瘤细胞VPAC1最大结合位点 是正常组织的22.5～57.9倍，同时正常胃肠道比其它组织器官具有相对较低水平 的VPAC1表达，使得VPAC1成为一潜在的CRC分子影像诊断和靶向治疗的 理想靶标。但目前结直肠癌VIPR分子显像常用的分子探针主要为VIP或VIP 类似物，缺乏对VPAC1的高选择性，同时存在一定的促肿瘤增殖的风险。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种多肽，其和血管活性肠肽1型受体有高亲 和力。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

血管活性肠肽1型受体的高亲和力结合多肽，所述高亲和力结合多肽的氨 基酸序列如SEQ ID NO：1所示，即“GFRFGALHEYNS”，氨基酸大写字母简写的 对照表，参照实施例。对上述物质进行了高效液相色谱和质谱分析，确定了该 高亲和力结合多肽，该高亲和力结合多肽为如图8所示的高亲和力多肽。

进一步，所述高亲和力结合多肽在N-末端引入Gly-(D)-Ala-Gly-Gly-Aba 进行修饰。其中，(D)指第二位的Ala为右旋丙氨酸。

进一步，所述高亲和力结合多肽用^99mTc标记。其标记率为(95.86±0.83) ％，比活度为(38.62±0.32)TBq/mmol。

本发明的另一目的在于提供所述多肽的新两种应用，血管活性肠肽1型受 体的含量提供了新的思路。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

所述的高亲和力结合多肽在制备血管活性肠肽或血管活性肠肽类似物的竞 争性抑制剂中的应用。通过血管活性肠肽1型受体的高亲和力结合多肽与噬菌 体克隆竞争抑制ELISA实验证实，其抑制率高。

进一步，所述的高亲和力结合多肽在制备结直肠癌体外诊断试剂中的应用。 通过^99mTc标记多肽在动物体内分布及荷瘤动物显像证实，该标记多肽能够像 其它多种结直肠癌分子显像剂一样灵敏探测结直肠癌，并且体内动力学及稳定 性更优。

所述的高亲和力结合多肽在制备造影剂中的应用。

本发明的有益效果在于：所述高亲和力结合多肽与阳性克隆竞争结合的 IC₅₀约为0.0132μmol/L，而天然配体VIP与阳性克隆竞争结合的IC₅₀约为2.7327 μmol/L，表明高亲和力结合多肽具有比VIP更高的亲和力。所述高亲和力结合 多肽用^99mTc标记。所述高亲和力结合多肽用^99mTc标记，其标记率为95.86± 0.83)％，比活度为(38.62±0.32)TBq/mmol。

附图说明

图1为逆转录PCR结果图。

图2为免疫荧光结果图。

图3为噬菌体回收滴度曲线图，其中Mp代表膜结合，INp代表细胞内化 部分，CHO-K1代表阴性细胞结合部分。

图4为噬菌体克隆与阳性细胞结合的ELISA分析图，每个克隆的左侧柱柱 代表阳性细胞CHO-K1/VPAC1，第二条柱右侧柱代表阴性细胞CHO-K1细胞， 星号代表p＜0.05。

图5为多肽VP1与阳性噬菌体克隆的竞争结合分析图。

图6为阳性克隆与VIP竞争结合分析图。

图7为所述高亲和力结合多肽高效液相色谱纯化图。

图8为所述高亲和力结合多肽的质谱鉴定图。

图9为修饰后的所述高亲和力结合多肽高效液相色谱纯化图。

图10为修饰后的所述高亲和力结合多肽的质谱鉴定图。

图11为被^99mTc标记后的所述高亲和力结合多肽在正常动物体内分布图， 其中，图示说明：各器官柱图从左至右依次代表1、5、10、30、60、120、240min 测得的放射性计数。

