用于从经遗传修饰的聚羟基链烷酸酯生物质制备单体组分的方法

摘要

本申请涉及从经遗传修饰的聚羟基链烷酸酯(PHA)生物质生产单体组分的方法方法，其中在有催化剂存在下加热所述生物质以从所述PHA释放出单体组分。

说明书

背景技术

基于生物的、可生物降解的聚合物诸如聚羟基链烷酸酯(PHA)在 生物质系统中天然地生成，诸如植物生物质、微生物生物质(例如，包 括蓝细菌在内的细菌、酵母、真菌)或藻类生物质。最近已经开发了遗 传地修饰的生物质系统，所述系统生产多种可生物降解的PHA聚合物 和共聚物(Lee(1996)，Biotechnology & Bioengineering 49：1-14；Braunegg 等人(1998)，J.Biotechnology 65：127-161；Madison，L.L.和Huisman，G.W. (1999)，Metabolic Engineering of Poly-3-Hydroxyalkanoates；From DNA  to Plastic，见：Microbiol.Mol.Biol.Rev.63：21-53)。

最近，还已经在生产“绿色”化学制品(诸如1，3-丙二醇(杜邦的 BioPDO)、1，4-丁二醇(Genomatica)和琥珀酸(Bioamber)，仅举几 个实例)的生物质系统的开发中取得了进展。与基于生物的PHA聚合 物类似地，已经通过遗传地修饰的生物质系统来生产这些基于生物的化 学制品，所述系统利用可再生原料，具有更低的碳足迹，且据报道具有 比传统的石油化学生产方法更低的生产成本。但是，通过生物过程直接 生产化学制品的一个缺点是，所述化学制品对生产它们的细胞经常是有 毒的，所以来自细胞的总化学产率较低。另外，由细胞生产的其它化合 物最终作为杂质存在于目标化学制品中，并因此，需要向所述过程中添 加纯化步骤，这会增加额外的成本因素。因而，需要克服上述的细胞毒 性和纯度的缺点。

发明内容

已经发现，通过在有催化剂存在下热分解含有聚羟基链烷酸酯 (PHA)的经遗传工程化的生物质，可以简单地且节省成本地生产基于 生物的化学制品(单体组分和衍生物)。可以遗传工程化宿主，以在它 们的细胞中生产富集量的聚羟基链烷酸酯和组合物。由于可得到的PHA 聚合物的种类，容易地且廉价地生产广范围的有用的且重要的化学制 品，同时克服了细胞毒性和纯度的问题。在节省成本和时间的条件下， 将生物质中的PHA聚合物降解成单体组分和其它改性的化学制品(例 如，衍生物)。

本发明一般地涉及从可再生的碳资源生产高纯度的、高产率的、基 于生物的单体组分的方法。该生物精制方法的优点是，它使用可再生的 碳源作为原料，所述经遗传工程化的宿主以高产率生产PHA，对宿主细 胞没有不利的毒性效应(这会限制过程效率)，且当与催化剂相混合并 加热时，能够以高产率生产高纯度的基于生物的单体组分和它们的衍生 物。

在某些实施方案中，本发明涉及从经遗传修饰的聚羟基链烷酸酯 (PHA)生物质生产单体组分的方法，所述方法包括：在有催化剂存在 下，加热所述生物质，以从PHA释放出单体组分，其中基于1克单体/ 克聚羟基链烷酸酯，所述单体组分产率是约70％。

在某些实施方案中，所述聚羟基链烷酸酯是选自下述的一种或多 种：聚乙醇酸交酯、聚-3-羟基丙酸酯、聚-3-羟基丁酸酯、聚-4-羟基丁 酸酯、聚-5-羟基戊酸酯或它们的共聚物。在有些实施方案中，所述单体 组分是：乙交酯、3-羟基丙内酯、丙烯酸、巴豆酸、5-羟基戊内酯或它 们中的任意2种或更多种的混合物。在有些实施方案中，所述单体组分 含有小于10重量％的副产物。在某些实施方案中，所述生物质是来自选 自下述的重组宿主：植物作物、细菌、酵母、真菌、藻类、蓝细菌或它 们中的任意2种或更多种的混合物。在某些实施方案中，所述宿主是细 菌。在有些实施方案中，所述细菌选自：大肠杆菌、真养产碱菌 (Alcaligenes eutrophus，重命名为真养产碱杆菌(Ralstonia eutropha))、 芽孢杆菌属(Bacillus spp.)、广泛产碱菌(Alcaligenes latus)、固氮菌 属(Azotobacter)、气单胞菌属(Aeromonas)、丛毛平胞菌属(Comamonas)、 假单胞菌(Pseudomonads)、假单胞菌属(Pseudomonas)、罗尔斯通 氏菌属(Ralstonia)、克雷伯菌属(Klebsiella)、聚球藻属(Synechococcus  sp.)PCC7002、聚球藻属PCC 7942、集胞藻属(Synechocystis sp.)PCC 6803和嗜热蓝细菌聚球藻(Thermosynechococcus elongatus)BP-I、微温 绿硫菌(Chlorobium tepidum)、Chloroflexus auranticus、微温着色菌 (Chromatium tepidum)、酒色着色菌(Chromatium vinosum)、深红红 螺菌(Rhodospirillum rubrum)、荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus) 和沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)。在其它实施方案中， 所述宿主是植物作物。在有些实施方案中，所述植物作物选自：烟草、 甘蔗、谷物、柳枝稷、miscanthus sorghum、高梁(sweet sorghum)或它 们中的任意2种或更多种的混合物。在其它实施方案中，所述宿主是选 自下述的重组藻类：微小小球藻(Chlorella minutissima)、浮水小球藻 (Chlorella emersonii)、富油小球藻(Chlorella sorokiniana)、椭圆形 小球藻(Chlorella ellipsoidea)、小球藻属(Chlorella sp.)或原始小球 藻(Chlorella protothecoides)。在某些实施方案中，所述经遗传修饰的 生物质具有与野生型生物体相比增加的PHA生产量。

在本文所述方法的某些实施方案中，加热包括：热解、焙烧或闪热 解。在有些实施方案中，所述加热是在约200℃至约350℃的温度。在 其它实施方案中，在加热之前，干燥所述生物质。在其它实施方案中， 所述干燥是在100℃至175℃的温度。在某些实施方案中，所述经干燥 的生物质具有5重量％或更低的水含量。在某些实施方案中，所述加热 进行约1分钟至约30分钟，或1约分钟至约2分钟。

在某些实施方案中，所述方法另外包括：回收单体组分，例如冷凝 或其它回收方法。

在其它实施方案中，所述催化剂是金属催化剂或有机催化剂。在有 些实施方案中，所述催化剂按重量计算是4％至15％。

在另一个方面，本发明的方法包括：干燥包含PHA的生物质(例 如，经遗传工程化的生物质)，在200-350℃加热经干燥的生物质，以 生产单体组分，然后通过直接氢化、酯化和/或酰胺化来修饰单体产物， 以生成对应的二醇、羟基酯或酰胺。例如，当生物质包含聚-3HB时，可 以将单体组分巴豆酸进一步修饰成其它4碳产物(C4产物，例如，衍生 物)，包括、但不限于：富马酸、丁烯、马来酸酐(MAN)、2-丙烯、 丙烯酸等。同样地，当生物质包含3-羟基丙酸酯(3HP)时，可以将单 体组分β-丙内酯修饰成其它3碳产物(C3产物，例如衍生物)，诸如 丙烯酸、丙烯酸甲酯、丙烯酰胺、丙烯腈、3-羟基丙烯酸乙酯、丙二酸 等。也可以将包含聚5-羟基戊酸酯以生成δ-戊内酯的生物质修饰成其它 5碳(C5)产物(例如，衍生物)。

在有些实施方案中，描述了从经遗传修饰的聚羟基链烷酸酯(PHA) 生物质生产巴豆酸的方法。这些方法包括：在有催化剂存在下加热生物 质，以从PHA中释放出巴豆酸组分，其中基于1克单体/克聚羟基链烷 酸酯，所述单体产率是约70％；使巴豆酸反应，形成巴豆酸低级烷基酯； 和在有第一催化剂存在下，使低级巴豆酸烷基(例如，丁基)酯在合适 的条件下通过交叉复分解与足够量的丙烯反应，以形成丙烯酸低级烷基 酯和低级烯烃(例如，丁烯)。可以在有第二催化剂存在下，从乙烯和 2-丁烯的复分解反应形成丙烯，并连续地去除多余的丙烯。可以在有第 二催化剂存在下，使巴豆酸低级烷基酯进一步反应，以形成醇。

在某些方面，所述第一催化剂是复分解催化剂(例如， Hoveyda-Grubb的交叉复分解催化剂，1，3-双(2，4，6-三甲基苯基)-2-咪唑烷 亚基)二氯(邻异丙氧基苯基亚甲基)钌等)。在其它方面，所述第一催 化剂没有暴露于乙烯。在某些方面，所述第二催化剂是复分解催化剂。

在其它实施方案中，从经遗传修饰的聚羟基链烷酸酯(PHA)生物 质生产巴豆酸的方法包括：在有催化剂存在下，加热该生物质，以从PHA 中释放出巴豆酸组分，其中基于1克单体/克聚羟基链烷酸酯，所述巴豆 酸组分产率是约70％；使巴豆酸反应以形成巴豆酸丁酯，并氢化巴豆酸 丁酯以形成2分子的丁醇。在某些实施方案中，所述方法包括，从经遗 传修饰的聚羟基链烷酸酯(PHA)生物质生产3-羟基丙内酯，这包括： 在有催化剂(例如，碳酸钠或硫酸亚铁七水合物)存在下，加热该生物 质，以从PHA释放出单体组分，其中基于1克单体组分/克聚羟基链烷 酸酯，所述单体组分产率是约70％，并形成丙烯酸。在有些实施方案中， 提供了从经遗传修饰的聚羟基链烷酸酯(PHA)生物质生产巴豆酸的方 法，所述方法包括：在有催化剂存在下，加热该生物质，以从PHA中 释放出巴豆酸组分，其中基于1克单体/克聚羟基链烷酸酯，所述单体产 率是约70％，并将巴豆酸进一步修饰成富马酸、丁烯、马来酸酐(MAN)、 2-丙烯或丙烯酸。

在有些实施方案中，所述催化剂是金属催化剂。在某些实施方案中， 所述催化剂是含有金属离子的氯化物、氧化物、氢氧化物、硝酸盐、磷 酸盐、磺酸盐、碳酸盐或硬脂酸盐化合物，所述金属离子是铝、锑、钡、 铋、镉、钙、铈、铬、钴、铜、镓、铁、镧、铅、锂、镁、钼、镍、钯、 钾、银、钠、锶、锡、钨、钒或锌或它们的混合物。在有些实施方案中， 所述催化剂是下述的有机催化剂：胺、叠氮化物、烯醇、二醇、季铵盐、 酚盐、氰酸盐、硫氰酸盐、二烷基酰胺和烷基硫醇酯或它们的混合物。 在有些实施方案中，所述催化剂是氢氧化钙、硫酸亚铁七水合物或碳酸 钠或它们的混合物。在某些实施方案中，所述催化剂是固定的催化剂床， 该床由被五氧化钒或类似化合物浸透的1/8氧化铝颗粒组成。

在另一个方面，本发明另外涉及使用多串联催化反应方案从PHA 生物质生产丙烯酸的连续的生物精制方法，所述方法包括：培养经遗传 工程化的PHA生物质，以生成聚-3-羟基丁酸酯，热解聚-3羟基丁酸酯 以生成巴豆酸，在有酯交换催化剂存在下使巴豆酸反应以形成巴豆酸低 级烷基酯；和在合适的条件下在有第一复分解催化剂存在下使巴豆酸低 级烷基酯经由交叉复分解与足够量的丙烯反应以形成丙烯酸低级烷基 酯和低级烯烃，其中在有第二复分解催化剂存在下从乙烯和2-丁烯的复 分解反应形成所述丙烯，并连续去除多余的丙烯。

在另一个实施方案中，本发明涉及从经遗传工程化的PHA生物质 生产丙烯酸的连续的生物精制方法，所述方法包括：培养经遗传工程化 的PHA生物质，以生成聚-3-羟基丙酸酯，与催化剂一起加热聚-3-羟基 丙酸酯以生成丙烯酸，和回收丙烯酸。在另一个实施方案中，本发明涉 及从经遗传工程化的PHA生物质生产乙交酯的连续的生物精制方法， 所述方法包括：培养经遗传工程化的PHA生物质，以生成聚乙醇酸交 酯，与催化剂一起加热聚乙醇酸交酯以生成乙交酯单体组分，和回收乙 交酯单体。从经遗传工程化的PHA生物质生产5-羟基戊内酯的连续的 生物精制方法包括：培养经遗传工程化的PHA生物质，以生成聚-5-羟 基戊内酯，与催化剂一起加热聚-5-羟基戊内酯以生成5-羟基戊内酯单 体，和回收5-羟基戊内酯单体。

在所述连续的生物精制方法中，所述培养是连续的，并根据标准的 生产规程连续进行在每个所述实施方案中的其它步骤(例如，加热、反 应等)。

在某些实施方案中，单体组分的回收包括：冷凝单体组分。本文使 用的术语“回收”当应用于单体组分时，是指使它与生物质材料分离，例 如，包括、但不限于通过下述方法进行回收：冷凝，分离方法，诸如使 用膜，气体(例如，蒸汽)相分离，诸如蒸馏等。因而，通过冷凝装置 可以实现回收，所述冷凝装置捕获单体组分蒸汽，将单体组分蒸汽冷凝 成液体形式，并将其转移离开生物质材料。

在另一个方面，提供了一种方法，所述方法包括：在100℃至175 ℃的温度，干燥包含聚-3-羟基丙酸酯的柳枝稷叶子(例如，经遗传工程 化的柳枝稷叶子)，以提供具有5重量％或更低的水含量的干燥的柳枝 稷叶子；加热干燥的柳枝稷叶子到200℃至350℃的温度，持续足以分 解聚-3-羟基丙酸酯和释放丙烯酸并生产残余生物质的时间段；回收丙烯 酸；和烘干残余生物质。在有些实施方案中，所述时间段是1分钟至5 分钟。在其它实施方案中，所述时间段是1分钟至2分钟。在有些实施 方案中，所述回收丙烯酸包括：冷凝丙烯酸。在有些实施方案中，所述 烘干包括：维持残余生物质的温度在200℃至350℃。在某些实施方案 中，所述烘干包括：维持该温度10分钟至30分钟的时间段。在有些实 施方案中，所述方法也包括：在加热之前，将催化剂加入生物质中。在 某些实施方案中，所述催化剂是金属催化剂。

