使用在线监测进料速率控制和过程终止在生物质中积累聚羟基烷酸酯的方法

摘要

用于在生物质中产生聚羟基烷酸酯(PHA)的方法或过程。该过程包括将含有有机碳的基质进料至富含积累PHA的细菌的生物质。特别地所述过程包括在所选的时间内至少单独三次将基质间歇供应至生物质。该过程的目的是产生具有相对高分子量的PHA，所述分子量至少为400,000g/mol。通过控制将基质供应至生物质的频率以及通过将足够量的基质进料至生物质，所述方法或过程产生具有相对高分子量的PHA。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求以下美国临时申请的优先权：2009年12月10日提交的申请序列号61/285,210。该申请通过引用以其整体结合到本文中。

技术领域

本发明涉及与生物学有机废物处理结合的在生物质中聚羟基烷酸酯(PHA)的积累。本发明涉及以下技术：将富含可容易生物降解的化学需氧量(RBCOD)的废水与富含积累PHA的细菌(PAB)的生物质混合，并监测该过程。

发明背景

聚羟基烷酸酯(Polyhydroxyalkanoate, PHA)为可配混成为工程塑料或进一步转化为其它平台化学品的生物聚合物，且具有完全可生物降解的附加益处。PHA积累可用作用于废水处理过程的生物精炼厂总体构思的一部分，所述过程包括：

I. 在废水流入液中有机材料的生酸发酵，以产生挥发性脂肪酸(VFA)；

II. 从废水去除有机物质和从废水或其它合适的来源产生生物质，且可能显著积累PHA；

III. 在由富含RBCOD的进料产生的生物质中产生和积累PHA，所述进料获自废水或其它就地或厂外(on- or off-site)流入液来源；和

IV. 回收和纯化PHA。

本发明可用于解决与在富含PAB的生物质中PHA积累和废水处理的过程质量目标相关的多个问题，如以下进一步说明的。

发明概述

本发明提供在富含PAB的生物质中由RCBOD产生和积累PHA的方法。

在一方面，本发明提供了用于在生物质中产生聚羟基烷酸酯(PHA)的方法，所述方法包括在一段时间内，通过将基质(substrate)间歇供应至生物质，将含有有机碳的基质进料至生物质；和控制将基质间歇供应至生物质的频率和将基质间歇供应至生物质的量，使得产生的PHA的平均分子量为至少400,000 g/mol。

在另一方面，本发明提供了促进生物质中PHA积累的方法，所述方法包括通过将含有可容易生物降解的化学需氧量(RBCOD)的基质与生物质混合以形成生物质-基质混合物，将含有有机碳的基质进料至生物质；控制生物质-基质混合物中RBCOD的浓度，使得在PHA积累期间，生物质-基质混合物中RBCOD的浓度通常保持在1,000 mg-COD/L至10 mg-COD/L之间，并且其中将RBCOD进料至生物质和控制生物质-基质混合物中RBCOD的浓度的方法产生平均分子量超过400,000 g/mol的PHA。

在第三方面，本发明提供了在生物质中产生高分子量PHA的方法，所述方法包括在一段时间内，通过将基质间歇供应至生物质，将含有有机碳的基质进料至积累PHA的生物质；和控制基质供应的频率和量，使得相对于最大呼吸速率，生物质的呼吸速率下降不多于70%，所述最大呼吸速率通过生物质对最近供应基质的响应而实现。

附图简述

图1。对于对富含VFA的进料刺激的生物质响应，关于经验模型(方程式1)的6个研究的归一化实验数据。

图2。在用于在富含PAB的生物质中积累PHA的实验中，用脉冲以实现100 mg-COD/L的VFA的恒定刺激，用于控制自动化基质添加(方程式3)的代表性溶解氧(DO)浓度信号。