图12为被^99mTc标记后的所述高亲和力结合多肽在正常动物体内分布显像 图，图像中各主要器官已由箭头标示出。

图13为被^99mTc标记后的所述高亲和力结合多肽在荷瘤动物显像图，图中 箭头示肿瘤影像，从左至右依次为0.5、1、2、4、6小时影像

图14为被^99mTc标记后的所述高亲和力结合多肽在荷瘤动物体内竞争结合 显像影像。

具体实施方式

主要材料与试剂：噬菌体随机十二肽库试剂盒(包括噬菌体随机十二肽库， 肽库滴度2×10¹³pfu/ml，复杂度2.8×10⁹，E.coliER2738宿主菌以及-96gIII测 序引物)购自New England Biolabs公司；中国仓鼠卵巢细胞亚株CHO-K1购自 中科院上海细胞库；G418购自Invitrogen；抗VPAC1单克隆抗体购自Santa Cruz  Biotechnology；PrimeScript RT reagent Kit试剂盒购自TaKaRa；FITC标记山羊 抗兔IgG购自中杉金桥；HRP-抗M13单克隆抗体购自GE Healthcare；细胞培 养基及胎牛血清购自Hyclone。

实施例1血管活性肠肽1型受体的高亲和力结合多肽筛选

一、构建稳定表达VPAC1的CHO-K1细胞

1方法

用体积分数为10％胎牛血清的DMEM高糖培养基将CHO-K1细胞置37℃， 5％CO₂孵箱常规培养，待细胞生长融合至85％左右时，传代接种96孔板，次 日，加不同浓度梯度的G418筛选(详见百度文库)培养基，观察两周，确定 G418最佳筛选浓度为700μg/ml。

将真核重组表达质粒载体pcDNA3.1(+)/VPAC1进行酶切线性化，回收纯 化，按转染试剂盒说明转染CHO-K1细胞(24孔板，2×10⁵/孔)，加入体积分 数10％胎牛血清DMEM高糖培养基置37℃，5％CO2孵箱培养。转染第三天在 培养基中加入700μg/ml G418筛选一周，每3天更换一次培养液，一周后用胰 酶将单独的细胞群消化收集到新的24孔板培养，继续用700μg/mL的G418筛 选一周，挑选生长良好的细胞克隆继续在200μg/ml G418培养基中维持培养约 一个月。

取挑选出的细胞株扩大培养，按照RNA抽提试剂盒说明提取总RNA，按 TaKaRa PrimeScript RT reagent Kit试剂盒说明进行反转录，根据设计的特异性 引物检测目的基因VPAC1的表达(引物正义链：5′cccattgcctgtggtttg 3′，反义 链：5′cctggaaagaccccacgac 3′)。取待测细胞做细胞爬片，固定封闭后，加入兔 抗人VPAC1(Santa Cruz Biotechnology，sc-30019，效价为1∶100)单抗4℃孵育过 夜，次日滴加二抗FITC标记山羊抗兔IgG(中杉金桥，ZF-0311，效价为1∶100)， DAPI衬染核，封片后用激光共聚焦显微镜观察目的蛋白VPAC1表达。

2结果

VPAC1在CHO-K1细胞的稳定表达

1)逆转录PCR结果

挑取稳定生长的细胞克隆，扩大培养，提取总RNA，反转录之后以VPAC1 目的基因设计的特异引物进行PCR(引物正义链：5′cccattgcctgtggtttg 3′，反 义链：5′cctggaaagaccccacgac 3′)，观察阳性细胞能扩增出特异性的目的条带， 表明目的基因VPAC1在CHO-K1细胞有稳定表达(图1)。

2)免疫荧光结果

通过免疫荧光，可以直接观察到目的蛋白VPAC1在阳性细胞表达情况， 图2(A、B)显示在阳性细胞膜膜和胞质内有较强的荧光信号，表明有大量目 的蛋白VPAC1表达，而对照未转染的CHO-K1细胞未检测到目的蛋白的表达 (图2C、D)，说明VPAC1已在转染后的阳性细胞稳定表达。