在另一个方面，提供了一种方法，所述方法包括：在100℃至175 ℃的温度，干燥包含聚-3-羟基丁酸酯的烟草叶子(例如，经遗传工程化 的烟草叶子)，以提供具有5重量％或更低的水含量的干燥的烟草叶子； 加热干燥的烟草叶子到200℃至350℃的温度，持续足以分解聚-3-羟基 丁酸酯和释放顺式-和反式-巴豆酸的混合物并生产残余生物质的时间 段；回收顺式-和反式-巴豆酸；和烘干残余生物质。在有些实施方案中， 所述时间段是1分钟至10分钟，或1分钟至5分钟，或1分钟至2分 钟，或这些时间之间的时间段。在有些实施方案中，所述回收顺式-和反 式-巴豆酸包括：冷凝顺式-和反式-巴豆酸。在有些实施方案中，所述烘 干包括：维持残余生物质的温度在200℃至350℃。在某些实施方案中， 所述烘干包括：维持该温度10分钟至30分钟的时间段(或这些时间之 间的时间段)。在有些实施方案中，所述方法也包括：在加热之前，将 催化剂加入生物质中。在某些实施方案中，所述催化剂是金属催化剂。

在另一个方面，提供了一种方法，所述方法包括：处理生物质(例 如，经遗传工程化的生物质)，包括在木质纤维素工艺(lignocellulosic  process)中的PHA，以生成可发酵的糖类；干燥所述生物质，以提供具 有5重量％或更低的水含量的经干燥的生物质；加热所述生物质到200 ℃至350℃的温度，持续足以分解PHA和释放单体组分并生产残余生物 质的时间段；回收回收单体组分，并使用残余生物质作为燃料。在有些 实施方案中，所述方法另外包括：回收可发酵的糖类。在有些实施方案 中，所述方法也包括：在加热之前将催化剂加入生物质中。在某些实施 方案中，所述催化剂是金属催化剂。

已经遗传修饰PHA生物质，以增加PHA的产率超过野生型生物质， 然后处理所述生物质，以生成多用的中间体，所述中间体可以被进一步 加工，以生成希望的商品和专门产品。

在某些实施方案中，所述生物质的生产使用多串联催化反应。来自 PHA生物质的可再生原料用于制备希望的产物(例如，丙烯酸)的用途， 符合绿色技术的原理，没有使用石油原料的缺点。

附图说明

从在附图中图解的本发明的实施例实施方案的下述更具体的描述 会明白前述内容，在所述附图中，同样的参考符号表示在不同的视图中 的相同部分。所述附图不一定按照比例绘制，相反，重点在于图解本发 明的实施方案。

图1是根据不同的实施方案从生物质回收PHA、将残余物转化成固 体燃料的示意图。

图2是根据一个实施方案在350℃热解的烟草+P3HB(10重量％) 的气相色谱图。

图3是根据一个实施方案在350℃热解的烟草+P3HB(10重量％)+ 石灰(5重量％)的气相色谱图。

图4是根据一个实施方案使用复分解催化剂从生物质+P3HB生产基 于生物的丙烯酸的工艺流程图。

图5是根据一个实施方案酯化和氢化巴豆酸的工艺流程图。

图6是根据一个实施方案将巴豆酸氧化成马来酸酐(MAN)的工艺 流程图。

图7是根据一个实施方案在300℃热解的干燥的微生物生物质 +P5HV的气相色谱图。

图8是根据一个实施方案在300℃热解的干燥的微生物生物质 +P5HV+石灰(5重量％)的气相色谱图。

图9是根据一个实施方案在300℃热解的干燥的柳枝稷+P3HP的气 相色谱图。

图10是根据一个实施方案在300℃热解的干燥的柳枝稷 +P3HP+FeSO₄·7H₂O(5重量％)的气相色谱图。

图11是根据一个实施方案在300℃热解的干燥的柳枝稷 +P3HP+Na₂CO₃(5重量％)的气相色谱图。

图12是丙烯自复分解以产生2-丁烯和乙烯的催化循环的示意图。

具体实施方式

下面描述了本发明的实施例实施方案。

一般而言，本发明涉及在受控的条件下从经遗传工程化的聚羟基链 烷酸酯聚合物生物质生产商品和专门化学制品。本文描述了从 含有PHA的生物质获得化学制品的方法。在一个方面，所述生物质已 经被遗传工程化，以生产比在野生型生物质中天然地存在的PHA更高 浓度或量的PHA。已经通过在野生型或经遗传工程化的PHA生产菌株 中导入基因和/或删除基因来遗传修饰所述宿主生物体，从而建立从 廉价原料合成PHA的菌株。在给经遗传工程化的微生物饲喂可再生底 物的发酵过程中，生产PHA生物质。可再生底物包括：从植物作物材 料生产的发酵原料，诸如糖类、植物油、脂肪酸或合成气体。从糖底物 生产的生物质中的PHA水平是大于10％(例如，15％、20％、25％、30％、 35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％)。PHA 的富集允许直接增加起始PHA产物和向单体组分的转化，所述单体组 分用于进一步加工成其它反应产物。在另一个实施方案中，所述生物质 已经被遗传工程化，以生产具有特定单体组分的PHA。在某些方面，这 些单体组分是用于进一步加工成其它反应产物的中间体，或单体组分例 如作为商品化学制品的单体组分。

在另一个方面，提供了一种方法，所述方法用于将在干燥的含有 PHA的生物质(例如，经遗传工程化的生物质)中的PHA转化成单体 组分(诸如内酯、乙交酯和有机酸)，所述单体组分作为商品化学制品 进行回收，并用于其它工艺或反应中。在某些实施方案中，该方法与焙 烧过程集成，通过所述焙烧过程，残余生物质继续被热处理，在挥发性 的化学中间体已经释放以后，提供燃料物质。通过该方法生产的燃料物 质可用于直接燃烧，或经进一步处理以生成热解液体或合成气。总之， 该方法已经增加了下述优点：残余生物质被转化成更高价值的燃料，所 述燃料然后可以用于生产电和蒸汽，以为该过程提供能量，从而消除废 物处理需求。

尽管已知聚羟基链烷酸酯(PHA)在它们的纯形式是热不稳定的， 令人惊讶地发现，当PHA以未纯化形式存在于生物质中时，它们可以 以高产率(例如，约70％、约80％、约85％、约90％、约95％)和令人 惊讶的高纯度(例如，约95％至约100％)转化成小分子化学中间体， 即具有3-6个碳原子的单体组分。通过将生物质加热至预定温度持续短 时间段，可以实现PHA向化学中间体的转化。然后回收单体组分，并 开发它们的价值。但是，大量残余生物质保留在该过程中。本文使用的 术语“残余生物质”表示，在PHA转化成小分子中间体以后剩余的生物 质。然后可以通过焙烧，将残余生物质转化成可使用的燃料，从而减少 来自PHA生产的废物，并从典型的焙烧过程获得额外的有价值的商品 化学制品。如上面所指出的，在足以增浓残余生物质的温度，进行所述 焙烧。

在本发明的技术中，已经发现，当将焙烧温度维持短时间段(例如， 1-5分钟的时间段)时，可以以高产率和纯度收集在生物质内含有的PHA 的单体组分。因而，在有些实施方案中，在干燥生物质以形成经干燥的 生物质以后，将经干燥的生物质加热至约200℃至约350℃的温度持续 短时间段。在有些实施方案中，所述短时间段是1分钟至5分钟。在其 它实施方案中，所述短时间段是1分钟至2分钟，或小于1分钟(例如， 55秒、50秒、45秒、40秒或更短)，或1分钟至4分钟，或2分钟至 5分钟，或3分钟至5分钟，或2分钟至5分钟，或在有些实施方案中， 5分钟至10分钟。所述温度是在约200℃至约350℃的温度，并包括之 间的温度，例如，约205℃、约210℃、约220℃、约230℃、约240℃、 约250℃、约260℃、约270℃、约280℃、约290℃、约300℃、约310 ℃、约320℃、约330℃、约340℃、约345℃以及在这些温度之间的温 度。

这些令人惊讶的发现允许在约200℃至约350℃的温度或之间的温 度暂时分离快速的PHA转化，以生产单体组分，随后在约200℃至约 350℃缓慢焙烧，以生产固体燃料。因而，回收单体组分，并开发它们 的价值，可以将生物质转化成有价值的固体燃料进行回收。

或者，还已经发现，可以首先干燥含有PHA的生物质(例如，经 遗传工程化的生物质)，并在快速的高温闪热解中将PHA转化成 单体组分，并回收单体组分，并对残余生物质进行高温处理，以转化成 固体燃料。所述快速的高温闪热解是在大于500℃(例如，约510℃、 约520℃、约530℃、约540℃、约550℃、约560℃、约570℃、约580 ℃、约590℃、约600℃、约610℃、约620℃、约630℃、约640℃、 约650℃、约660℃、约670℃、约680℃、约690℃、约700℃、约710 ℃、约720℃、约730℃、约740℃、约750℃、约760℃、约770℃、 约780℃、约790℃、约800℃，或大于约800℃)的温度进行，停留时 间足以将生物质的至少一部分分解成热解液体和热解的生物质。在有些 实施方案中，所述停留时间是1秒至15秒，或5秒至20秒。在其它实 施方案中，所述停留时间是1秒至5秒，或小于5秒。可以为每种产物 或单体组分优化温度和时间。来自闪热解过程的其它产物包括其它轻质 气体，它们可以收集和回收，或可以作为燃料进行燃烧，从而为整个过 程提供过程蒸汽和/或热。

在图1中示意地描绘了一种从生物质回收基于PHA的化学中间体 的方法，作为一种非限制性的流程图工艺。图1描述了从生物质回收PHA 的集成系统，并将残余生物质转化成燃料。

根据有些实施方案，PHA是这样的PHA：它们会提供一系列单体 组分，所述单体组分可以容易地、低成本地且节省能量地回收，无需预 先将PHA与生物质分离。合适的PHA材料是通过一种或多种单体组分 的细胞内聚合形成的那些。PHA的合适的单体组分包括、但不限于：3- 羟基丁酸酯、3-羟基丙酸酯、3-羟基戊酸酯、3-羟基己酸酯、3-羟基庚酸 酯、3-羟基辛酸酯、3-羟基壬酸酯、3-羟基癸酸酯、3-羟基十二酸酯、3- 羟基十二烯酸酯、4-羟基丁酸酯、4-羟基戊酸酯、5-羟基戊酸酯和6-羟 基己酸酯。这样的单体组分可以形成同聚物或共聚物。

在有些实施方案中，所述PHA是同聚物。本文使用的术语“同聚物” 表示这样的聚合物：其中在所述聚合物中存在单个单体组分。PHA同聚 物的实例包括、但不限于：聚-3-羟基丙酸酯(聚-3HP)、聚-3-羟基丁酸 酯(聚3-HB)、聚-4-羟基丁酸酯(聚4-HB)、聚5-羟基戊酸酯、聚-6- 羟基己酸酯、聚乳酸和聚乙醇酸。

在其它实施方案中，所述PHA是共聚物。本文使用的术语“共聚物” 表示这样的聚合物：其含有2种或更多种不同的单体组分。PHA共聚物 的实例包括：聚-3-羟基丁酸酯-共聚-3-羟基丙酸酯、聚-3-羟基丁酸酯- 共聚-(D)-丙交酯、聚-3-羟基丁酸酯-共聚-4-羟基丁酸酯(聚-3HB-共 聚-4HB)、聚-3-羟基丁酸酯-共聚-3-羟基戊酸酯(聚-3-HB-共聚-3HV)、 聚-3-羟基丁酸酯-共聚-5-羟基戊酸酯和聚-3-羟基丁酸酯-共聚-3-羟基己 酸酯。在有些其中PHA是共聚物的实施方案中，第一种共聚单体与第 二种共聚单体之比可以是3％-97％，以重量为基础。尽管已经提供了具 有2种不同的单体组分的PHA共聚物的实例，所述PHA可以具有超过 2种不同的单体组分(例如，3种不同的单体组分、4种不同的单体组分、 5种不同的单体组分等)。

从PHA转化回收的单体组分对于每种具体PHA聚合物而言是独特 的。降解反应通常有利于β-消除(以生成不饱和的链烯酸)或解聚(以 形成与开环聚合的反转相对应的内酯)。在下面显示了典型的热分解反 应，作为几个非限制性实例：

然后可以通过常规的催化方法进一步转化(例如，修饰)不饱和的 链烯酸和内酯，以生成其它衍生产物。

因而，根据一个实施方案，提供了一种方法，所述方法包括：干燥 含有合适水平的PHA的微生物或植物生物质；任选地，加入合适的催 化剂；干燥所述生物质，以形成具有低水分含量的经干燥的生物质；加 热经干燥的生物质到约200℃至约350℃的温度范围持续约1-5分钟的时 段。这导致PHA向单体组分汽相的受控分解，所述汽相然后可以通过 冷凝进行回收。在分解PHA以后，然后可以将残余生物质送料至运行 在约200℃至约350℃的温度(或这些温度之间的温度，诸如本文所述 的那些)的焙烧反应器，停留时间为约10至约30min，以生成烘干的 生物质和残余的轻质(燃料)气体。将分解PHA产生的不凝性气体送 料至焙烧反应器，作为燃料进行回收。

根据另一个实施方案，在如上所述分解PHA以后，将残余生物质 送料至高温闪热解反应器，所述反应器通常运行在约500℃或更高的温 度，停留时间为1秒至15秒，以生成可冷凝的液体热解油和轻质不凝 性气体(所述气体作为燃料进行回收)和烧成炭的生物质(其也可以用 作固体燃料)。在有些实施方案中，使用来自高温闪热解的多余热量来 加热低温PHA分解反应器。所有阶段在一个工艺中的这种集成，可以 导致该工艺的高总能效。

