一种多模态成像微气泡构造、制备方法及用途

摘要

本发明涉及化学工程、材料及纳米医药的交叉领域，具体是一种多模态成像探针构建及其制备方法。本发明所述多模态成像探针为含壳核结构微气泡，壳膜材料由可生物降解、生物相容性良好的高分子材料及磷脂材料组成，中心包埋不同荧光特征的水溶性量子点溶液，充入全氟碳烷气体，应用双乳化-冷冻干燥充气方法制备粒径可控、分散性好且稳定易保存的多模态探针。本发明微气泡为网状内皮系统特异性对比剂，不仅能荧光成像，且能实现增强超声显像和MRI显像，微气泡多模式成像，具有广阔的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学、材料及纳米医药的交叉领域，具体涉及一种多模态 靶向成像微气泡构建、制备方法及用途。

背景技术

随着医学影像学的发展，各类造影剂在临床中的应用也越来越广泛。造影 剂能够增加组织对比度，提高影像定性定位的能力，提高诊断正确率。目前， 各种成像技术均有各自的造影剂，如用于超声成像的微泡造影剂，用于CT成像 的碘造影剂，用于磁共振成像的Gd-DTPA及超顺磁性氧化铁等。同一病人为明 确诊断，常常需在短期内接受大量、多种造影剂，不但加重了机体代谢负担以 及造影剂副反应发生的风险，也增加了医疗费用，因而，临床上迫切需要一种 能同时用于多种成像技术的造影剂，即多功能造影剂。国内外学者已经对多功 能造影剂进行了相关研究，超声成像与磁共振成像、核素显像、荧光成像联合 以及荧光成像与核素显像联合的造影剂已陆续被报道，但能同时用于超声、荧 光及磁共振成像的造影剂尚未见报道。

超声成像是一种常用的临床诊断方法，以其快速、安全、廉价、便携等特 性，在世界范围内得到广泛的应用。但由于超声诊断方法本身的限制，超声成 像的分辨率和准确性远远不能满足先进临床诊断的要求。超声对比剂可以显著 增强医学超声诊断信号，得到比普通超声成像更丰富、更准确的诊断信息，为 疾病的诊断治疗提供更多依据。应用于科研和临床上最多的超声造影剂为微泡 (MBs)对比剂，它由外层包膜壳层(磷脂、表面活性剂、高分子等)和内部包 裹的气体(空气、氮气、全氟化碳、六氟化硫等)组成。

Gd-DTPA(Magnevist)是临床使用的一种磁共振成像剂，稳定性好，且磁 学性质优良。然而近年来发现Gd-DTPA会引起肝细胞慢性纤维化，有些国家已 停止使用。能否在保持Gd-DTPA优良性能的同时又能从体内顺利排出是新的策 略，如：使Gd-DTPA分子与蛋白、糖类连接及用适宜高分子微球包裹等修饰， 取得较好的进展。

量子点(quantumn dots QDs)是作为一种半导体荧光纳米颗粒，由于其优 良的光学特性，近年来是纳米生物医学领域的一个研究热点。一般由第二族和 第六族元素或第三族和第五族元素构成。量子点具有很宽的吸收峰范围，窄而 对称的发射波长，较大的斯托克斯位移，较高的量子产率以及很强的抗光漂白 性，具有传统有机荧光物质不可比拟的光学特性。近年来国际一些著名刊物不 断报道量子点在生物医学及纳米医药领域的应用研究，量子点应用已经逐渐渗 透到生物医学的各个领域，包括细胞生物学，分子生物学、蛋白组学及纳米探 针，成为了一种理想的体外和体内细胞/组织荧光成像诊断试剂。如何快捷， 低成本的获得，高产率、毒性小的量子点微球是生物医学应用领域急待解决的 问题。不同特性、不同功能量子点微球及微气泡具有极高的研究价值和应用前 景。

发明内容

本发明针对不同成像技术需使用不同造影剂，不仅增加机体代谢负担，以 及造影剂副反应的问题，提供一种多模态超声成像剂，以期实现“一探针多功 能”的目的，本发明还提供制备所述微气泡的方法。

为达到上述目的，本发明所提供的技术方案是这样的：

一种多模态成像微气泡，为壳核结构，所述壳核结构的壳膜材料由高分子 聚合纳米材料和磷脂组成，核材料为水溶性量子点和惰性气体，所述水溶性量 子点为巯基丙酸修饰的碲化镉，粒径半径为3.2-9.0nm。