二、基于噬菌体随机十二肽库的全细胞差减筛选

1方法

培养CHO-K1/VPAC1及CHO-K1细胞生长汇合至85％左右，用体积分数 为1％的BSA的无血清培养基培养1-2小时，PBS洗涤1次，以体积分数为0.25％ 胰酶消化CHO-K1细胞，1000rpm离心去上清后用3mL PBS-BSA重悬封闭15 分钟，并计数细胞约1×10⁷，同时取10μl噬菌体十二肽库(滴度约2.0×10¹¹pfu) 同样用PBS-BSA封闭15分钟，加入500μl蛋白酶抑制剂于细胞封闭悬液混匀， 于37℃缓慢震荡孵育1.5小时；孵育结束前适时消化阳性CHO-K1/VPAC1细胞 并用同样条件封闭，计数阳性细胞约10⁶-10⁷，将上述阴性细胞孵育液1500rpm 离心2分钟；上清加入已封闭好的阳性CHO-K1/VPAC1细胞，4℃缓慢震荡孵 育1小时，1500rpm离心2分钟，细胞沉淀用2ml体积分数为0.1％TBST洗 涤2次，3分钟/次，最后用PBS-BSA洗涤1次去除TBST；细胞结合的噬菌体 用2.0ml酸洗脱缓冲液(0.2mol/L Glycine-HCl，pH 2.2，1.0mg/mlBSA)冰上 洗脱8分钟，立即用300μl中和缓冲液(1.0mol/L Tris-HCl，PH9.1)中和， 1500rpm离心2min，小心收集上清中和洗脱液并准确计量；细胞沉淀用细胞 裂解缓冲液(0.1％Triton 2.0ml，500μl蛋白酶抑制剂)室温裂解细胞30分钟， 并准确计量细胞裂解液体积，收集内化进入细胞的噬菌体；分别取10μl中和 洗脱液及细胞裂解液测滴度，剩余用作扩增，测滴度(结果详见表1)，分别取 1.0×10¹¹pfu的中和及裂解扩增噬菌体共同混合投入到下一轮筛选，重复进行四 轮筛选，TBST浓度逐轮增加至0.5％，洗涤时间增至5分钟/次，洗涤次数增至 7次，阴性细胞孵育时间逐轮增至2小时，阳性细胞孵育时间逐轮减至30分钟， 其余条件同第一轮筛选。各轮筛选得到的回收噬菌体及扩增液均铺制 LB/IPTG/X-gal平板利用蓝斑形成实验测定滴度，并计算每轮回收率。经过第四 轮筛选后，将回收得到的细胞结合及内化的噬菌体稀释合适的滴度铺制 LB/IPTG/X-gal平板，37℃培养过夜后，分别随机挑取20个分隔良好的蓝斑， 扩增纯化，加入50％甘油保存于-20℃，待后续测序及相关鉴定用。

2结果

以实施例1制备的稳定表达VPAC1的CHO-K1细胞为靶细胞，未转染的 CHO-K1细胞作为吸附细胞，共进行四轮全细胞差减筛选，每轮保持投入的噬 菌体量相同。经过四轮筛选可见回收噬菌体滴度及回收率有明显增加，细胞结 合及内化噬菌体均得到显著的富集，而吸附细胞CHO-K1所结合噬菌体保持低 水平滴度并有所下降(表1和图3)。从表1亦可看出，随着筛选轮次增加，阳 性细胞结合噬菌体回收率从第一轮2.978×10^-6增加到第四轮1.538×10^-3，增加 了约516.5倍，回收噬菌体得到了明显富集。

表1各轮噬菌体回收滴度及回收率

三、噬菌体克隆DNA提取及测序

1方法

按噬菌体单链DNA提取试剂盒操作说明扩增噬菌体克隆及提取纯化DNA， 用-96gIII测序引物5’-ccc tca tag tta gcg taa cg-3’送华大基因进行全自动测序分 析，根据DNA序列推导相应的氨基酸序列并进行同源性分析。