根据另一个实施方案，通过标准的木质纤维素工艺处理含有PHA 的生物质，以生成可发酵的糖类和生物质的富含木质素的级分。这样的 木质纤维素工艺利用生物质的稀酸和酶处理。因为不同的PHA通常可 耐受稀酸和酶处理，在这样的处理以后，PHA主要保留在残余生物质中。 正如在木质纤维素设施中典型的，干燥残余的富含木质素的生物质，以 用作燃料。但是，根据该实施方案，在将富含木质素的生物质送料至产 生电或蒸汽的工厂之前，如下回收PHA：通过约200℃至约350℃的热 分解(或在这些温度之间的温度，诸如本文所述的那些)，经过约1-5 分钟的停留时间(或更短，或在这些时间之间的停留时间，诸如本文所 述的那些)，产生对应的PHA单体组分和第二种减少的富含木质素的 生物质。然后可以将来自反应器的减少的富含木质素的生物质直接地送 料至锅炉，或者，进一步加工，以产生烘干的生物质或热解油。这样的 热集成可以与使用生物质燃料的产生电或蒸汽的工厂一起使用，且可以 使用标准的过程集成工程技术来实现。

在以前的实施方案中，描述了通过低温降解将PHA转化成对应的 目标化学制品。例如，使用不同的催化剂，通过热分解，可以将聚-3HP 直接地转化成丙烯酸。

在另一个实施方案中，也可能对从热分解产生的PHA化学制品直 接地进行氢化、酯化或酰胺化条件，以生成对应的二醇、羟基酯和酰胺。 例如，当分别进行H₂氢化或氧化时，聚-3HB产生丁醇或马来酸酐。通 过化学方法直接转化含有PHA的生物质时的一个重大问题是，与生物 质脂类、糖类和蛋白质类的副反应潜力，这会浪费大量试剂，并导致差 的选择性和纯度。但是，需要开发新的反应器构型来操纵与常规液体或 气体原料不同的生物质原料。因此，首先将PHA分离为小分子，然后 可以使用常规的氢化、酯化和酰胺化催化剂和反应器将所述小分子转化 成多种下游化学制品，这具有重大益处。

加工脂肪和油以生成醇，会提供在这方面的一些指导。油和脂肪是 用于多种用途(诸如润滑剂和表面活性剂)中的脂肪醇的重要来源。脂 肪通常不会被直接地氢化，因为在氢化过程中，集中的反应条件倾向于 将甘油降解为低级醇诸如丙二醇和丙醇。由于该原因，更常规地首先水 解油，然后预纯化脂肪酸，以实现更有效的氢化(参见例如，Lurgi氏氢 化方法，见于Bailey’s Industrial Oil and Fat Products，第6版，第6卷集. Fereidoon Shahidi编，John Wiley & Sons，Inc.2005)。

聚-3HB(聚-3-羟基丁酸酯)是在自然界中发现的最简单的PHA， 当进行在250-350℃的热分解时，被转化成巴豆酸。在该反应过程中， 形成不可容易地分离的不同的异构体(反式巴豆酸、顺式巴豆酸和异巴 豆酸)。巴豆酸具有一些专门用途，但是不是重要的化学原料。实际上， 在历史上生产巴豆醛(通过乙醛的羟醛冷凝)作为丁醇生产的主要原料。 仅小量的巴豆醛被转化成巴豆酸，尽管这是直接的转化。

通过使用聚-3HB向巴豆酸的高选择性转化，使用直接热分解成巴豆 酸，可能分离和纯化在微生物或植物起源的生物质中含有的聚-3HB内容 物。在经典的巴豆醛至丁醇工艺的一种改进中，通过直接氢化，将巴豆 酸还原为丁醇。或者，可以首先酯化巴豆酸，然后氢化以释放出对应的 醇类。

与脱羧过程相比，在进行所述氢化步骤时，仅损失水，86％的巴豆 酸分子量被保留在丁醇中。丁醇是多用的且重要的化学原料。丁醇的一 种用途是，用于生产丙烯酸丁酯(丁醇和丙烯酸酯化)，所述丙烯酸丁 酯被广泛地用于建筑涂料中。组合基于生物质的聚-3HP向丙烯酸的转化 和基于生物质的聚-3HB向巴豆酸的转化，随后氢化成丁醇，会产生100％ 的基于可再生原料的前体，这允许生产完全可再生的丙烯酸丁酯。

已经开发了许多不同的技术来氢化脂肪酸，Bailey’s Industrial Oil  and Fat产物会提供良好概览。几个专利描述了各种不同的氢化催化剂 和工艺(参见美国专利号5,334,779、4,480,115和6,495,730，通过引用 并入)。巴豆酸向丁醇的直接还原也可以如在J.Org.Chem.198146(12) 中所述化学地实现。

在历史上，脂肪酸尚未被直接地氢化成对应的醇，因为脂肪酸具有 使采用的催化剂退化的趋势。为此原因，通常将脂肪酸转化成酯，然后 氢化，所述氢化通常是在固定床上进行。该过程需要分离和重复利用醇， 因此效率低于直接氢化。已经开发了不同的催化剂系统，以允许在水溶 液中直接氢化脂肪酸(例如，马来酸酐向丁二醇的Lurgi氢化)。也可 能使用浆工艺来氢化脂肪酸，其中送料进醇产物的大再循环流中。在反 应条件下，这会导致原位酯化，从而保护催化剂。有利地，也同时还原 任意双键。

在某些实施方案中，将一种单体组分修饰或转化成其它单体组分。 例如，将巴豆酸进一步修饰或转化成其它单体组分诸如马来酸酐。例如， 巴豆酸具有有限的市场，却是非常多用的结构单元化学试剂。经由巴豆 醛将巴豆酸转化成丁醇和经由脱羧转化成丙烯是改进途径，氧化巴豆酸 以形成马来酸酐也是如此。马来酸酐是用于不饱和的聚酯树脂中的功能 性化学结构单元，用作丁二醇的原料，且也在塑化剂、农业化学品中具 有不同用途，并用作富马酸和马来酸的原料。

马来酸酐通常通过丁烷的催化部分氧化来生产。几种商业化的工艺 处于应用中，包括固定床技术和流化床技术工艺。通过溶剂或水性工艺， 回收和纯化马来酸酐。还已经开发出熔化结晶工艺，以在经由蒸馏进行 初步分离以后生成高纯度马来酸酐。还公开了熔化结晶工艺，以在初步 分离以后生成高纯度马来酸酐。美国专利号5,929,255公开了一种熔化 沉淀工艺来共生产和纯化马来酸酐和富马酸，以避免与丁烷氧化过程中 与马来酸酐共生成的富马酸的焚化有关的损失。如本文提供地从巴豆酸 直接生产马来酸，会提供几个胜过常规的丁烷氧化工艺的优点。与具有 生成热ΔHf＝-1236kJ/mol的丁烷氧化工艺相比，巴豆酸的直接部分氧化 具有ΔHf＝-504kJ/mol。因此，该工艺产生更少的副产物蒸汽(其代表 产率损失)，且也需要丁烷工厂与大蒸汽用户(诸如精炼厂)的共同选 址。

具有用于生产PHA的代谢途径的重组宿主

作为改良的和新的材料的生产平台的宿主(例如，细菌、真菌、藻 类、植物等)的基因工程，会提供用于生产化学制品的、高价值的工业 用途的可持续的解决方案。本文描述了从经遗传修饰的重组聚羟基链烷 酸酯(PHA)生物质生产单体组分和其它改性的化学制品的工艺方法。 本文所述的方法通过在培养后或收获后生产基于生物的化学制品来避 免对宿主生物体的毒性效应，是节省成本的且高效的(例如，使用更少 的能量来制备)，减少温室气体散发，使用可再生资源，且可以进一步 加工以高产率地生产高纯度产物。

本文使用的“PHA生物质”意图指这样的任意经遗传工程化的生物 质，所述生物质包括非天然存在量的聚羟基链烷酸酯聚合物(PHA)。 野生型PHA生物质表示，生物体在自然界中通常生产的PHA的量。在 某些实施方案中，与没有过表达或抑制PHA途径中的一个或多个基因 的宿主相比，PHA的生物质滴度(g/L)已经增加。在某些实施方案中， 所述PHA滴度被报告为干细胞重量百分比(％wdc)或PHA的克数/Kg 生物质。在有些实施方案中，PHA生物质的来源是植物作物、细菌、酵 母、真菌、藻类、蓝细菌或它们中的任意2种或更多种的混合物。

“过表达”表示，由导入宿主细胞中的DNA编码的多肽或蛋白的表 达，其中所述多肽或蛋白通常不存在于宿主细胞中，或其中所述多肽或 蛋白以比编码所述多肽或蛋白的内源基因通常表达的水平更高的水平 存在于宿主细胞中。“抑制”或“减量调节”表示，编码多肽或蛋白的基因 的抑制或删除。在有些实施方案中，抑制是指，灭活生产该途径中的酶 的基因。在某些实施方案中，从异源生物体导入所述基因。

已经开发了使用快速生长的生物体(诸如大肠杆菌)的经遗传工程 化的微生物PHA生产系统。基因工程允许修饰野生型微生物，以提高 特定PHA共聚物的生产，或通过将具有不同的底物特异性或甚至动力 学性质的PHA生物合成酶添加到天然系统中，导入生成不同的PHA聚 合物的能力。在Steinbuchel & Valentin，FEMS Microbiol.Lett.128：219-28 (1995)中，描述了这些类型的系统的实例。PCT公开号WO 1998/04713 描述了用于控制分子量的方法，其中使用基因工程来控制PHA合酶的 水平。在Lee，Biotechnology & Bioengineering，49：1-14(1996)和Braunegg 等人，(1998)，J.Biotechnology 65：127-161中，公开了用于生产PHA 的、商业上有用的菌株，包括真养产碱菌(Alcaligenes eutrophus，重命 名为真养产碱杆菌(Ralstonia eutropha))、广泛产碱菌、维涅兰德固 氮菌(Azotobacter vinlandii)和假单胞菌。在有些实施方案中，生物质 的来源包括细菌、大肠杆菌。大肠杆菌可以是已经被遗传工程化成表达 或过表达一种或多种PHA的菌株。在美国专利号6,316,262、6,323,010、 6,689,589、7,081,357、7,202,064和7,229,804中描述了示例性的菌株、 发酵、培养基和补料条件。

使用本领域已知的技术，可以构建重组宿主，所述重组宿主含有编 码将碳底物转化成PHA的酶途径的必需基因。

下述一般方案被用于制备转基因的大肠杆菌PHB生产菌株：(1) 将无启动子的抗生素抗性(abr)基因克隆进合适质粒(诸如pUC18NotI 或pUC18SfiI)的聚合接头中，使得聚合接头的大部分是在abr的上游； (2)随后将phb基因克隆在abr基因的上游，且处于与abr基因相同的 方向；(3)切离phb-abr盒，作为NotI或AvrII片段(AvrII会识别在 pUC18SfiI中的SfiI位点)，并克隆进任意质粒(如来自pUT-或pLOF- 系列的那些)的对应位点；(4)将得到的质粒维持在大肠杆菌λ菌株中， 并电穿孔或缀合进选择的这些质粒在其中不会复制的大肠杆菌菌株中； 和(5)在宿主(例如，当所述宿主是萘啶酸抗性的时，萘啶酸)和盒 (例如，氯霉素、卡那霉素、四环素、氯化汞、双丙氨磷)的选择性培 养基上选择新菌株，其中phb-abr盒已经成功地集成在染色体中。在有 葡萄糖存在下，在基本培养基上关于生长和PHB形成来筛选得到的PHB 整合体。可以对该一般规程做出修改。使用本领域众所周知的技术，可 以构建重组宿主，所述重组宿主含有编码将碳底物转化成PHA的酶途 径的必需基因。

例如，对于丙烯酸单体的生产，需要生产P3HP的经遗传工程化的 宿主。对于聚3HP的生产，可以使用重组宿主，诸如在美国专利号 6,576,450、6,316,262、6,323,010、6,689,589、7,081,357、7,202,064和 7,229,804中描述的那些。一般而言，如果宿主生物体不天然地生产PHA， 可以导入P3PH途径的基因。例如，为了从碳水化合物原料直接地生成 3HP聚合物，可以进一步工程化宿主，以表达甘油-3-磷酸脱氢酶和甘油 -3-磷酸酶。这样的重组大肠杆菌菌株和它们的构建方法是本领域已知的 (Anton，D.“Biological production of 1，3-propanediol”，在美国工程学会 代谢工程第2届会议(United Engineering Foundation Metabolic  Engineering II conference)上发表，Elmau，德国，1998年10月27日；PCT  WO 1998/21339)。

在WO 2010/068953 A2中，描述了用于生产包含5-羟基戊酸酯 (5HV)单体的聚羟基链烷酸酯(PHA)的重组宿主和从可再生碳底物 生产包含5HV单体的PHA的方法。提供了这样的重组宿主，所述重组 宿主表达编码聚羟基链烷酸酯(PHA)合酶和5-羟基戊酸酯-CoA (5HV-CoA)转移酶或5HV-CoA合成酶的基因和至少一个编码参与赖 氨酸代谢途径的异源酶的转基因，其中当给所述生物体提供选自下述的 可再生碳底物时，所述宿主生产含有5HV单体的PHA聚合物：赖氨酸、 淀粉、蔗糖、葡萄糖、乳糖、果糖、木糖、麦芽糖、阿拉伯糖或其组合， 并且生产的5HV单体的水平高于在没有转基因表达存在下时的水平。用 于生产聚5-羟基戊酸酯的一种示例性宿主表达编码赖氨酸2-单加氧酶、 5-氨基五酰胺酶、5-氨基戊酸转氨酶、戊二酸半醛还原酶、5-羟基戊酸 酯CoA-转移酶和聚羟基链烷酸酯合酶的一个或多个基因，以生产含有 5HV单体的PHA聚合物。某些宿主具有在编码戊二酸半醛脱氢酶的基 因和/或编码赖氨酸输出物的基因中的缺失或突变。