图3。重复积累实验的结果，所述实验使用浓缩的发酵乳品废水作为用于PHA的补料-分批(fed-batch)积累的基质。

图4。重复积累实验的结果，所述实验使用浓缩的发酵乳品废水作为用于PHA的补料-分批积累的基质。

图5。使用发酵乳品工业废水作为用于PHA的基质，在富含PAB的活性污泥中PHA积累的典型溶解氧趋势。

图6。参考图5，显示在补料-分批输入点的实际δ_t值以及关于对于相应的基质输入实现的最大速率的相关最小脉冲呼吸速率。

图7。众多实验的积累结果的汇总，其考虑关于现存的最大脉冲呼吸速率报告的经估计的所得平均脉冲最小呼吸速率以及积累PHA的重均分子量。

图8。使用发酵的乳品工业废水作为基质，在富含PAB的生物质中PHA的中试规模(100 L)积累的代表性结果。

图9。可变体积需氧PHA积累过程的代表性实例。

图10。可变体积需氧PHA积累过程的代表性实例。

图11。恒定体积需氧PHA积累过程的代表性实例。

发明详述

本发明包括用于生物质中PHA积累过程的新型但实用的工程方案。通过采用本发明，可满足的目标包括：

· 当进料基质(例如具有高、中等和低浓度RBCOD的废水)时，刺激、维持和控制PHA积累响应；

· 控制生物质中的PHA聚合过程，以实现高PHA分子量；

· 生物质中所具有PHA的饱和或近饱和，其中饱和限定生物质中PAB的最大储存容量；和

· 在积累过程结束，保留在废水中的残余RBCOD和其它溶解的有机物质的最低水平。

废水通常表征为就化学需氧量(COD)而言的有机含量。废水的总化学需氧量(TCOD)可进一步通过标准方法分类为可溶性(SCOD)和可生物降解的(BCOD)级分。RBCOD在废水中形成部分可溶性COD，并且通常可认为是包含在无需水解的插入步骤下可被吸收用于生物质生长的BCOD的那些有机化合物。TCOD、SCOD、BCOD、RBCOD等在废水中的相应的浓度可报告为mg-COD每升或mg-COD/L，其中直接参考考虑的有机含量的组分来报告COD的质量。微生物活性和其它形式的物理-化学过程可用于提高废水TCOD的可溶性、可生物降解的和甚至RBCOD级分。当废水被适宜地表征并且RBCOD的化学身份已知时，则可明确地表示废水的RBCOD含量，例如，表示为测量的总VFA(mg-COD/L)。RBCOD还可通过呼吸测量(respirometry)的标准化方法在操作上确定，所述呼吸测量考虑当在受控的条件下将等分试样的废水脉冲进料至生物质时，被生物质快速利用的废水COD级分(Henze等人，2000)。基于呼吸测量方法的RBCOD的这种操作测量结果可依如下而变：生物质如何适应在其它情况下通常可认为是容易被吸收至生物质生长代谢(例如RBCOD)的有机化合物。本发明的目的RBCOD为这样的RBCOD，当其与适宜适应的生物质组合时可被该生物质吸收并在细胞内作为PHA储存。

废水中的RBCOD级分通常占优势的为VFA。VFA是用于生产PHA的充分建立的基质，但亦已知其它形式的RBCOD是混合培养物可转化为PHA的基质。本发明包括通常由VFA和RBCOD产生PHA。

本发明还提供了用于生物学去除RBCOD的补料-分批废水处理方法，所述方法使用富含积累PHA的细菌的生物质和将RBCOD受控转化为PHA来进行。控制向生物质中添加废水，以便在积累过程结束时，混合液中RBCOD的积累达到可忽略程度。