2噬菌体DNA测序分析结果

经第四轮全细胞差减筛选结束后，随机挑取40个分隔良好的蓝色噬菌斑， 其中膜结合和细胞内化各取20个，分别将其命名编号为Mp1-20和INp21-40， 扩增提取DNA并测序，明确插入外源基因序列，推导出相应氨基酸序列。由 表2可见，40个噬菌体克隆经过测序，将相同序列归类后，一共得到15条不 同的多肽序列，分别将多肽命名为VP1-VP15，其中VP1在全部克隆中重复次 数最多，后续将对这15个克隆进一步分析。上述15条多肽可通过化学方法合 成。

表240个克隆测序及氨基酸同源分析表

氨基酸缩写简称：

谷氨酰胺gln Q；甘氨酸gly G；丝氨酸ser S；丙氨酸ala A；苏氨酸thr T； 缬氨酸val V；异亮氨酸ile I；亮氨酸leu L；酪氨酸tyr Y；苯丙氨酸phe F； 组氨酸his H；脯氨酸pro P；天冬酰胺asn N；甲硫氨酸met M；谷氨酸glu E； 色氨酸trp W；赖氨酸lys K；半胱氨酸cys C；精氨酸arg R；天冬氨酸Asp D

四、ELISA初步鉴定阳性克隆

分别接种CHO-K1/VPAC1(实施例1制备的稳定表达VPAC1的CHO-K1 细胞)、CHO-K1细胞于96孔板中，1.0×10⁵个/孔，培养至细胞贴壁长满单层， 吸净培养液，PBS洗涤2遍，用50μl体积分数为0.25％戊二醛固定15分钟， PBS洗涤3次，加入体积分数为3％过氧化氢100μl/孔37℃孵育30min，阻断 内源性过氧化物酶活性；PBS洗涤3次，加入200μl/孔1％BSA(体积分数) 封闭30分钟，将需鉴定的噬菌体克隆分别取100μl加入到阳性和阴性细胞孔， 37℃孵育2小时，0.05％PBST洗涤5min×3次，加HRP-抗M13单克隆抗体 (1∶5000体积稀释)37℃孵育1h，0.05％PBST洗涤5min×3次；加入TMB显 色30分钟，浓度为2M硫酸终止反应，测定OD_450nm，同时设置无关噬菌体及 空白对照，每个克隆设置两个复孔，独立重复测定3次，计算平均OD值及结 合特异性(Selectivity)，Selectivity的计算公式为：OD_S1-OD_C1/OD_S2-OD_C2，其 中OD_S1和OD_C1分别代表待测噬菌体克隆和无关噬菌体加入阳性 CHO-K1/VPAC1细胞所得OD值，OD_S2和OD_C2分别代表待测噬菌体克隆和无 关噬菌体加入阴性CHO-K1细胞所得OD_450nm值。结果如表3所示，各个克隆 的阳性细胞和阴性细胞结合OD平均值，以及无关噬菌体加入阳性细胞和阴性 细胞的平均OD值，最后按公式计算得到的Selectivity值，图4为表3数据的 分析图。其中，阳性细胞OD值表示各待测噬菌体克隆与CHO-K1/VPAC1细胞 结合所得到的OD_450nm值；阴性细胞OD值表示各待测噬菌体克隆与CHO-K1细 胞结合所得到的OD_450nm值；无关噬菌体阳性细胞OD表示无关噬菌体为随机从 噬菌体肽库中挑取的某个克隆，代表无关噬菌体克隆与CHO-K1/VPAC1细胞结 合所得到的OD_450nm值；无关噬菌体阴性细胞OD表示无关噬菌体克隆与CHO-K1 细胞结合所得到的OD_450nm值；Selectivity指细胞选择性结合力，其表示待测噬 菌体克隆在阳性CHO-K1/VPAC1细胞和阴性CHO-K1细胞间差异结合的大小， 越大表明克隆与阳性细胞结合能力越强而与阴性细胞结合力较弱。