也描述了这样的宿主，其中也从转基因表达编码PHA合酶、 5HV-CoA转移酶或5HV-CoA合成酶的一个或多个基因，以生成可以用 于本文所述的方法中的聚-5-羟基戊酸酯聚合物。

也可以使用天然地生产PHA的宿主，并进一步操纵以增加PHA产 率。这样的生物体的实例包括真养产碱杆菌、广泛产碱菌和固氮菌属， 但是许多其它生物体是本领域技术人员众所周知的(Braunegg等人1998， Journal of Biotechnology 65：127-161)。使用Peoples和Sinskey(1989，J. Biol.Chem.164，15298-15303)所述的标准技术实现二醇脱水酶的导入。 然后可以使用经遗传工程化的宿主来选择增加的对3-羟基丙醛的抗性。 在其它实施方案中，也可以使用对这些生物体中的P3HP同聚物生产有 益的突变。例如，具体的突变包括：灭活β-酮硫解酶和/或乙酰乙酰辅酶 A还原酶基因。由于这些基因通常是众所周知的和可得到的或可分离的， 可以如例如Slater等人，1998(J.Bacteriol.)180(8)：1979-87所述，容易地 进行基因破坏。

丙烯酸(也称作2-丙烯酸)意图指具有化学式C₃H₄O₂的羧酸。丙 烯酸是澄清的无色液体，其可溶于水中，且在醇、醚和氯仿中可完全混 溶。丙烯酸是具有双键和羰基的最简单的不饱和的羧酸。丙烯酸包括丙 烯酸根离子和盐。本文使用的“丙烯酸酯”是指丙烯酸的酯形式。

从源生物体(宿主)得到目标基因的方法是分子生物学领域常见的 和众所周知的。这样的方法可以参见：例如，Sambrook等人，Molecular  Cloning：A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory， New York(2001)；Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology， John Wiley and Sons，Baltimore，MD(1999)。例如，如果已知基因的序 列，使用对目标基因特异性的引物，使用聚合酶链式反应(Mullis，美国 专利号4,683.202)，可以从基因组DNA扩增DNA，以得到适合连接进 适当载体中的DNA的量。或者，可以重新化学地合成目标基因，以便 考虑宿主生物体的密码子偏爱，以增强异源蛋白表达。使用含有这种序 列的工程化的引物，经由聚合酶链式反应，可以将表达控制序列(诸如 启动子和转录终止子)连接至目标基因上。另一种方法是，通过限制性 内切核酸酶消化和连接，将分离的基因以适当的次序导入已经含有必要 的控制序列的载体中。该后一种方案的一个实例是BioBrick^TM技术(参 见环球网biobricks.org)，其中使用相同的2个限制位点以标准化的方 式将多个DNA片段顺序地装配在一起。

除了使用载体以外，通过使用靶向的或随机的方案整合进染色体 中，可以将碳底物向PHA的酶转化所必需的基因导入宿主生物体中。 对于向染色体上的特定位点中的靶向整合，如Datsenko和Wanner(Proc. Natl.Acad.Sci.USA，2000，97，6640-6645)最初描述地，使用通常称作 Red/ET重组工程的方法。向染色体中的随机整合包含使用Huisman等人 (美国专利号6,316,262和6,593,116)所述的微-Tn5转座子-介导的方案。

已经开发菌株来生产共聚物，其中的许多已经在重组大肠杆菌中生 产。这些共聚物包括聚(3-羟基丁酸酯-共聚-3-羟基戊酸酯)(PHBV)、聚(3- 羟基丁酸酯-共聚-4-羟基丁酸酯)(P3HB-共聚-4HB)、聚(4-羟基丁酸酯) (P4HB)和含有3-羟基辛酸酯单元的长侧链PHA(Madison和Huisman， 1999)。已经开发出含有在质粒上的phb基因的大肠杆菌菌株来生产 P(3HB-3HV)(Slater，等人，Appl.Environ.Microbiol.58：1089-94(1992)； Fidler & Dennis，FEMS Microbiol Rev.103：231-36(1992)；Rhie & Dennis， Appl.Environ.Micobiol.61：2487-92(1995)；Zhang，H.等人，Appl. Environ.Microbiol.60：1198-205(1994))。通过将来自代谢上不相关的途 径的基因导入P(3HB)生产菌株中，实现P(4HB)和P(3HB-4HB)在大肠杆 菌中的生产(Hein，等人，FEMS Microbiol.Lett.153：411-18(1997)； Valentin & Dennis，J.Biotechnol.58：33-38(1997))。通过将绿脓杆菌的 phaC1和phaC2基因导入fadB::kan突变体中(Langenbach，等人，FEMS  Microbiol.Lett.150：303-09(1997)；Qi，等人，FEMS Microbiol.Lett. 157：155-62(1997))，也已经工程化大肠杆菌，以生产中短链聚羟基链 烷酸酯(msc-PHA)。

用于生产植物的方法已经描述在：美国专利号5,245,023和美国专 利号5,250,430、5,502,273、5,534,432、5,602,321、5,610,041、 5,650,555、5,663,063；和PCT公开号WO  1991/00917、WO  1992/19747、WO 1993/02187、WO 1993/02194和WO 1994/12014， Poirier 等人，1992，Science 256；520-523，Williams and Peoples，1996. Chemtech26，38-44，它们的教导通过引用并入本文。

已经开发出生产高水平的聚羟基链烷酸酯(PHA)的转基因植物， 尤其是转原质体(transplastomic)植物。描述了使用高水平的稳定的PHA (尤其是PHB)生产基因来遗传工程化植物质体的方法和构建体。参见 例如，PCT公开号：WO 2010/102220，它通过引用并入本文。已经报道 了在下述植物中的聚羟基丁酸酯(PHB)合成的概念研究的证据：柳枝 稷(Somleva 等人，Plant Biotechnol.J.6：663-678(2008))，甘蔗(Petrasovits 等人，Plant Biotechnol.J.5：162-172(2007)；Purnell 等人，Plant Biotechnol. J.5：173-184(2007))，油菜(Valentin等人，Int.J.Biol.Macromol. 25：303-306(1999)；Slater 等人，Nat.Biotechnol.17：1011-1016(1999)； Houmiel等人，Planta 209：547-550(1999))，和谷物秸杆(Poirier等人， 2002，Polyhydroxyalkanoate production in transgenic plants，in Biopolymers， Vol 3a，Steinbuchel，A.(编)，Wiley-VHC Verlag GmbH，第401-435 页)。尽管这些研究已经产生重要的科学结果(Slater等人，Nat. Biotechnol.17：1011-1016(1999))，需要增强在作物平台中生产的聚合 物的总经济学的更高产率。野生型生物质中的PHA重量百分比随生物 质的来源而变化。对于通过发酵过程从基于可再生资源的原料(诸如糖 类、植物油或甘油)生产的微生物系统，生物质中的PHA的量可以是 生物质总重量的约65重量％或更多。对于植物作物系统、尤其是生物质 作物(诸如甘蔗或柳枝稷)，PHA的量可以是生物质总重量的约3％或 更多。对于藻类或蓝细菌系统，PHA的量可以是生物质总重量的约40％ 或更多。

美国专利申请US20100229258(通过引用并入本文)描述了生产高 水平的PHA(即，在植物组织中的至少10％干重)的多产转基因植物， 并使用质体编码的基因表达来生产。

在本发明的某种方面，所述重组宿主已经被遗传工程化，以生产与 野生型宿主相比增加的量的PHA。例如，在某些实施方案中，所述PHA 与野生型相比增加了约20％至约90％，或约50％至约80％。在其它实施 方案中，所述重组宿主生产的PHA与野生型相比增加了至少约20％， 与野生型相比增加了至少约30％，与野生型相比增加了至少约40％，与 野生型相比增加了至少约50％，与野生型相比增加了至少约60％，与野 生型相比增加了至少约70％，与野生型相比增加了至少约75％，与野生 型相比增加了至少约80％，或与野生型相比增加了至少约90％。在其它 实施方案中，与野生型宿主生产的量相比，所述PHA增加了约2倍至 约400倍。根据在Doi，Microbial Polyesters，John Wiley&Sons，第24页， 1990中所述的方法，通过气相色谱法测定宿主或植物中的PHA的量。 在某些实施方案中，实现了100-120g PHA/Kg生物质的生物质滴度。在 其它实施方案中，将PHA滴度的量表示为干细胞重量百分比(％dcw)。

在有些实施方案中，所述PHA是聚乙醇酸交酯、聚-3-羟基丙酸酯、 聚-3-羟基丁酸酯、聚-4-羟基丁酸酯、聚-5-羟基丁酸酯或它们的共聚物。 在某些实施方案中，所述PHA是聚乙醇酸交酯、聚-3-羟基丙酸酯、聚 -3-羟基丁酸酯、聚-4-羟基丁酸酯或聚-5-羟基丁酸酯。在某些实施方案 中，所述PHA是聚-3-羟基丁酸酯。在其它实施方案中，所述PHA是聚 -3-羟基丙酸酯。

在某些实施方案中，可能希望标记生物质的组分。例如，可能有用 的是，有意地用碳同位素(例如，¹³C)进行标记，以促进结构测定或用 于其它装置。这如下实现：培养遗传工程化成表达所述组分(例如，聚 合物)的微生物，但是不使用普通培养基，而是在包含含有¹³C的碳源 (诸如葡萄糖、甘油、丙酮酸等)的生长培养基上培养所述细菌。以此 方式，可以生产被¹³C均匀地、部分地或在特定位点处标记的聚合物。 另外，标记允许经由ASTM D6866(放射碳定年的工业应用)获知来自 可再生源(例如，植物衍生物)的生物塑料的精确百分比。ASTM D6866 会测量基于生物的物质的碳14含量；并且，由于基于化石的物质不再 具有碳14，ASTM D6866可以有效地消除基于生物的内容物的不准确声 明。

培养宿主以生产PHA生物质

一般而言，通过批式或连续的发酵技术，使用本领域已知的方法， 在含有碳源和其它必需营养物的培养基中培养重组宿主，以生成PHA 生物质。也可以包括其它添加剂，例如，消泡剂等，用于实现希望的生 长条件。对于大规模生产而言，发酵是特别有用的。一个示例性的方法 使用生物反应器来培养和加工发酵液成希望的产物。其它技术(诸如分 离技术)可以与发酵组合地用于大规模生产和/或连续生产。

本文使用的术语“原料”表示，在工业过程中用作碳原料的物质。当 用于表示生物体(诸如微生物或藻类生物体)的培养物(诸如含有细胞 的发酵过程)时，该术语表示，用于给细胞提供碳或其它能源的原料。 可用于生产单体组分的碳源包括简单的、廉价的碳源，例如，葡萄糖、 蔗糖、乳糖、果糖、木糖、麦芽糖、阿拉伯糖等。在其它实施方案中， 所述原料是糖蜜或淀粉、脂肪酸、植物油或木质纤维素材料等。也可能 使用生物体来生产PHA生物质，所述生物体在从可再生的生物质资源 生成的合成气体(CO₂、CO和氢)上生长。

PHA途径基因的导入，允许在使用可容易地得到的和廉价的原料时 的灵活性。本文使用的术语“原料”表示在工业过程中用作原料的物质。 当用于表示微生物或藻类生物体的培养物(诸如含有细胞的发酵过程) 时，该术语表示用于为细胞供给碳或其它能源的原料。“可再生的”原料 表示可再生的能源，诸如从活生物体或它们的代谢副产物衍生出的物 质，包括从生物质衍生出的物质，经常由未充分利用的组分(如谷壳或 秸杆)组成。专门栽培用作可再生原料的农业产物包括，例如，谷物、 大豆、柳枝稷和树诸如白杨、小麦、亚麻籽和油菜籽、甘蔗和棕榈油。 作为能量和原料的可再生源，基于作物的农业原料是日益减少的油储量 的最终替代品。植物使用太阳能和二氧化碳来制备数千种复杂的且有功 能的生物化学品，这超过了现代合成化学的能力。这些包括精细化学品 和散装化学品、药物、聚合物、树脂、食品添加剂、生物着色剂、粘着 剂、溶剂和润滑剂。

一般而言，在生产(例如，培养)PHA生物质过程中或以后，将生 物质与催化剂混合，以将PHA聚合物转化成高纯度的单体组分产物。 例如，通过混合、絮凝、离心或喷雾干燥或本领域已知的其它合适的方 法，混合催化剂(处于固体或溶液形式)和生物质，以促进生物质和催 化剂的相互作用，驱动PHB向单体组分的有效的且特异性的转化。在有 些实施方案中，初步干燥所述生物质，例如在约100℃至约150℃的温 度，并持续一定时间量，以减少生物质的水含量。然后将经干燥的生物 质重新悬浮于水中，再与催化剂混合。针对产物纯度和产率确定干燥的 合适的温度和持续时间，且在有些实施方案中，可以包括用于回收水的 低温(诸如在25℃至150℃)延长的时间段，或在其它实施方案中，可 以包括在高温(例如，高于450℃)干燥短时间段。或者，通过本领域 已知的除了加热以外的其它方法，可以去除水。在“合适的条件”下表示， 促进催化反应的条件。例如，在使产物单体组分的产生最大化的条件下， 诸如在有辅剂(co-agent)或促进反应效率的其它物质存在下。其它合适 的条件包括：在没有杂质存在下，所述杂质诸如金属或会妨碍反应前进 的其它物质。

PHA生物质的热降解

本文使用的“加热”、“热解”、“热分解”和“烘干”表示，热降解(例 如，分解)PHA生物质以转化成单体组分。一般而言，在有催化剂存在 下在高温下进行PHA生物质的热降解。例如，在某些实施方案中，本 文所述的方法的加热温度是在约200℃至约400℃之间。在有些实施方 案中，所述加热温度是约200℃至约350℃。在其它实施方案中，所述 加热温度是约300℃。“热解”通常表示生物质在高温热化学分解一段时 间。持续时间的范围可以是几秒至几小时。在某些条件下，在没有氧存 在下，或在有限量的氧存在下，进行热解，以避免氧化。PHA生物质热 解过程可以包括直接的热量传递或间接的热量传递。“闪热解”表示，在 高温迅速地加热生物质，以实现PHA生物质的快速分解，例如，生物 质中PHA的解聚。闪热解的另一个实例是RTP^TM快速热裂解。RTP^TM技 术和来自Envergent Technologies，Des Plaines，IL的装置会将原料转化成 生物油。“烘干”表示焙烧的过程，它是本领域公知的术语，表示生物质 的干燥。该过程通常包括：在约200至约350℃的温度范围内加热生物 质相对较长的时间段(例如，10-30分钟)，通常在没有氧存在下。所 述方法产生，例如，烘干的生物质，其具有小于生物质的7重量％的水 含量。然后可以进一步加工烘干的生物质。在有些实施方案中，在大气 压或在受控压力下在真空中进行所述加热。在某些实施方案中，不使用 或使用减少的石油产生的能量，完成所述加热。