混合液通常理解为在生物学废水处理的实践中熟知的混合液，其作为在活性污泥法中包含在曝气池中的未净化或沉降的废水和活性污泥的混合物。混合液悬浮固体(MLSS)为通过标准方法测定的总悬浮固体(TSS)在混合液中的浓度，通常用毫克每升(mg/L)表示。混合液挥发性悬浮固体(MLVSS)为通过标准方法测定的挥发性悬浮固体(VSS)的浓度，也用mg/L表示。就本发明的目的而言，术语混合液用于表示积累过程的液体含量，包括但不限于活性生物质的悬浮固体和RBCOD的溶解固体。由于在本发明的实践中生物质可为来自生物学废水处理过程的废活性污泥，所以将积累过程的混合液视作并表示为混合液，即使在为了PHA积累的目的而加入任何RBCOD之前。

通过使用在线过程监测来控制含有RBCOD的废水的添加速率。过程监测可包括直接测量水质、生物质活性或生物质特性的策略。过程监测还可包括所谓的软-传感器信号，其与可用于间接说明水质、生物质活性、生物质生长、PHA积累和生物质特性的具体过程信息组合。用于过程控制的过程监测参数的实例如下所示：

· 用于间接说明基质浓度(COD)和/或生物质浓度(TSS)的紫外/可见光(UV/Vis)光谱学。

· 自动化的总(或溶解)有机碳或化学需氧量分析(用于测量溶解的基质浓度)和/或生物质浓度(VSS)。

· 呼吸测量，其基于例如溶解氧、二氧化碳和/或氧化还原电位测量，用于控制过程曝气以及监测和响应在序贯补料-分批废水输入期间现存的生物质呼吸速率的变化。

· 氢离子浓度(pH)，其作为生物质响应的软-传感器和对补料-分批RBCOD输入的代谢活性。

· 基于近红外反散射方法的浊度测量，用于测量生物质反射率，其提供PHA积累动力学的间接指示。

· 拉曼红外光谱学，用于直接评价生物质PHA含量。

关于多种化学、物理和机械性质，不仅量而且聚合物品质对于实际的过程实现是关键的。分子量及其分布是影响聚合物机械性质的主要品质因素。通常，期望较高的分子量和较窄的分子量分布。牺牲分子量可能是对于获自生物质的聚合物在经济或更环境友好方面的固有折衷。还已知在熔体中的聚合物加工由于分子量降低而进一步牺牲材料性质。因此，在积累后，较高的起始分子量在生物聚合物的后续处理中提供更大的灵活性，这是由于比起相反的情况，其更容易设计受控的分子量降低。本发明的一个实施方案为产生平均分子量(M_w)为至少400,000 g/mol，优选大于600,000 g/mol，更优选大于1,000,000 g/mol的PHA的方法。

在纯培养物的发酵中以及在使用VFA的敞口混合-培养过程中的PHA积累是代谢过程的复杂链的结果。不束缚于任何具体的理论，认为通过控制生物质中这些代谢过程中的一个或多个的速率，可产生高平均分子量PHA。例如，可认为PHA积累的动力学通过以下来控制：

1。R_t，将细胞外VFA运输至细胞内的速率，

2。R_c，将VFA转化为PHA单体前体的速率，和

3。R_p，这些前体聚合成为PHA的速率。

关于R_t即VFA进入细胞的通量受到细菌主动控制的程度存在争论。尽管有这种争论，穿过细胞壁的运输速率受到VFA的细胞外和细胞内浓度之间的浓度梯度的影响。VFA的细胞内浓度将取决于膜运输进入细胞和细胞内VFA的“清除”速率的平衡。

进入细胞胞质的VFA可用于三种可能的代谢功能。以下这些功能的速率可受到细胞内VFA浓度的影响：

1。R_c，将VFA转化为PHA单体前体的以上提及的速率。

2。R_g，用于非PHA生物质生长的VFA的合成代谢转化的速率。非PHA生物质可为活性微生物以及其它储存产物例如胞外多糖形式。

3。R_e，VFA分解代谢转化为H₂O和CO₂的速率，以驱动用于进行中的维持、生长和PHA积累呼吸的代谢活性。

注意到当将其它非PHA前体有机物质(例如VFA)与RBCOD一起进料至生物质时，该非PHA前体来源可满足R_e需求，多达100%的生物质能量需求。然而，对于仅RBCOD进料的情况，当R_t和R_c足够快时，可假定R_r(即从废水去除VFA的速率)取决于R_g、R_p和R_e：