对得到的15个噬菌体克隆用全细胞ELISA测定其与阳性细胞的结合能力， 进一步的排除假阳性克隆和与细胞结合差异不明显的克隆。从图4可以看出， 除VP8、VP9、VP15号及对照在两种细胞OD值无明显差异外，其余克隆在阳 性细胞和阴性细胞间结合OD值均有差异性，并且通过结合特异性公式计算得 到Selectivity大于2.0的克隆有VP1、VP2、VP3、VP6、VP12、VP13、VP14 号，可以认为这部分克隆在两种细胞间有差异性结合，其中1号克隆结合特异 性最大达到4.85，因此挑选1号克隆作为进一步重点鉴定的克隆。

表3各克隆加入阳性及阴性细胞的平均OD值及Selectivity

实施例2血管活性肠肽1型受体的高亲和力结合多肽的合成与鉴定

本实施例中，涉及到的英文参数，为分析化学领域技术人员公知，可参照 张玉奎主编的《分析化学手册(六)液相色谱分析》，或《分析化学手册(第二 版)第九分册质谱分析》。另，TFA指三氟乙酸，Acetonitrile指乙腈，HCOOH 指甲酸；所涉及的流动相的浓度为体积浓度。

一多肽固相合成

多肽由上海强耀生物科技有限公司采用固相法合成，经HPLC纯化，经质 谱确认。

二高效液相色谱分析所述高亲和力结合多肽

1色谱条件如下：

Measurement：Peak Area；

Run Time：10min；

Calculation Type：Percent；

Wavelength：220nm；

Flow rate：1ml/min；

Inj.Vol：10μL；

Buffer A：0.1％TFA in water；

Buffer B：0.1％TFA in Acetonitrile；

Column：Kromasil 100-5C18，4.6mmX250mm，5micron；

Gradient(1inear)：10％-50％ buffer B in 10min；

2结果

结果详见图7，和下表：

通过HPLC结果可以看出，在图中出现单一峰，保留时间约8.194min，表 明仅含比较单一的一种物质，并进一步后续的质谱分析验证。

三质谱分析所述高亲和力结合多肽

质谱分析条件如下：

Expected MS：1397.52；

Flow rate：0.2ml/min；

Run Time：1min；

Buffer A：0.1％HCOOH in water；

Buffer B：0.1％HCOOH in Acetonitrile。

结果详见图8，将HPLC中单一峰成分进行质谱分析，发现也只有单一峰存 在，表明上述组分仅含单一的成分，是多肽合成后经分离纯化得到纯度较高的 合成多肽。

四修饰所述高亲和力结合多肽

所述高亲和力结合多肽在N-末端引入Gly(D)-Ala-Gly-Gly-Aba进行修饰， 由上海强耀生物科技有限公司采用固相法合成。

五修饰后的所述高亲和力结合多肽的高效液相色谱分析

高效液相色谱分析条件如下：

Measurement：Peak Area；

Run Time：13min；

Calculation Type：Percent；

Wavelength：220nm；

Flow rate：1ml/min；

Inj.Vol：10uL；

Buffer A：0.1％TFA in water；

Buffer B：0.1％ TFA in Acetonitrile；

Column：Kromasil 100-5C18，4.6mmX250mm，5micron；

Gradient(linear)：10％-50％buffer B in 13min。

分析结果如下：

通过HPLC结果或图9可以看出，在图中出现单一峰，保留时间约8.209 min，表明仅含比较单一的一种物质，并进一步后续的质谱分析验证。

六修饰后的所述高亲和力结合多肽的质谱分析

质谱分析条件如下：

Expected MS：1723.86；

Flow rate：0.2ml/min；

Run Time：1min；

Buffer A：0.1％ HCOOH in water；

Buffer B：0.1％ HCOOH in Acetonitrile。

结果详见图10，将HPLC中单一峰成分进行质谱分析，发现也只有单一峰存 在，表明上述组分仅含单一的成分，是修饰后的所述高亲和力结合多肽经分离 纯化得到纯度较高的合成多肽。