在某些实施方案中，在加热之前，干燥所述PHA生物质。或者， 在其它实施方案中，在热降解(例如，加热、热解或焙烧)PHA生物质 的过程中进行干燥。干燥会减少生物质的水含量。在某些实施方案中， 在约100℃至约350℃之间(例如，在约200℃至约275℃之间)的温度 干燥所述生物质。在有些实施方案中，所述干燥的PHA生物质具有5 重量％或更低的水含量。

PHA生物质/催化剂混合物的加热进行足够的时间，以有效地和特 异性地将PHA生物质转化成单体组分。在某些实施方案中，加热的时 间段是约30秒至约1分钟、约30秒至约1.5分钟、约1分钟至约10分 钟、约1分钟至约5分钟或之间的时间，例如，约1分钟、约2分钟、 约1.5分钟、约2.5分钟、约3.5分钟。

在其它实施方案中，所述时间段是约1分钟至约2分钟。在其它实 施方案中，所述加热时间段是在约5分钟至约30分钟之间、在约30分 钟至约2小时之间、或在约2小时至约10小时之间或大于10小时(例 如，24小时)的时间。

在某些实施方案中，所述加热温度是在约200℃至约350℃的温度， 包括之间的温度，例如，约205℃、约210℃、约215℃、约220℃、约 225℃、约230℃、约235℃、约240℃、约245℃、约250℃、约255℃ 约260℃、约270℃、约275℃、约280℃、约290℃、约300℃、约310 ℃、约320℃、约330℃、约340℃，或345℃。在某些实施方案中，所 述温度是约250℃。在某些实施方案中，所述温度是约275℃。

本文使用的“烯烃复分解”是指这样的有机反应：其通过烯烃(链烯 烃)中的碳-碳双键的分裂，实现烯烃基片段的重新分布。烯烃复分解优 点包括：生成更少的副产物和有害的废物。该反应经过烯烃双键裂解来 进行，随后进行烯烃基片段的统计重新分布。该反应由金属有机物催化 剂来催化，所述金属有机物催化剂包括诸如镍、钨、铼、钌和钼等金属。 相比较而言，钼催化剂通常对烯烃具有更高的反应性，尽管它们也与醛 和其它极性的或质子性的基团反应。钌优先与碳-碳双键反应超过大多数 其它物质，这使得这些催化剂对醇、酰胺、醛和羧酸是非常稳定的。催 化剂的实例包括在下面更详细地讨论的Grubbs氏催化剂(钌卡宾配合 物)和Schrock亚烷基催化剂(基于钼(VI)和钨(VI)的催化剂)。 在本文所述的方法中，所述烯烃复分解是交叉复分解。

本文使用的“催化剂”表示这样的物质：其会启动或加速化学反应， 其本身在反应中不受影响或消耗。有用的催化剂的实例包括金属催化 剂。在某些实施方案中，所述催化剂会降低开始热分解的温度，并增加 在特定热解温度(例如，约200℃至约325℃)时的热分解速率。

根据任一种方法的一些实施方案，通过在转化之前或过程中向生物 质中加入催化剂，促进特定中间化学体的转化效率和选择性。催化剂是 促进生物质中的PHA聚合物链的消除反应或ω-羟基解链反应的物质。 在某些实施方案中，所述催化剂是金属催化剂。在有些实施方案中，所 述催化剂是含有金属离子的氯化物、氧化物、氢氧化物、硝酸盐、磷酸 盐、磺酸盐、碳酸盐或硬脂酸盐化合物，所述金属离子是铝、锑、钡、 铋、镉、钙、铈、铬、钴、铜、镓、铁、镧、铅、锂、镁、钼、镍、钯、 钾、银、钠、锶、锡、钨、钒或锌。在有些实施方案中，所述催化剂是 有机催化剂，包括、但不限于：胺、叠氮化物、烯醇、二醇、季铵盐、 酚盐、氰酸盐、硫氰酸盐、二烷基酰胺和烷基硫醇酯。催化剂的量是足 以促进反应的量。也包括2种或更多种催化剂的混合物。

在某些实施方案中，金属催化剂的量是，生物质的干固体重量的约 0.1％至约15％，这基于金属离子的重量。在有些实施方案中，催化剂的 量是在约7.5％至约12％之间。在其它实施方案中，催化剂的量是干细胞 重量的约0.5％、约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、 约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％ 或更高诸如多达20％，或更高诸如多达30％，或更高诸如多达40％，或 更高诸如多达50％。

在某些实施方案中，在本发明的方法中另外包括催化剂的回收。例 如，当使用钙催化剂时，煅烧是有一种有用的回收技术。煅烧是一种热 处理过程，其在矿物质、金属或矿石上进行，以通过去羧基化、脱水、 有机物的脱除挥发物、相转化或氧化来改变所述物质。该过程通常在诸 如坩埚炉、竖炉、回转窑或更近的流化床反应器等反应器中进行。选择 的煅烧温度低于所述物质的熔点，但是高于它的分解或相变温度。经常 将其取作当反应的吉布斯自由能等于零时的温度。对于CaCO₃分解成 CaO，计算出在ΔG＝0时的煅烧温度为～850℃。通常，对于大多数矿物 质，煅烧温度是在800-1000℃范围内。

为了在回收单体组分以后从生物质中回收钙催化剂，可以将用完的 生物质残余物从热解或焙烧直接转移至煅烧反应器，并在空气中继续加 热生物质残余物至825-850℃一段时间，以去除所有痕量的有机生物质。 去除有机生物质以后，可以将催化剂原样使用，或通过分离存在的金属 氧化物(从发酵培养基和催化剂中)进一步纯化，所述分离是基于密度， 使用本领域技术人员已知的装置。

当用于表示反应中的化学试剂时，本文使用的术语“足够的量”意图 指，可以满足化学反应需求的所提试剂的量。

本文使用的“氢化”是指用氢处理，也是一种化学还原形式，是分子 氢(H₂)和其它化合物或元素之间的化学反应，通常在有催化剂存在下。 该过程通常用于还原或饱和有机化合物。

本文使用的“低级烷基”表示C2-C4烷基、(例如，乙基、丙基、丁 基)。

本文使用的“低级烯烃”表示C2-C4烯烃(例如，乙烯、丙烯、丁烯)。 “乙烯”是一种无色的可燃性的气体，其表现出在水中的溶解度。“丙烯” 是一种具有化学式C₃H₆的不饱和有机化合物。“丁烯(Butene)”也称作 丁烯(butylene)，是具有式C₄H₈的烯烃。它是一种无色的气体，作为 次要成分存在于原油中，其量太小不足以进行可行提取。因此如下得到 它：催化裂化精制原油过程中剩下的长链烃。裂化会产生产物的混合物， 通过分馏从其中提取2-丁烯。

本文使用的“酯化”表示这样的化学反应：其中2种反应物(通常是 醇和酸)形成酯，作为反应产物。

“碳足迹”是所述方法对环境的影响(尤其是气候变化)的量度。它 与生产的温室气体的量有关。

通过参考下述实施例，可以更容易地理解本发明的技术(如此一般 地描述的)，所述实施例作为实例来提供，无意限制本发明的技术。

在某些实施方案中，“回收”单体蒸汽包括：冷凝所述蒸汽。当应用 于蒸汽时，本文使用的术语“回收”是指，将蒸汽与PHA生物质材料分离 开，例如，包括、但不限于通过下述方法进行回收：冷凝，分离方法， 诸如使用膜，气体(例如，蒸汽)相分离，诸如蒸馏等。因而，通过冷 凝装置可以实现回收，所述冷凝装置捕获单体组分蒸汽，将单体组分蒸 汽冷凝成液体形式，并将其转移离开生物质材料。

作为一个非限制性实例，单体组分蒸汽的冷凝可以如下所述。来自 热解/焙烧室的进入的气体/蒸汽流进入交换器中，在这里可以预冷却所 述气体/蒸汽流。所述气体/蒸汽流然后穿过冷却器，在这里将所述气体/ 蒸汽流的温度降低至，通过与冷却剂的间接接触从气体中冷凝指定的蒸 汽所需的温度。所述气体和冷凝的蒸汽从冷却器流入分离器中，在这里 将冷凝的蒸汽收集在底部。不含有蒸汽的气体流出分离器，穿过交换器， 并离开所述单元。回收的液体从分离器的底部流动至或被泵至贮存器。 对于一些产物，冷凝的蒸汽会固化，并收集固体。

在其它实施方案中，如果需要的话，通过本领域已知的其它方法可 以进一步纯化单体组分，例如，通过蒸馏，通过反应蒸馏(例如，首先 酸化单体组分，以氧化某些组分(例如，为了容易分离)，然后蒸馏)， 通过用活性炭处理(为了去除颜色和/或气味体)，通过离子交换处理， 通过液-液萃取(使用单体组分不混溶的溶剂来去除脂肪酸等)，对于单 体回收以后的纯化而言，通过真空蒸馏，通过萃取蒸馏或使用会进一步 纯化单体组分的类似方法，以增加单体产率。也可以使用这些处理的组 合。

在某些实施方案中，所述方法选择性地用于生产含有相对小量的不 希望的副产物的单体。术语所述方法的“单体组分”包括单体和副产物， 诸如二聚体和寡聚体。在某些实施方案中，所述单体组分可以包括95 重量％的单体诸如丙烯酸和5％的副产物诸如二聚体。因而，单体组分中 的单体的量可以是约70重量％、约71重量％、约72重量％、约73重 量％、约74重量％、约75重量％、约76重量％、约77重量％、约78 重量％、约79重量％、约80重量％、81重量％、约82重量％、约83 重量％、约84重量％、约85重量％、约86重量％、约87重量％、约88 重量％、约89重量％、约90重量％、91重量％、约92重量％、约93 重量％、约94重量％、约95重量％、约96重量％、约97重量％、约98 重量％、约99重量％或约100重量％。

足够量的特异性催化剂的使用，会减少不希望的副产物的生产，并 使单体产率增加至少约2倍。在有些实施方案中，不希望的副产物的生 产会减少至至少约50％、至少约40％、至少约30％、至少约20％至少约 10％或约至少约5％。在特定实施方案中，不希望的副产物小于回收的单 体的约5％、小于回收的单体的约4％、小于回收的单体的约3％、小于 回收的单体的约2％、或小于回收的单体的约1％。

本文所述的方法可以提供表示为百分比产率的单体组分产率，例 如，当在葡萄糖碳源上生长时，产率是多达95％，这基于[克PHA组分/ 克葡萄糖]x 100％，或将单体产率表示为[克单体/克PHA组分]x 100％。 在其它实施方案中，所述产率是在下述范围内：约40％至约95％，例如 约50％至约70％，或约60％至70％。在其它实施方案中，所述产率是约 75％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约45％或约40％。 因而，可以计算产率((g单体组分/g起始PHA)x100％)。

巴豆酸的生产

巴豆酸是一种有用的化学中间体，其在商业上通过巴豆醛的催化氧 化来生产。目前估测，巴豆酸的市场大小是500万美元。但是，它在下 面用作原料化学中间体，因为它可以催化地转化成更有附加值的化学制 品，如丁醇、丙烯酸、马来酸和富马酸，它们是用于生产粘着剂、油漆、 涂料、个人护理产品和工程树脂的结构单元。

最近已经报道了用于将“天然的”烯烃产物转化成有用的基于生物的 化学制品的新方法(J.Metzger(2009)，Eur.J.Lipid Sci，111，第865页；A. Ryback，M.Meier(2007)，Green Chem.，9，第1356页；US2009/0155866A1， by M.Burk等人)。这些方法的关键是，使用复分解催化剂来使不同类 型的烯烃反应，在所述复分解催化剂中，第一种确定地定义的、高活性 的催化剂由Schrock和Grubb开发，随后由Hoveyda(Y.Schrodt，R. Pederson(2007)，Aldrichimica ACTA，第40卷，第2期，第45页)扩 展。

交叉复分解已经变成一种从生物质原料生产基于生物的化学制品 的特别重要的反应途径。例如，基于植物的不饱和脂肪酸与乙烯的交叉 复分解具有可持续地以高产率生产多种聚合物(包括聚酯、聚酰胺和聚 醚)的潜力(V.P.Kukhar(2009)，Kem.Ind.，58(2)，第57页)。乙 烯是一种可以与其它基于生物的化合物反应的方便的单体，因为它可以 直接产生多种高体积的商品中间体如丙烯酸和酯。随着“绿色”乙烯的开 发，所述“绿色”乙烯通过基于生物的乙醇的催化脱水来生产(A. Morschbaker(2009)，Polymer Reviews，第49卷，第2册，第79页)， 生成100％基于生物的中间体的能力正在变成一种有吸引力的选项。但 是，在用Grubbs催化剂使乙烯单体反应时的一种挑战是，乙烯的使催化 剂灭活或退化的习性，该习性会导致低转化率和产率损失(Z.Lysenko 等人(2006)，J.of Organometallic Chem.，691，第5197页；X.Lin等人 (2010)，J.of Molecular Catalysis A：Chemical，330，第99页；K.Burdett等 人(2004)，Organometallics，23，第2027页)。当开发使用复分解催化剂 的工业用途时，这是特别重要的。