制备所述多模态成像微气泡的方法，包括以下步骤：

步骤一、将磷脂与含有端羧基的高分子聚合材料按1∶8.75-9.25的摩尔比 溶解于二氯甲烷溶剂中，然后加入水溶性量子点，声振35-45s得到初乳液；将 所述初乳液与浓度为3％-5％的聚乙烯醇溶液混合，并在转速为2000-10000r/min 的均质机中分散均质作用5min，得到微球复溶悬液，再加入浓度为2％-4％的异 丙醇溶液，在室温下搅拌2-5h，经离心漂洗，收集下层微球，并将收集到的微 球经冷冻干燥后充入惰性气体即得到呈冻干粉状多模态成像微气泡。

进一步，所述惰性气体为八氟丙烷。

进一步，所述壳膜上设有通过化学共价偶联法-酰胺键连接的特异性靶向配 体。

进一步，所述高分子聚合材料为端基为羧基的由乳酸、羟基乙酸聚合后的 均聚物或共聚物。

进一步，所述特异性靶向配体包括具有游离氨基的抗体、小分子复合物或 适配子。

进一步，所述磷脂为甘油磷脂。

进一步，还包括步骤二、取步骤一制得多模态成像微气泡冻干粉于无核糖 核酸酶脱氧核糖核酸酶水溶液或PH＝6.0的MES-TRIS缓冲液中溶解，并加入偶 联活化剂EDC/NHS，采用冰浴或摇床恒温孵育30～45min，然后将所述PH＝6.0 的MES-TRIS缓冲液离心漂洗三次，并限定离心转速为3000r/min，用以去除微 气泡中未反应的EDC/NHS，将离心漂洗后所得的微气泡溶解到无核糖核酸酶脱氧 核糖核酸酶水溶液或PH＝8.0的MES-TRIS缓冲液中，并加入靶向配基混匀低温 孵育2-4h；再用所述无核糖核酸酶脱氧核糖核酸酶水溶液或PH＝8.0的MES-TRIS 缓冲液离心漂洗三次，收集的微气泡即为多模态靶向成像微气泡。

所述多模态成像微气泡具有用于制备MRI对比剂的用途。

本发明用双乳化冷冻干燥法成功制备包埋量子点微气泡，其性质稳定，易 于贮存；合成工艺简易，所需材料简单，价格低廉，耗时少，便于批量生产。

本发明所述的多模态成像微气泡，细胞毒性小，具备荧光成像功能，同时 不仅能增强超声显像，在不添加现有公开的MRI成像材料的前提下而且还能够 用作MRI对比剂，体内外均具有显像效果，而体外加有靶向抗体或小分子复合 物的多模态成像微气泡显像效果尤为显著。

本发明所述的多模态成像微气泡，能初步实现靶向肿瘤的显像。

不同于传统超声微泡造影剂、磁共振Gd-DTPA造影剂，荧光成像剂，本发 明所述的多模态成像微气泡，在体内循环半衰期长，经静脉注射后，被网状内 皮系统细胞吞噬，从而实现肝、脾等脏器的持久被动靶向强化，便于病变的重 复检查、动态监测以及疗效评估等。偶联靶向配基的多模态成像靶向微气泡更 使得肿瘤的早期诊断、及时治疗成为可期之事。

将靶向配基化学共价发偶联到壳膜上，增强了靶向微泡的抗血流剪切能力， 这样在显像同时可以利用超声特有的空化效应，实现靶区肿瘤的清晰定位，将 包裹药物靶向定位释放。

壳膜材料由高分子聚合纳米材料和磷脂组成，虽然磷脂材料的超声造影效 果明显优于高分子聚合纳米材料，但结构稳定性比高分子聚合纳米材料相对要 差，由于本发明的水溶性量子点为毒性物质，出于安全性考虑，故在膜材料中 加入了相对稳定的高分子聚合纳米材料。但是这需要一定的比例控制，应当以 高分子聚合纳米材料为主(又不能完全是高分子聚合纳米材料，这样超声显影 效果较差，脂质量多了，又会影响整体壳膜结构的稳定性)，本发明申请中高 分子聚合纳米材料与脂质的摩尔比控制在8.75-9.25∶1。

附图说明：

图1Malvern激光分析仪检测多功能超声造影剂的粒径图；

图2多模态微气泡的透射电镜图像(80KV×9800)和扫描电镜图像 (1.0Kv-D7.9mm x10.0k)对照图；

图3多模态微气泡体内MRI显像对照图。左图注射本发明多模态非靶向微 气泡1min后SD大鼠肾脏造影，右图注射普通微泡1min对照，中图是仅注射 量子点溶液的1min对照，图中箭头所指的位置为SD大鼠的肾脏位置；

图4多模态微气泡体外MRI显像对照图，图中MB表示普通的微泡，MB_QDS表示 本发明所保护的包封有量子点的非靶向微泡造影剂MB_QDS-T表示本发明所保护 的包封有量子点的靶向微泡造影剂；