实施例3血管活性肠肽1型受体的高亲和力结合多肽在制备血管活性肠肽 或血管活性肠肽类似物的竞争性抑制剂中的应用

一血管活性肠肽1型受体的高亲和力结合多肽(简称目标多肽)与噬菌体 克隆竞争抑制ELISA

接种CHO-K1/VPAC1细胞于96孔板，1.0×10⁵个/孔，培养至细胞贴壁长 满单层，去掉培养液，PBS洗涤2次，体积浓度为0.25％戊二醛固定15分钟， PBS洗涤3次，加入体积浓度为3％过氧化氢100μl/孔37℃孵育30分钟，PBS 洗涤3次，加入200μl/孔1％BSA封闭30min；其后加入不同浓度梯度的合成 目标多肽0、0.0001μg/ml、0.001μg/ml、0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、10 μg/ml、100μg/ml于各对应孔，再加入约1×10¹⁰pfu的含相同插入多肽序列的 噬菌体克隆37℃孵育2h，0.05％PBST洗涤5min×3次；加HRP-抗M13单克 隆抗体(1∶5000稀释)37℃孵育1h，0.05％PBST洗涤5min×3次；加入TMB 显色30min，2M硫酸终止反应，测定OD_450nm，同时设置无关噬菌体及空白对 照，每个多肽浓度设置两个复孔，独立重复3次实验，观察不同浓度多肽对阳 性噬菌体克隆与细胞结合的抑制情况，抑制率＝(零浓度对照组OD值-实验浓 度组OD值)/零浓度对照组OD值×100％。

结果显示，当用目标多肽VP1(如SEQ ID NO：1所示)与细胞预孵育后， 噬菌体与细胞的结合受到抑制，随着多肽浓度的增加，噬菌体与细胞结合的OD 值逐渐降低，抑制率呈浓度依赖性。当目标多肽浓度超过0.0001μg/ml时，抑 制率有明显的增加，而无关对照多肽(无关噬菌体克隆所表达的相应的外源多 肽)对1号克隆与细胞的结合没有明显抑制作用，IC₅₀为0.0185μg/ml(0.0132 μmol/L)，分析图如图5所示，目标多肽在不同浓度与细胞结合后，测得OD值， 通过抑制率计算公式得到不同浓度的抑制率，详见表4。

表4不同多肽浓度测得的平均OD值及抑制率

二目标多肽与血管活性肠肽1型受体结合特异性分析

接种CHO-K1/VPAC1细胞于96孔板，1.0×10⁵个/孔，培养至细胞贴壁长 满单层，去掉培养液，PBS洗涤2次，体积浓度为0.25％戊二醛固定15分钟， PBS洗涤3次，加入体积浓度为3％过氧化氢100μl/孔37℃孵育30分钟，PBS 洗涤3次，加入200μl/孔1％BSA封闭30min；加入不同浓度梯度的VIP 0、0.001 μg/ml、0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml于各对应孔， 再加入约1×10¹⁰pfu的阳性噬菌体克隆37℃孵育2h，0.05％PBST洗涤5min× 3次；加HRP-抗M13单克隆抗体(1∶5000稀释)37℃孵育1h，0.05％PBST洗 涤5min×3次；加入TMB显色30min，2M硫酸终止反应，测定OD450nm，同 时设置无关噬菌体及空白对照，每个多肽浓度设置两个复孔，独立重复3次实 验，观察不同浓度VIP对阳性噬菌体克隆与细胞结合的抑制情况，抑制率＝(零 浓度对照组OD值-实验浓度组OD值)/零浓度对照组OD值×100％。

结果如图6的分析所示，随着VIP浓度的增加，噬菌体与细胞结合的OD 值逐渐下降，抑制率逐渐增高，呈浓度依赖性，IC50为9.0884μg/ml(2.7327 μmol/l)，结果详见表5。