本文描述了克服该问题的方法，其中使用多串联催化反应方法和工 艺。在第一个阶段，首先使用对乙烯灭活不敏感的复分解催化剂将乙烯 和2-丁烯转化成丙烯，诸如Schrock的钼-亚烷基或钨-亚烷基催化剂 (Schrock等人(1988)，J.Am.Chem.Soc.，110，第1423页)。然后在 第二个阶段使用Grubb的催化剂(诸如(1，3-双(2，4，6-三甲基苯基)-2-咪唑 烷亚基)二氯(邻异丙氧基苯基亚甲基)钌)，使丙烯与希望的基于生物的 化合物反应。在该反应方案中，Grubb的催化剂从未暴露于乙烯，因此 能够维持工业生化过程所需的高反应速率和高产率。

在本发明的一个方面，描述了使用多串联催化反应方案从PHA生物 质生产丙烯酸的连续的生物精制方法。所述方法包括：培养经遗传工程 化的PHA生物质，以生成聚-3-羟基丁酸酯，加热(例如，闪热解)聚-3 羟基丁酸酯以生成巴豆酸，在合适的条件下在有酯交换催化剂存在下使 巴豆酸反应，以形成巴豆酸低级烷基酯；在合适的条件下在有第一复分 解催化剂存在下使巴豆酸低级烷基酯经由交叉复分解与足够量的丙烯 反应，以形成丙烯酸低级烷基酯和低级烯烃。在有第二复分解催化剂存 在下从乙烯和2-丁烯的单独复分解反应形成所述丙烯，并连续去除多余 的丙烯。

如上所述，众所周知PHB是热不稳定的(Cornelissen等人，Pp. 2523-2532，Fuel，87，2008)，并在特定条件下加热后转化成包括巴豆酸 在内的中间体(参见Kopinke等人，Polymer Degradation and Stability， 52：25-38(1996))。可以将巴豆酸进一步加工成丙烯酸和丙烯酸酯。 聚合物热稳定性通常是热塑性应用的一个限制因素，但是，如本文所述， 可以影响该因素，以将低成本的PHB(例如，来自生物质源)以高纯度 和高产率转化成巴豆酸。巴豆酸本身具有有限的市场，主要用作乙烯树 脂系统中的共聚单体，其中它赋予终产物一些疏水性质。在合适的条件 下，使巴豆酸反应，以形成巴豆酸低级烷基酯；和在有第一催化剂存在 下，在合适的条件下，使巴豆酸低级烷基酯通过交叉复分解与足够量的 丙烯(proplylene)反应，以形成丙烯酸低级烷基酯和低级烯烃。

从生物质生产的基于生物的化学制品(例如，巴豆酸、丙烯酸、丙 烯、丁烷等)，可以用作用于多种用途的原料。例如，通过在它们的双 键处反应，可以使丙烯酸和它的酯与它们自身或其它单体(例如丙烯酰 胺、丙烯腈、乙烯基、苯乙烯和丁二烯)容易地化合，形成同聚物或共 聚物，所述同聚物或共聚物用于生产不同的塑料、造纸和涂料、木材和 石工的室外油漆、压缩板和有关建筑材料的涂料，用于絮凝矿物粉矿和 废水，和用于处理污水、印刷用油墨、内墙油漆、地板蜡、地板和墙覆 盖层、工业底漆、纺织型浸润剂，用于处理和精整、皮革浸渍和精整， 和用作石工密封胶、涂料、粘着剂、弹性体以及地板蜡和油漆。丙烯酸 也用于生产聚合材料，诸如聚丙烯酸，所述聚丙烯酸是超吸收尿布的主 要组分。

同样地，丙烯是多种产物的原料，所述产物包括聚丙烯，聚丙烯是 用于包装和其它用途中的多用聚合物。它是位于乙烯之后的第二种最高 体积的石化原料。通过异丙基苯工艺，将丙烯和苯转化成丙酮和苯酚。 丙烯也用于生产异丙醇(丙烷-2-醇)、丙烯腈、氧化丙烯(环氧丙烷) 和表氯环氧丙烷。

这些化学制品然后用于制备基于生物的耐用的产品，例如，在电子 和汽车工业中的产品。

从含有聚-3-羟基丁酸酯(PHB)的生物质开始，通过加热PHB生 物质得到的单体组分主要是反式-巴豆酸。随后使用多个串联复分解催化 反应，转化巴豆酸，以生成丙烯酸、丙烯酸酯和丁醇。本文描述了从含 有PHB的生物质生产这些不同的化学制品所需的材料和方法。

因此，描述了一种在PHA生物质中生产巴豆酸的方法，其中在合 适的条件下使巴豆酸反应以形成巴豆酸低级烷基酯，在有第一催化剂存 在下在合适的条件下使巴豆酸低级烷基酯通过交叉复分解与足够量的 丙烯(proplylene)反应，以形成丙烯酸低级烷基酯和低级烯烃。在有第 二催化剂存在下，通过乙烯和2-丁烯的单独的复分解反应，形成丙烯， 同时连续地去除多余的丙烯。在某些实施方案中，所述方法另外包括： 在有第三催化剂存在下，在合适的条件下，使巴豆酸酯反应，以形成醇。

本发明也涉及一种在PHA生物质中生产巴豆酸的方法，其中在合 适的条件下使巴豆酸反应，以形成巴豆酸丁酯，并氢化巴豆酸丁酯，以 形成2分子的丁醇。

在本发明的另一个方面，描述了一种用于生产丙烯酸低级烷基酯的 方法。所述方法包括：培养经遗传工程化的PHA生物质，以生成聚-3- 羟基丁酸酯，热解(在高温加热，或通过烘干)聚-3羟基丁酸酯以生成 巴豆酸，在合适的条件下使巴豆酸反应以形成巴豆酸低级烷基酯，在有 第一催化剂存在下在合适的条件下使巴豆酸低级烷基酯通过交叉复分 解与足够量的丙烯反应，以形成丙烯酸低级烷基酯和低级烯烃。

在本发明的另一个方面，描述了一种使用多串联催化反应方案从 PHA生物质生产丙烯酸的连续的生物精制方法。所述方法包括：培养经 遗传工程化的PHA生物质，以生成聚-3-羟基丁酸酯，热解聚-3羟基丁 酸酯以生成巴豆酸，在有酯化催化剂存在下在合适的条件下使巴豆酸反 应以形成巴豆酸低级烷基酯；在合适的条件下在有第一复分解催化剂存 在下使巴豆酸低级烷基酯经由交叉复分解与足够量的丙烯反应以形成 丙烯酸低级烷基酯和低级烯烃。在有第二复分解催化剂存在下，从乙烯 和2-丁烯的单独复分解反应形成丙烯，并连续去除多余的丙烯。通过分 离出反应物，并选择适当的催化剂，优化产物产率。

所述方法包括一种多串联催化反应方法，所述方法会提供高产率地 生产源自巴豆酸的丙烯酸和丙烯酸酯产物的有效方法。在某些实施方案 中，在PHA转化成巴豆酸以后，将残余生物质用作能源。

“复分解催化剂”可以单独使用，或与一种或多种其它催化剂组合使 用。在有催化有效量的复分解催化剂存在下，进行复分解反应。术语“复 分解催化剂”包括会催化复分解反应的任意催化剂或催化剂系统。复分解 催化剂的根本功能是，通过活化的金属配位过程来促进碳-碳双键的重 排。这样，这些催化剂可以用于偶联(交叉复分解或CM)、裂解、开 环(ROM)、闭环(RCM)或聚合(ROMP)多种烯烃化合物。特别有 用的复分解催化剂是Grubbs催化剂，该催化剂是基于被5个配体包围的 中央钌原子：2个中性供电子基团、2个单阴离子基团和1个亚烷基基 团。最新一代的钌复分解催化剂具有下述优点：能够在空气中处理，在 相对低温反应，并耐受不同的烯烃官能团(包括质子性的基团诸如醇类 和酸类)，并同时维持高催化剂活性(S.Connon，S.Bleichert(2003)，Ang. Chem.Int.Ed.，42，第1900页)。

这些合成的催化剂代表一种突破性的技术，该技术允许将复分解化 学应用于功能分子(诸如不饱和的植物油衍生出的脂肪酸、脂肪酸酯、 羟基脂肪酸和不饱和的多元醇酯)上。示例性的复分解催化剂包括：基 于过渡金属(例如，钌、钼、锇、铬、铼和钨)的金属卡宾催化剂。示 例性的基于钌的复分解催化剂(通常称作Grubb的催化剂)特别适用于 烯烃复分解。复分解催化剂包括最初的“第一代催化剂”、“第二代催化剂” (参见Schrodi和Pederson，Aldrichimica ACTA Vol 40(2)45-52(2007)和 美国专利号7,329,758)和“Hovedyda-Grubbs类似物”。这些催化剂特别 适用于含有氧合的化合物的反应。

许多因素会影响烯烃复分解的复杂催化途径。现有的复分解催化技 术具有许多限制，包括催化失活、低催化周转率、催化不稳定性和降解 和差的选择性，仅举几个例子。这些限制会导致低产物产率和成本增加。

催化周转率是，每摩尔催化剂在变得失活之前可以转化的底物的摩 尔数。已经估测出，就烯烃复分解而言，为了在经济上可行的生物精制 方法中生产足够的产物，催化周转率应当大于50000(Burdett等人， Oganometallics 23：2027-2047(2004))。

复分解催化剂的失活经常涉及不饱和产物的累积导致的末期烯烃 抑制。当将乙烯和丁烯转化成丙烯时，通过用顺式2-丁烯预处理或调节 催化剂，限制复分解催化剂的失活，而乙烯的预处理与催化失活有关(参 见Lysenko等人，J.of Organometallic Chem.，691：5197-5203(2006))。

本文所述的多串联催化反应和工艺会实现选择性、减少的失活和增 加丙烯酸产物的产率的其它反应条件。巴豆酸是一种具有在C2和C3碳 之间的双键的羧酸。游离的羧酸和乙烯会灭活复分解催化剂。通过在多 串联催化工艺中将巴豆酸转化成丙烯酸，复分解催化剂是反应特异性 的，且不会暴露于游离羧酸或乙烯。为了高产率，分离并优化总反应的 每个步骤。

在一个解释多串联催化工艺的示例性工艺的第一阶段，使用酯化催 化剂，将巴豆酸转化成巴豆酸丁酯。在第二阶段，使用对乙烯灭活不敏 感的催化剂，将乙烯和2-丁烯转化成丙烯。通过连续去除限制任何不希 望的副反应的丙烯，使反应的选择性最大化。最后，在第三阶段，使用 另一种不同的特异性的复分解催化剂，使丙烯与巴豆酸丁酯反应，以生 成丙烯酸丁酯和丙烯。

图12详述了一般的产生丁烷和乙烯的丙烯复分解反应。催化循环 的起点是金属卡宾(I)。这与丙烯反应，以产生金属环丁烷中间体(II)。 该4元环然后在相反方向断裂，以释放出乙烯，并建立新的金属卡宾 (III)，后者与另外当量的丙烯反应。得到的金属环丁烷(IV)的片段 化会产生2-丁烯，并再生最初的金属卡宾(I)，后者然后重新进入催化 循环。

在本发明的某些实施方案中，在没有乙烯或其它灭活产物或副产物 存在下，在反应中使用复分解催化剂。在其它实施方案中，复分解催化 剂对乙烯或其它灭活化合物不敏感。在其它实施方案中，所述复分解催 化与不对称的烯烃(例如丙烯)反应。

通过选择适当的复分解催化剂，可以优化本文所述方法的每个阶段 的选择性和反应速率。通过对比产物形成的速率，可以设计和测试催化 剂，所述催化剂在不同的反应条件下在多串联催化反应的每个步骤下具 有希望的活性。新的复分解催化剂正在开发中，以满足生物化学品的工 业生产的需求，其中所述催化剂更有活性，并在多种反应条件下选择性 地执行更困难的转化，具有独特的反应性和定制的起始速率。根据希望 的复分解反应所需的稳定性、反应性和选择性，定制这些复分解催化剂。 在本文中也预见到，开发新的复分解催化剂，所述催化剂会提高本文所 述的方法的反应性、选择性或起始速率。通过改变与金属中心连接的配 体基团，可能优化特定反应的复分解催化剂。例如，已经发现，根据在 Grubbs催化剂中使用的可分开的膦配体的类型，可以控制复分解反应的 起始速率。当考虑到下述方面时，这是重要的：根据用途，采用更缓慢 地(例如对于ROMP反应)或更快速地(例如对于低温反应)开始的催 化剂是有利的。

复分解催化剂的商业来源包括：Sigma-Aldrich、Materia和Elevance (美国专利公开号US 2009/0264672)。

其它示例性的复分解催化剂包括、但不限于选自下述的金属卡宾配 合物：钼、锇、铬、铼和钨。术语“配合物”表示，至少一种配体或络合 剂所配位或结合的金属原子，诸如过渡金属原子。在可用于炔烃或烯烃 -复分解的金属卡宾配合物中，这样的配体通常是路易斯碱。这种配体的 典型实例包括：膦、卤化物和稳定化的卡宾。一些复分解催化剂可以采 用多种金属或金属助催化剂(例如，包含卤化钨、四烷基锡化合物和有 机铝化合物的催化剂)。

固定化的催化剂可以用于复分解方法中。固定化的催化剂是包含催 化剂和支持物的系统，所述催化剂与所述支持物结合。通过催化剂或其 任意部分和支持物或其任意部分之间的化学键或弱相互作用(例如氢 键、供体受体相互作用)，可以发生所述催化剂与所述支持物之间的示 例性结合。支持物意图包括，适合支持催化剂的任意材料。通常，固定 化的催化剂是作用于液相或气相反应物和产物的固相催化剂。示例性的 支持物是聚合物、二氧化硅或氧化铝。这样的固定化的催化剂可以用于 流动工艺中。固定化的催化剂可以简化产物纯化和催化剂回收，使得可 以更方便地重复利用催化剂。

可以在适合生成希望的复分解产物的任意条件下，进行复分解过 程。例如，可以选择化学计量学、催化剂和底物之间的配位化学、气氛、 溶剂、温度和压力，以生成希望的产物和使不希望的副产物最小化。可 以在惰性气氛下进行复分解过程。类似地，如果将烯烃试剂作为气体来 供给，可以使用惰性气体稀释剂。惰性气氛或惰性气体稀释剂通常是惰 性气体，这意味着，所述气体不会与复分解催化剂相互作用以实质上妨 碍催化。例如，具体的惰性气体选自：氦、氖、氩、氮和它们的组合。