图5多模态微气泡增强裸鼠荷瘤声像对照图，图5a为注射造影剂前肿瘤超 声成像图，图5b为注射非靶向微气泡造影剂1min后超声成像图；图5c为注射 靶向微气泡造影剂1min后超声成像图；

图6多模态微气泡荧光成像对照图，左图小动物活体白光模式下荧光成像， 右图为小动物活体黄光(波长485nm)模式下荧光成像；

图7是多模态微气泡超声成像对照图，左图为壳膜材料完全为高分子聚合 纳米材料PLGA时的超声显像图，右图为高分子聚合纳米材料与脂质的摩尔比9∶ 1时组成壳膜材料时的超声显像图。

具体实施方式：

下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，但本发明的内容不限 于所举的实施例

本发明下述实例所用高分子聚合纳米材料PLGA均为乳酸∶羟基乙酸＝50∶50， 分子量为12,000的高分子聚合物，高分子聚合纳米材料与脂质的摩尔比9∶1， 水溶性量子点为巯基丙酸修饰的碲化镉，粒径半径为5.1nm。

实施例1本发明多模态微气泡的制备

电分天平称取50mg PLGA(50∶50，MW 12,000)，0.15mg PE溶于2ml二 氯甲烷溶剂中，全溶后加入100μl水溶性量子点，声振35-45s得初乳液(W/O)； 将初乳液与6ml 4％聚乙烯醇溶液混合，并在9600r/min的分散均质设备中作用 5min，得到微球(W/O/W)，加入5ml 2％异丙醇溶液，室温磁力搅拌机匀速搅拌 2-5h，使微球表面固化，二氯甲烷尽量自然挥发。将上述液体分装入5ml离心 管中，高速离心(3500rpm，5min)弃上清液。重新加入适量双蒸水，用旋涡混 合仪充分混匀、洗涤、离心，弃上清液。共洗涤、离心5次。收集下层液体约 2ml。将盛有PLGA微球的离心管加入适量双蒸水，旋涡混合仪充分混匀，置-20 ℃冰箱中冷冻30min。置-50℃真空冷冻干燥机中真空冷冻干燥48h，充入全氟 丙烷气体得白色粉末状包裹量子点的PLGA_QDs微气泡。称重后将其置4℃冰箱中保 存、备用。

光镜下观察可见该纳米粒呈球形，大小均匀，形态规则，分散较好；Malvern 激光分析仪测得纳米粒粒径为(662±20.5)nm，分布窄(图1)；透射电镜可见 CdTe纳米颗粒分布在纳米粒核内(图2左)。扫描电镜显示双乳化-冷冻干燥法 制得了有微孔纳米粒(图2右)。冻干粉样品放置4℃冰箱贮存，几周后复溶， 光镜下观察形态、大小及其分布均没有明显的改变，荧光强度无改变，光稳定 性很好。

实施例2A10-PLGA_QDs靶向微气泡的偶联实验

取实施例1中制得的白色粉末状PLGA_QDs微气泡溶解于浓度为10μg/μL的 无核糖核酸酶脱氧核糖核酸酶水溶液(Dnase RNase-free water)中，并加入 400μL EDC/NHS(4∶1摩尔比)，采用恒温孵育摇床孵育45分钟。被NHS活化的 微气泡悬浮液经过三次缓冲液的离心漂洗(离心转速为3000r/min)后，再溶解 到浓度为1μg/μL Dnase RNase-free water中，并加入50μL 3’-NH2修饰 的A10PSMA aptamer，低温孵育2-4h，再用无核糖核酸酶脱氧核糖核酸酶水 溶液离心漂洗三次，得到A10适配子与微气泡共价偶联产物，并且以悬浮液形 式保存。流式细胞仪和荧光显微镜检测0.5mg/mL 3’-NH2修饰的A10PSMA和 PLGA_QDs-COOH微气泡偶联产物A10-PLGA_QDs。

所述三次以及多次离心漂洗是指加缓冲液溶解进行离心处理后去上层清 液，再加缓冲液溶解进行离心……，以此项操作的次数，来论定离心漂洗的次 数。选用的靶向配基为抗体、小分子复合物或适配子均可以采用MES-TRIS缓冲 液等同替换本实施例中的Dnase RNase-free water，但由于适配子属于核酸，选 用Dnase RNase-free water作为缓冲液会更为合适。

实施例3本发明所述多模态微气泡的体内MRI显影实验

SD大鼠经3％戊巴比妥钠(1ml/kg)腹腔注射麻醉后，使用临床GE 3.0T 超导型磁共振仪扫描，使用内部磁场较均匀的头部正交圈扫描，SE序列，T1W1， 参数：TR/TE＝824ms/10ms，视野FOV＝80mm*80mm。采用体重为220g两只大鼠对 照方法，造影时按5ml/kg剂量经大鼠尾静脉注射实施例1制备的多模态微气 泡PLGA_QDs和空白微气泡PLGA，观察肝及肾脏造影后的显像时间和显像效果(如 图3所示)，可以明显看出本发明所保护多模态非靶向微气泡具有制备MRI对 比剂的用途，可预见性地本发明所保护多模态靶向微气泡也应当具有制备MRI 对比剂的用途。