表5不同VIP多肽浓度测得的平均OD值及抑制率

实施例4所述高亲和力结合多肽在制备结直肠癌体外诊断试剂中的应用

一高亲和力结合多肽用^99mTc标记

1⁹⁹Tc^m标记GAGG-目标多肽

室温下，在2.5ml细胞冻存管中依次加入50mmol/L醋酸铵缓冲液(pH 4.6) 溶解的GAGG-目标多肽10μl(10μg)，200mmol/L HCl溶液(pH 1.0)溶解 的SnCl₂·2H₂O 10μl(17μg)，67mmol/L Na₃PO₄溶液(pH 13～14)150μl，新 鲜淋洗的⁹⁹Tc^mO₄^-100μl(222MBq)，总反应体积约为270μl。充氮密封，室 温震荡30min完成标记，加入1mol/L NaH₂PO₄ 15μl调节标记溶液pH至 7.0～7.2。

2标记物的纸层析

标记混合物经3MM色谱纸层析，流动相为丙酮(展开剂I)和30％氨水 (V)∶乙醇(V)∶水(V)＝1∶2∶5(展开剂II)。分段裁剪层析纸，γ-免疫计数 仪测定各段放射性计数(cpm)。分别按下式计算⁹⁹Tc^m-目标多肽的标记率及比 活度：

标记率(％)＝展开剂I原点放射性计数率-展开剂II原点放射性计数率

3体外稳定性实验

标记溶液室温(25℃)下放置，分别于1、2、4小时进行3MM色谱纸层 析(方法同上)，计算各时相点的放射化学纯度(RCP)。

4半胱氨酸置换实验

取无菌细胞冻存管，分别加入50、100、150、200、400mmol/L半胱氨酸 溶液100μl(磷酸盐缓冲液配制，1.0mol/LNaOH调节pH至7.4)和100μl生 理盐水，本实验为三复管；各管加入磷酸盐缓冲液稀释的⁹⁹Tc^m-TP1326 50μl (7.4MBq)，混匀后37℃水浴箱温育1h；行3MM纸层析，展开剂为丙酮； 分段裁剪层析纸并测定各段放射性计数，按下式计算半胱氨酸对⁹⁹Tc^m的置换 率：

半胱氨酸置换率(％)＝(层析纸前沿段放射性计数/层析纸总放射性计数) ×100％

二结果

1标记率与比活度

⁹⁹Tc^m-目标多肽的标记率为(95.86±0.83)％，比活度为(38.62±0.32) TBq/mmol，表明多肽经过⁹⁹Tc^m标记后能得到较高的标记率和比活度。R_f值详 见表6。

表6标记溶液中各放射性组分的R_f值

2理化性质

标记物室温放置1、2、4h，⁹⁹Tc^m-目标多肽的RCP分别为(97.04±1.43) ％、(94.52±1.82)％、(92.76±2.64)％。标记物与50、100、150、200、400mmol/L 半胱氨酸溶液及生理盐水于37℃温育1h后，未结合⁹⁹Tc^m的计数率分别为(0.65 ±0.05)％、(0.69±0.06)％、(0.77±0.04)％、(0.89±0.04)％、(0.93±0.01) ％与(2.21±0.05)％，表明多肽⁹⁹Tc^m标记后，在室温放置不同时间后仍能保 持较高的放化纯度，同时不同浓度的半胱氨酸并不能置换出⁹⁹Tc^m，表明标记多 肽能与⁹⁹Tc^m有较高的稳定结合能力，说明标记多肽具有较高的体外稳定性。

实施例5所述高亲和力结合多肽在制备造影剂中的应用

一实验方法

1.建立荷瘤动物模型

收集培养对数生长期的HT-29细胞，用无血清的DMEM培养基洗涤3次 并悬浮，0.1％苔盼蓝染色计数活细胞。无菌条件下，取培养的HT-29细胞(10⁷) 接种于雄性裸鼠(20～25g)右前肢腋下，待肿瘤长至直径1cm时，用于体内 分布实验与显像研究。