类似地，如果使用溶剂，可以选择所选的溶剂，以对复分解催化剂 是基本上惰性的。例如，基本上惰性的溶剂包括、但不限于：芳族烃， 诸如苯、甲苯、二甲苯等；卤代的芳族烃，诸如氯苯和二氯苯；脂族溶 剂，包括戊烷、己烷、庚烷、环己烷等；和氯化过的烷烃，诸如二氯甲 烷、氯仿、二氯乙烷等。

在某些实施方案中，不使用溶剂，也可以完成复分解反应。

在其它实施方案中，可以将配体加入复分解反应混合物中。在许多 使用配体的实施方案中，将配体选择为使催化剂稳定化的分子，因而可 以提供增加的催化剂周转率。在有些情况下，所述配体可以改变反应选 择性和产物分布。可以使用的配体的实例包括：路易斯碱配体，例如， 但不限于，三烷基膦，例如三环己基膦和三丁基膦；三芳基膦，诸如三 苯基膦；二芳基烷基膦，例如，二苯基环己基膦；吡啶，诸如2，6-二甲 基吡啶、2，4，6-三甲基吡啶；以及其它路易斯碱配体，诸如氧化膦和三价 膦酸酯(phosphinites)。在增加催化剂寿命的复分解过程中，也可以存 在添加剂。

任意有用量的选择的复分解催化剂可以用于该过程中。例如，试剂 与催化剂的摩尔比范围可以是约5∶1至约10,000,000∶1，或约50∶1至 500,000∶1。

复分解反应温度可以是控制速率的变量，其中选择所述温度，以在 可接受的速率提供目标产物。复分解温度可以大于-40℃，可以大于约-20 ℃，且通常大于约0℃，或大于约20℃。通常，复分解反应温度小于约 150℃，通常小于约120℃。复分解反应的一个示例性的温度范围是约20 ℃至约120℃。

可以在任何希望的压力下进行复分解反应。通常，希望维持足够高 的总压力，以保持交叉复分解试剂在溶液中。因此，随着交叉复分解试 剂的分子量增加，更低的压力范围通常降低，因为交叉复分解试剂的沸 点增加。可以选择总压力为大于约10kPa，在有些实施方案中，大于约 30kPa，或大于约100kPa。通常，反应压力不超过约7000kPa，在有些 实施方案中，不超过约3000kPa。复分解反应的一个示例性的压力范围 是约100kPa至约3000kPa。另外，pH范围可以是约2-10。

在有些实施方案中，通过含有过渡金属和非过渡金属组分的系统， 催化复分解反应。最有活性的且最大数目的复分解催化剂系统源自VIA 族过渡金属，例如，钨和钼。

复分解催化剂在烯烃交叉复分解中的应用，会实现产物选择性和烯 烃反应性(A.Chatterjee等人，J.Am.Chem.Soc.125：11360-11370(2003))。

示例性的催化剂包括、但不限于下述的：

连续的生物精制方法

连续的生物精制方法的有用实施方案是，通过多串联催化反应从 PHA生物质衍生出的巴豆酸生产基于生物的丙烯酸和有关产物。该过程 是来自生物源的碳向用于多种用途的丙烯酸和有关产物的非常有效的 转化。

残余生物质

本文使用的“热解液体”被定义为这样的低粘度流体：其含有多达 15-20％的水，通常含有糖类、醛类、呋喃类、酮类、醇类、羧酸类和木 素类。也称作生物油，该物质通过生物质在特定温度的热解(通常快速 热解)而生成，所述温度足以将生物质的至少一部分分解成可回收的气 体和液体，所述液体在静置后可能固化。在有些实施方案中，所述足以 分解生物质的温度是在400℃至800℃之间的温度。

在其它实施方案中，所述方法包括：烘干残余生物质。在某些实施 方案中，所述烘干包括：将残余生物质维持在200℃至350℃的温度。 在其它实施方案中，所述烘干包括：将残余生物质维持在所述温度持续 10-30分钟的时间段，例如，12分钟、13分钟、14分钟、15分钟、16 分钟、17分钟、18分钟、19分钟、20分钟、21分钟、22分钟、23分 钟、24分钟、25分钟、26分钟、27分钟、28分钟、29分钟或大于30 分钟。

本文使用的“烘干”表示烘干的过程，它是本领域公知的术语，表示 生物质的干燥。该过程通常包括：在200-350℃的温度范围内加热生物 质相对较长的时间段(例如，10-30分钟)，通常在没有氧存在下。所 述方法产生烘干的生物质，其具有小于生物质的7重量％的水含量。然 后可以进一步加工烘干的生物质。

用途

从生物质(例如，巴豆酸、丙烯酸、丙烯、丁烷等)生产的基于生 物的化学制品可以用作用于多种用途的原料。例如，通过在它们的双键 处反应，可以使丙烯酸和它的酯与它们自身或其它单体(例如丙烯酰胺、 丙烯腈、乙烯基、苯乙烯和丁二烯)容易地化合，形成同聚物或共聚物， 所述同聚物或共聚物用于生产不同的塑料、造纸和涂料、木材和石工的 室外油漆、压缩板和有关建筑材料的涂料，用于絮凝矿物粉矿和废水， 和用于处理污水、印刷用油墨、内墙油漆、地板蜡、地板和墙覆盖层、 工业底漆、纺织型浸润剂，用于处理和精整、皮革浸渍和精整，和用作 石工密封胶、涂料、粘着剂、弹性体以及地板蜡和油漆。丙烯酸也用于 生产聚合材料，诸如聚丙烯酸，所述聚丙烯酸是超吸收尿布的主要组分。

同样地，丙烯是多种产物的原料，所述产物包括聚丙烯，聚丙烯是 用于包装和其它用途中的多用聚合物。它是位于乙烯之后的第二种最高 体积的石化原料。通过异丙基苯工艺，将丙烯和苯转化成丙酮和苯酚。 丙烯也用于生产异丙醇(丙烷-2-醇)、丙烯腈、氧化丙烯(环氧丙烷) 和表氯环氧丙烷。

实施例

下面的实施例进一步例证了本发明的技术，所述实施例不应当以任 何方式解释为限制性的。

实验方法

通过热解-气相色谱法-质谱法(Py-GC-MS)来测量热降解产物

为了鉴别和半定量在不同温度加热时从干燥的生物质产生的单体 化合物，使用配有Frontier Lab PY-2020iD热解器的Agilent 7890A/5975 GC-MS。关于该技术，将样品称量进钢杯中，加载进热解器自动采样器 中。当启动热解器和GC-MS时，所述钢杯被自动地放入已经设定在特 定温度的热解器中。将所述样品在热解器中保持短时间段，同时所述样 品释放出挥发物。然后使用氦气，将挥发物扫入GC柱中，在这里它们 冷凝在处于室温的柱上。在热解结束后，在特定速率加热GC柱，以便 洗脱从样品释放出的挥发物。然后使用氦气，将挥发性的化合物扫入电 离/质谱检测器(质量范围10-700道尔顿)中，用于鉴别和定量。

对于下述的实施例，使用微量天平，将200-400μg干燥的生物质称 量进热解器钢杯中。然后将所述杯加载进热解器自动采样器中。将所述 热解器程序化成加热至300-350℃的温度持续0.2-1分钟。在实施例中使 用的GC柱是Frontier Lab Ultra Alloy毛细管柱或HP-5MS柱(长度30m， 内径0.25μm，膜厚度0.25μm)。然后将GC程序化成：在5分钟内从 室温加热至70℃，然后以10℃/min加热至240℃保持4min，最后以20 ℃/min加热至270℃保持1.5min。总GC运行时间是25分钟。通过与 来自NIST质谱文库的波谱的最佳可能性匹配，鉴别出在色谱图中显示 的峰。

实施例1：通过热解表达聚-3-羟基丁酸酯的经遗传工程化的烟草来 制备基于生物的巴豆酸

在该实施例中，已经证实，加热含有聚-3HB的经遗传工程化的植物 生物质会产生基于生物的巴豆酸单体。将烟草遗传工程化成表达聚 -3HB，并在温室条件下培养，这产生含有10％的聚-3HB(基于干燥的 叶子)的植物生物质。从烟草植物取下烟草叶子，干燥至＜5重量％的水 分，并手工地研磨至＜1mm的粒度。然后将烟草叶子粉末的一部分与含 水石灰浆(Ca(OH)₂ 95％+Sigma Aldrich)相混合，并在110℃在烘箱中 干燥，然后在350℃进行Py-GC-MS。石灰在干燥的烟草生物质中的终 浓度是5重量％。图2和3显示了不含有石灰和含有石灰催化剂的烟草 的Py-GC-MS图，而表1和2列出了色谱图峰保留时间和质谱文库比对。 结果表明，在350℃，通过加热含有10％的聚-3HB的烟草所产生的主要 化合物是CO₂、醋酸和巴豆酸。前2种挥发性的化合物源自在烟草植物 中存在的多糖和半纤维素，而巴豆酸(顺式和反式)源自聚-3HB。当将 石灰加入烟草+聚-(3HB)中时，总效果是增加产生的CO₂的相对量。已 经证实，将金属离子(钾、钙和锂)加给木材会增加某些热解反应(特 别是木质素、半纤维素和纤维素的脱羧反应)的速率(G.Richards和 G.Zheng，J.of Anal.and Applied Pyrolysis，21(1991)，第133页)。这可 以解释在加入石灰催化剂以后在烟草热解过程中产生的CO₂的大量增 加。催化剂还似乎会抑制具有在9-10min区域内的保留时间的峰的产生， 所述峰被鉴别为酯和醇-型化合物。

表2.GC-MS峰保留时间和在350℃热解含有10％的聚-3HB的烟草 的过程中产生的化合物

  峰编号  保留时间(min)   峰身份   1   1.781   CO₂  2   1.852   CO₂  3   2.874   醋酸   4   3.120   1-羟基-2-丙酮   5   5.132   顺式-巴豆酸   6   6.150   反式-巴豆酸   7   6.810   2-甲基-1，3-丁二醇   8   7.200   2-羟基-3-甲基-2-环戊烯-1-酮   9   7.725   环丙基甲醇   10   9.575   环丙烷羧酸乙基酯   11   10.279   3-乙基-3-戊醇   12   12.508   2，6，10-三甲基-14-乙烯-14-十五烯   13   13.125   十六烷酸   14   14.178   亚甲基-环戊并环庚五烯化合物   15   16.003   1-乙酰基-2-吡啶基-2，3，4，5-四氢吡咯   16   17.940   二十八烷

表3.GC-MS峰保留时间和在350℃热解含有10％的聚-3HB的烟草+5％ 石灰的过程中产生的化合物

  峰编号   保留时间(min)   峰身份   1   1.779   CO₂  2   1.822   CO₂  3   2.102   CO₂  4   2.505-2.798   醋酸   5   3.091   1-羟基-2-丙酮   6   5.839   反式-巴豆酸   7   6.792   1-乙烯基吡唑   8   7.150   2-羟基-3-甲基-2-环戊烯-1-酮   9   7.712   环丙基甲醇   10   9.287   吲哚   11   9.400   2-甲氧基-4-乙烯基苯酚   12   9.637   2，6-二甲氧基苯酚   13   12.507   2，6，10-三甲基-14-乙烯-14-十五烯   14   13.117   十六烷酸

  15   14.169   十六烷酰胺   16   17.353-19.074   二十烷、三十烷、二十八烷

实施例2：木质纤维素水解、随后热解表达聚-3-羟基丁酸酯的经遗 传工程化的烟草来制备基于生物的巴豆酸

在该实施例中，描述了一种方法，其中首先加工含有聚-3HB的植物 生物质，以去除可溶性的糖类和其它组分，然后加热，以产生基于生物 的巴豆酸。在温室中生长至完全大小以后，收获烟草，所述烟草被工程 化成在植物叶子中表达10重量％的聚-3HB。收集共100g含有约10g PHA的干燥的烟草叶子，并磨碎至＜1mm的大小。然后使用稀酸和酶， 对磨碎的叶子进行标准水解操作，产生可溶性的糖类(40g)、未经鉴 别的可溶性物(20g)和残余的经干燥的生物质(40g)。通过GC来分 析残余生物质(参见Doi，Microbial Polyesters，John Wiley& Sons，1990， 第24页)，指示约8g的总PHA含量(80％的PHA回收率)。对该干 燥的残余物进行在350℃的热解GC，产生巴豆酸，回收率为90％，纯度 为＞95％(顺式和反式的组合)。

实施例3：通过热解生产聚-3-羟基丁酸酯的经遗传工程化的生物 质、随后巴豆酸复分解来制备基于生物的丙烯酸酯。

在以前的实施例中显示了如何使用生物质+聚-3HB来制备基于生物 的巴豆酸，其中加热至开始热分解聚-3HB的温度。使用交叉复分解反应， 可以将从该过程回收的巴豆酸进一步转化成有价值的化学中间体。本实 施例详述了使用多串联催化剂工艺将巴豆酸转化成丙烯酸酯的方法。

交叉复分解是2种含有不饱和碳键的反应物的偶联，在历史上已经 限于不具有任何官能团的起始化合物，诸如简单的烯烃(乙烯、丙烯等)。 现在由Materia生产(美国专利号6,620,955和7,026,495)和由Elevance 开发(美国专利申请2009/0264672)的基于钌的有机催化剂代表一种突 破性的技术，该技术允许将交叉复分解化学应用于功能分子(诸如不饱 和的植物油衍生出的脂肪酸、脂肪酸酯、羟基脂肪酸和不饱和的多元醇 酯)上。巴豆酸是这样的另一种分子(不饱和的短链羧酸)：其将自身 出借给与烯烃(诸如乙烯，包括来自乙醇脱水的生物衍生的乙烯)的这 种新的交叉复分解形式，以生成丙烯酸酯。但是，在用复分解催化剂使 乙烯单体反应时的一种挑战是，乙烯的使催化剂灭活或退化的习性，该 习性会导致低转化率和产率损失(Z.Lysenko等人(2006)，J.of  Organometallic Chem.，691，第5197页；X.Lin等人(2010)，J.of Molecular  Catalysis A：Chemical，330，第99页；K.Burdett等人(2004)， Organometallics，23，第2027页，通过引用并入本文)。当为基于生物的 化学品生产开发使用复分解催化剂的工业用途时，这是特别重要的。