实施例4本发明所述多模态微气泡的体外靶向MRI显影实验

将卵巢癌细胞SKOV3种植六孔板，编号后滴入已经制备的靶向微气泡 RGD-PLGA_QDs(2孔)，非靶向微气泡PLGA_QDs(2孔)，空白微气泡PLGA(没有包 埋量子点)的盐水溶液为对照背景(2孔)，室温孵育30min，适量生理盐水冲 洗三次，将三组(各2孔)细胞消化转移至3只EP管中制成细胞悬液，使用临 床GE 3.0T超导型磁共振仪扫描，使用内部磁场较均匀的头部正交圈扫描，SE 序列，T1W1，参数：TR/TE＝112ms/20ms，视野FOV＝160mm*160mm，见图4，多模态 显像靶向微气泡与细胞特异性识别结合，与非靶向和空白背景微气泡细胞孵育 体系比较信号强很多，既说明抗体与微气泡的成功联接也表明该多模态微气泡 还可用作MRI阳性对比剂，其中空白背景微气泡细胞孵育体系的信号效果几乎 不可见。由于靶向的效果，使得微气泡在特定位置相对集中，使得多模态靶向 成像微气泡与非靶向相比较信号强很多，但从本质上依然证明了本发明所保护 多模态非靶向与靶向微气泡均具有制备MRI对比剂的用途。

在食品检测、法医鉴定(如死因鉴定)、医务教学以及相关组织的体外鉴定 方面，多模态显像靶向微气泡均具有制备MRI对比剂的用途。

实施例5多模态微气泡体内靶向超声增强显影和荧光显影实验

取对数期生长的SKOV3细胞用1640培养液稀释成浓度为5×10⁷/ml细胞悬 液，与雌性BALB/c裸鼠背臀部皮下注射细胞悬液300μl，8只，建立荷瘤模型， 待肿瘤长至1.0-2.0cm进行显像实验。尾静脉随机注射靶向微气泡RGD-PLGA_QDs和非靶向微气泡PLGA_QDs150-200μl，用Philips iU22彩色多普勒超声诊断仪 (L12-5探头，探头频率7-13MHz)超声增强显像。结果注射造影剂即刻，肿 瘤未见有明显增强，于注射后0.5min，注射靶向微气泡RGD-PLGA_QDs裸鼠肿瘤 周边组织开始出现增强，并于注射后1min左右达到高峰，持续约15min(图 5)。同时用小动物在体荧光成像仪进行荧光成像，注射靶向微气泡RGD-PLGA_QDs 后1min左右到15min，裸鼠肿瘤周边组织可持续观察到荧光，而对照组荧光 在相同时间不易观察(图6)。

上述实施例表明本发明所述多模态成像微气泡能增强肿瘤超声显像并且同 时实现荧光成像、MRI成像。因此，本发明所述超声造影剂有广阔的应用前景。

本发明的实施例表明，本发明所述多模态微气泡主要为网状内皮系统特异 性对比剂，体内稳定性高，循环半衰期长，能实现肝、脾等脏器的持久被动靶 向强化，能同时增强超声、MRI显像；连接靶向配基后具有一定的主动靶向性， 对肿瘤等疾病的诊断，病变动态监测以及疗效评估有潜在的应用价值。

本发明的壳膜材料选高分子聚合物与脂质混合，而不是单独由高分子聚合 物组成，如图7所示，单独由高分子聚合物组成的壳膜其超声显影效果明显不 及本发明所公开的高分子聚合纳米材料与脂质的摩尔比9∶1时的超声显影效果。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，在不脱离本发明原理的前提 下，还可以做出若干改进和润饰，如采用其他特异性配体，其他比例(例如乳 酸∶羟基乙酸＝75∶25)的高分子聚合物、水溶性量子点粒径半径还可以为3.4、 5.8、7.6、8.9nm这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。另外水溶性量子 点选用巯基丙酸修饰的碲化镉的原因是归究于实验条件限制，本发明尚无法得 出其他水溶性量子点构造上等同替换后，并无法实现本发明多模态成像微气泡 同等效果的结论，另外限定巯基丙酸修饰的碲化镉粒径半径为3.2-9.0nm，是经 过多次实验发现，高于10nm或低于2nm的基丙酸修饰的碲化镉其MRI显像效果， 与空白对照的显像效果基本一致，故特别限定粒径为3.2-9.0nm的巯基丙酸修 饰的碲化镉作为本发明的优化选择。