2.正常动物体内分布实验

取健康昆明小鼠40只，随机表法分为8组，每组5只。准确抽取 ^99mTc-G(D)AGG-目标肽0.2ml(18.5MBq)，经尾静脉注入，分别于注射后1、 5、10、30、60、120与240min将小鼠断头处死，收集血液及心、肺、肝、肠、 肾、肌肉和脑等组织器官，称重并测定放射性。结果经参考源校正后，换算为 每克组织百分注射剂量(％ID/g)。

3.正常动物显像实验

仪器为Symbia T6 SPECT/CT，探头配备低能高分辨准直器，能峰140KeV， 窗宽20％，矩阵128×128，放大系数(Zoom)1。分别取健康雄性日本大耳兔 2只，仰卧固定于木制实验台上，探头视野中心对准兔胸腹部。经耳缘静脉注 射^99mTc-G(D)AGG-目标74MBq，以1帧/min动态采集60min，并于90、120、 150、180与240min各预置计时1min采集1帧。利用ROI技术，分析动态显 像心、脑、肾、肝、肠、肺、膀胱、肌肉等组织器官放射性经衰减校正后的时 间-放射性曲线，并定性观察家兔体内组织器官放射性的动态分布变化，为进一 步应用判断异常影像提供参考。

4.荷瘤动物显像研究

仪器为Symbia T6 SPECT/CT，探头配备针孔准直器，能峰140KeV，窗宽 20％，矩阵128×128，放大系数(Zoom)1，经荷瘤裸鼠尾静脉注射 ^99mTc-G(D)AGG-目标肽剂量为18.5MBq，以1帧/min动态采集60min，于0.5、 1、2、4、6小时采集图像。利用ROI技术测定各时相肿瘤组织及其对侧软组织 影像的放射性，并计算T/NT比值，评价^99mTc-G(D)AGG-目标肽探测和诊断结 直肠癌的可行性。

5.荷瘤动物体内竞争结合显像研究

在注射的^99mTc-G(D)AGG-目标肽溶液中分别加入不同剂量(0、50、100、 500μg)的非标记G(D)AGG-目标肽，其余操作同上。通过计算T/NT比值，进 一步验证^99mTc-G(D)AGG-目标肽与肿瘤组织的结合经VPAC1介导，即属于特 异性结合。

二实验结果

1.正常动物体内分布实验

实验结果如图11所示，显示了该标记多肽在正常动物各组织器官的分布情 况，血液中的放射性清除较快，在10分钟左右即基本完全消退，表明标记多肽 体内血液清除较快。肝脏、肾脏和肠道放射性相对较高，表明该多肽主要通过 肝脏和泌尿系统排泄，而脑、肌肉和骨骼放射性持续较低，说明该多肽不能有 效的通过血脑屏障，以及确保后续显像较低的肌肉组织本底。

2.正常动物显像实验

正常动物显像结果如图12显示的，基本与上述体内分布实验结果相一致， 即肝脏和肾脏的放射性一过性升高后，随时间逐渐下降，而胆囊、肠道和膀胱 影逐渐增强，表明标记多肽主要经过肝肾排泄，软组织本底及脑均未见明显影。

3.荷瘤动物显像研究

结果如图13显示：通过荷瘤动物显像可以清晰的看到在裸鼠右前肢腋下肿 瘤部位明显的放射性浓聚，在注射后的0.5、1、2、4、6小时采集图像，计算 T/NT比值分别为3.96、4.78、4.55、4.05和4.19。

4.荷瘤动物体内竞争结合显像研究

现象结果如图14显示。当同时注射不同浓度梯度的非标记多肽时，可以看 到肿瘤影像逐渐变淡，同样计算T/NT比值分别为3.76、2.99和2.10，抑制率 分别为21.3％、37.4％和56.1％，表明^99mTc-G(D)AGG-目标肽与肿瘤组织的 结合经VPAC1介导，即属于特异性结合。

下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发 明，而非限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的方法及未说明配 方的试剂均为按照常规条件进行或配置，未注明来源的产品均可通过市场途径 获得。