本文描述了使用多串联催化过程，其中主要的复分解催化剂(下面 的催化剂编号3)没有暴露于乙烯。在该过程的第一阶段，使用本领域 技术人员已知的酯化催化剂，将巴豆酸转化成巴豆酸丁酯，但是所述催 化剂可以包括：酸、碱金属氢氧化物、烷醇盐和碳酸盐、酶和非离子型 碱诸如胺、脒、胍和三氨基(亚氨基)正膦。通过将巴豆酸转化成巴豆酰 氯，然后与醇反应，也可以进行酯化反应。后一种反应的一个优点是， 它是不可逆的。在第二阶段，使用对乙烯灭活不敏感的催化剂，诸如 Schrock的钼-亚烷基或钨-亚烷基催化剂(Schrock等人(1988)，J.Am. Chem.Soc.，110，第1423页)，可以将乙烯和2-丁烯转化成丙烯。通过 连续去除限制任何不希望的副反应的丙烯，使反应的选择性最大化。最 后，在第三阶段，使用第二代Hoveyda-Grubb的催化剂(诸如(1，3-双(2，4，6- 三甲基苯基)-2-咪唑烷亚基)二氯(邻异丙氧基苯基亚甲基)钌)，使丙烯 与巴豆酸丁酯反应，以生成丙烯酸丁酯和丙烯。这类催化剂被用于使高 度缺电子的底物在大气压下和5-30℃的温度反应。在该反应方案中，复 分解催化剂从未暴露于乙烯，因此能够维持工业生化过程所需的高反应 速率和高产率。下面显示了用于将巴豆酸转化成丙烯酸丁酯的多串联催 化反应：

上述转化的关键是，巴豆酸向酯的转化(游离的羧酸会灭活复分解 催化剂)，和使用丙烯而不是乙烯将巴豆酸丁酯转化成丙烯酸丁酯。使 用其它醇如乙醇，会生产其它丙烯酸酯。

通过第(3)阶段反应生产的2-丁烯可以用作向丁二烯转化的化学 原料，或者按照第(2)阶段反应经由与乙烯的复分解转化成丙烯。在 从可再生地生产的乙烯衍生出乙烯的情况下，得到的丙烯可以是完全基 于生物的化学制品。

为了在实验室规模进行上述反应，可以取5g含有聚-3HB的微生物 或植物生物质(诸如在实施例1中描述的)，并在大气压下在氮下在300 ℃加热。然后冷却蒸汽，将巴豆酸直接固化在保持于20℃的冷表面上(巴 豆酸熔点是70℃)。回收大约3g巴豆酸，用于随后的多串联催化，如 在上述反应中所述。图4显示的工艺流程图(PFD)描绘了从巴豆酸和 乙烯原料集成地工业化生产丙烯酸酯和丙烯，而图5显示了巴豆酸的酯 化和氢化。

实施例4：通过热解生产聚-3-羟基丁酸酯的经遗传工程化的生物 质、随后巴豆酸直接氢化来制备基于生物的丁醇。

下述实施例描述了从含有聚-3HB的生物质制备基于生物的巴豆酸， 然后经由氢化，将巴豆酸转化成基于生物的丁醇。在大气压下在氮下， 将5g含有聚-3HB的微生物或植物生物质加热至300℃。冷却产生的蒸 汽，将巴豆酸直接固化在保持于20℃的冷表面上(巴豆酸熔点是70℃)。 回收大约3g巴豆酸，用于随后的氢化。给50mL高压灭菌器装入5g水、 2g巴豆酸和0.3g在美国专利号6,495,730的实施例3中公开的Ru-Sn-Pt 催化剂。在用氮冲洗高压灭菌器以后，导入氢气，随后将高压灭菌器加 压至20巴，并升高温度至180℃。在达到目标温度以后，将该反应器进 一步加压至150巴，允许氢化反应进行6小时。在反应结束后，冷却反 应器，并减压，随后用氮冲洗。卸载高压灭菌器内容物，并通过倾析分 离出催化剂。用额外的去离子水洗涤催化剂，并将洗液加入上清液中。 过滤上清液的等分试样，并通过HPLC进行分析，以测定巴豆酸的百分 比转化率和丁醇的百分比产率(基于摩尔)。或者，上述氢化的进料可 以是巴豆酸酯，如在实施例3中形成的巴豆酸丁酯。所述巴豆酸丁酯然 后在氢化以后形成2摩尔的丁醇。该反应如下所示：

氢化反应：

图5显示了经由巴豆酸的氢化和酯化来生产丁醇的集成工业过程。

实施例5：通过热解生产聚-3-羟基丁酸酯的经遗传工程化的生物质、 随后催化氧化来制备基于生物的马来酸酐。

本实施例显示了如何通过催化氧化从基于生物的巴豆酸制备基于 生物的马来酸酐(MAN)。在大气压下在氮下，将5g含有聚-3HB的微 生物或植物生物质在300℃加热。冷却产生的蒸汽，将巴豆酸直接固化 在保持于20℃的冷表面上(巴豆酸熔点是70℃)。回收大约3g巴豆酸， 用于随后的氧化。通过液体转子流量计，用泵将巴豆酸输送至电加热的 汽化器的顶部，在这里接触空气，穿过单独的转子流量计送料至汽化器 的底部。汽化器运行在150℃至200℃，并装有不锈钢丝以确保良好的 热量传递和有效的汽化，并混合巴豆酸和空气。然后将所述混合物送至 电加热的预热器，所述预热器也装有不锈钢丝，并加热至250℃至300 ℃。将蒸汽流送至固定的催化剂床，该床由被五氧化钒浸透的1/8氧化 铝颗粒组成(更详细地描述在，Church，J.M.和Bitha，P.，“Catalytic air  oxidation of crotonaldehyde to maleic anhydride”，I&EC Product Research  and Development，Vol.2(1)，1963，第61-66页)，并装在夹套式反应器 罐内。电加热反应器进行升温，并使用循环的热量传递油进行冷却，以 维持反应器条件。将尾气送料至水冷却的旋风分离器，以允许马来酸酐 和巴豆酸冷凝。然后在填料塔中吸收任何未冷凝的且仍然存在于轻质气 体中的产物，并使用循环的冷水作为直接接触的洗涤液体。在运行结束 时，收集来自旋风分离器和洗涤液体的液体产物，并分析，以计算MAN 产率(作为理论百分比)和巴豆酸的转化率。图6更详细地显示了将巴 豆酸转化成马来酸酐的过程的示意图。

实施例6：从生产聚-5HV的经遗传工程化的微生物制备δ-戊内酯。

使用在WO 2010/068953中描述的方法，通过发酵过程，制备含有 聚-(5-戊内酯)(聚-5HV)的微生物生物质。将经遗传修饰的大肠杆菌菌 株专门设计成，从作为碳补料源的葡萄糖浆生产聚-5HV。在发酵结束后， 将100g发酵液(例如P5HV生物质)与含有10重量％石灰(Ca(OH)₂ 95+％， Sigma Aldrich)的水性料浆相混合。然后使用红外热天平(MB-45 Ohaus 水分分析仪)在150℃在铝称重盘中加热发酵液+P5HV+石灰混合物的 2g部分至恒重。剩下的残余水＜5重量％。在干燥的发酵液中的最终石灰 浓度是50g石灰/kg干固体或5重量％。还制备了仅含有干燥的发酵液 +P5HV(没有加入石灰)的样品。然后，在300℃的热解温度，通过 Py-GC-MS来分析样品。

图7和8分别显示了干燥的发酵液+聚-5HV以及干燥的发酵液+聚 -5HV+5％石灰的GC-MA色谱图。在色谱图中，也列出了与主要的GC 峰相对应的化合物。在300℃从样品产生的次要化合物包括：CO₂、醋酸、 乙醛和水，它们在开始GC色谱图时看到。在将样品加热至300℃时产 生的主要化合物是：在保留时间8.7分钟时的戊内酯(标记为戊酸)， 和在6.3分钟时的杂质(经鉴别为糠醇)。聚-5HV是戊内酯化合物的来 源，未代谢的糖可能是糠醇的来源。经证实，将石灰催化剂加入生物质 +聚-5HV中会抑制糠醇以及在14-18分钟的一组未鉴定的峰的产生。也 证实了糠醇的产生依赖于用于反应性热解的温度。例如，当在250℃进 行所述加热时，从干燥的发酵液+聚-5HV产生的糠醇远远小于在300℃ 时。

实施例7：从热解植物衍生的聚-3-羟基丙酸酯制备基于生物的丙烯 酸。

在该实施例中，显示了通过热解聚-3-羟基丙酸酯(聚3-HP)的植 物生物质来源来制备丙烯酸的可行性。

通过发酵来制备聚-3HP，所述发酵使用经遗传修饰的大肠杆菌菌 株，该菌株专门设计用于从作为碳补料源的葡萄糖浆生产聚-3HP。大肠 杆菌菌株、发酵条件、培养基和补料条件的实例描述在：美国专利号 6,316,262、6,323,010、6,689,589、7,081,357、7,202,064和7,229,804。 使用加热至75℃的甲基丙基酮，从微生物生物质进行聚-3HP的溶剂提 取。然后将冷的庚烷加入该溶液中，以沉淀出聚-3HP。然后过滤沉淀物， 用甲醇洗涤，并真空干燥过夜。在温室条件下培养在美国专利公开号US  2009/0271889 A1中描述的野生型柳枝稷，在衰老的叶子变成褐色以后 进行收集，并在植物上干燥。然后将叶子与含有碳酸钠(Na₂CO₃，99.5+％， Sigma Aldrich)或水合的硫酸亚铁(FeSO₄·7H₂O，JT Baker，222 Red  School Lane，Phillipsburg，NJ 08865)的10重量％水溶液相混合。可用于 将3HP转化成丙烯酸的不同催化剂描述在美国专利号2,361,036中。在 混合以后，再在110℃干燥柳枝稷+催化剂混合物，并使用Spex Sample  Prep 6870 Freezer Mill进行冷研磨。最终的粒度是＜0.5mm。

通过Py-GC-MS，分析干燥的柳枝稷+催化剂+聚-3HP样品，以便鉴 别出在有植物生物质存在下在300℃热解聚-3HP过程中生成的化合物。 为了制备热解样品，首先将聚-3HP溶解在氯仿中至5重量％，并逐滴加 入热解自动采样器钢杯中。然后将柳枝稷+催化剂干燥的混合物加入该 杯中，并在真空下蒸发出氯仿。聚-3HP在经干燥的生物质混合物中的重 量百分比目标是20％，而催化剂的目标是干燥的生物质的5重量％。也 制备了仅含有20重量％的柳枝稷和聚-3HP的热解样品杯，并为了对比 目的进行分析。

图9显示了不存在催化剂的柳枝稷+聚-3HP的Py-GC-MS色谱图。 从聚-3HP产生的主要目标峰是，在3.7分钟的丙烯酸和在9.3分钟的丙 烯酸二聚体。图10和11分别显示了含有Na₂CO₃和FeSO₄催化剂的柳 枝稷+聚-3HP的Py-GC-MS色谱图。在热解聚-3HP过程中生成丙烯酸二 聚体不是意外的，因为丙烯酸在高温是很有反应性的，甚至在有聚合抑 制剂存在下。但是，已经发现，与碳酸钠催化剂相比，在有水合的硫酸 铁催化剂存在下，可以更有效地使丙烯酸二聚体的产生最小化。还发现， 更高的热解温度会使丙烯酸二聚体产生最小化。

实施例8：从热解生产聚-羟乙酸的经遗传工程化的微生物来制备乙 交酯。

预期在300℃热解过程中将过量的金属盐加入含有PHA生物聚合物 聚-羟乙酸(PGA)的发酵液中具有相同的效果，如在实施例6中关于聚 -5HV所证实的。当在约200℃至约350℃热解PGA时，会在该聚合物 的ω-OH链末端处解链PGA，以形成乙交酯单体或二聚体组分。

可以在本文没有明确公开的任意一个或多个要素、一个或多个限制 不存在下，适当地实践本文示例性地描述的实施方案。因而，例如，术 语“包含”、“包括”、“含有”等应当广阔地且无限制地解读。另外，本文 采用的术语和表述已经用作描述性的、而不是限制性的术语，在这样的 术语和表述的应用中，无意排除显示的和描述的特征的任何等效物或其 部分，但是应当认识到，不同的改进可能是在要求保护的技术的范围内。 另外，短语“基本上由......组成”应当理解为包括明确列出的那些要素和 不会实质上影响要求保护的技术的基础的且新颖的特征的那些额外要 素。短语“由......组成”排除没有指出的任何要素。

本公开内容不受在本说明书中描述的具体实施方案的限制。本领域 技术人员会明白，可以做出许多修改和变化，而不脱离它的精神和范围。 除了本文列出的那些以外，本领域技术人员从前述描述会明白在公开内 容的范围内的功能上等效的方法和组合物。这样的修改和变化意图落入 所附权利要求书的范围内。本公开内容仅由所附权利要求书以及这些权 利要求的等同方案的完整范围进行限制。应当理解，本公开内容不限于 具体的方法、试剂、化合物、组合物或生物系统，它们当然可以变化。 还应当理解，在本文中使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，无 意进行限制。

另外，在以马库西组(Markush group)的方式描述公开内容的特征 或方面的情况下，本领域技术人员会认识到，也由此以马库西组的任何 单个成员或成员亚组的方式描述了公开内容。

在本说明书中提及的所有出版物、专利申请、授权的专利和其它文 件，都通过引用并入本文中，如同具体地且单个地指出每篇出版物、专 利申请、授权的专利或其它文件通过引用整体并入。在通过引用并入的 内容中含有的定义在下述情况下被排除：如果它们与在本公开内容中的 定义相矛盾。

在本文中引用的所有专利、公开的申请和参考文献的教导通过引用 整体并入。

尽管已经参照其实施例实施方案具体地显示和描述了本发明，本领 域技术人员会理解，在其中可以做出形式和细节的不同变化，而不脱离 由所附权利要求书包括的本发明的范围。