R_r=f(R_g, R_p, R_e)

由于生长和聚合的能量需求与生物质生长和/或PHA生产的速率关联，所以VFA分解代谢速率可认为受限于生长和聚合速率的函数：

R_e=f(R_g, R_p)

因此，R_r取决于R_g和R_p或

R_r=f(R_g, R_p)

该结果说明当R_t和R_c相对快速时，VFA去除的限速步骤为R_p和/或R_g。如果R_g可忽略，例如，由于匮乏(famine)的时间段，和/或必要生长要素(如氮或甚至氧)的限制，则VFA去除的限速步骤或“瓶颈”为PHA聚合的速率即R_p。当条件使得R_t和R_c相对来说比R_p显著更快时，使得R_p独立于R_t和/或R_c，则导致R_p限制条件。除非在理论上另外说明，当生物质能保持供给用于制备PHA(产物)的聚合过程的细胞内的PHA-单体(基质)库时，使得聚合速率(R_p)不受PHA-单体浓度的影响，则导致本文使用的R_p限制条件或“PHA聚合限制动力学”。此外，当R_p为限速步骤时，从混合液中去除VFA的动力学为零级，即独立于在混合液中VFA的浓度。

考虑前述PHA聚合动力学理论，预计在生物质中产生的PHA的分子量较大，这是由于在积累过程期间链终止反应的可能性降低。根据该模型，通过在积累过程期间保持PHA-单体前体的水平使得链终止可能性最小化，从而不限制PHA聚合的速率。这种水平的PHA-单体前体可通过零级VFA去除动力学，或类似地通过最大呼吸速率(在积累过程期间在生物质中实现和在生物质中保持)来表示。VFA去除的动力学、氧消耗、二氧化碳产生和pH变化为在积累过程中可被监测的参数实例，作为确定在生物质中实现的最大呼吸速率以及其在每次RBCOD供应之后所减少的百分比程度的方式。尽管这些理论解释和其它所述解释的可能，本发明提供足量RBCOD的定时和将足量RBCOD供应至混合液，以刺激用于PHA积累的最大生物质响应，从而实现与废水处理平行的高分子量PHA聚合物。

在一方面，本发明包括使用用于处理废物有机物质的生物质的敞口混合培养物产生PHA。尽管如此，本发明采用的原理和技术可用于涉及细菌纯的或限制的混合培养物和/或更精制的RBCOD或用于生物质和/或PHA生产的其它原料的过程。

当使用含RBCOD的废水进料时，由废水处理设备收获的生物质可用于积累PHA。富含积累PHA的细菌的生物质可积累通常超过其总干重(活性生物质加上PHA)的50%的PHA。应供应RBCOD进料以实现初始浓度足够高，以刺激生物质中的PHA储存响应，但是浓度不能太高以引起任何形式的代谢抑制，代谢抑制对于有关聚合物产率和生产率的过程可能是不利的。

尽管使用生物质呼吸测量和补料-分批反应器在用于评价混合-培养物系统中PHA积累的研究中已成为标准，但是该技术的实际执行还未充分论述或说明。例如，仍期望在补料-分批配置中用于明确处理和优化PHA分子量的呼吸测量控制的模式。

本发明提供向生物质中受控添加RBCOD，以优化得到较高聚合物分子量分布。本发明的一方面为在生物质中产生高分子量PHA的方法，所述方法包括：

· 在一段时间内，通过将基质间歇供应至生物质，将含有有机碳的基质进料至积累PHA的生物质；和

· 控制基质供应的频率和量，使得相对于最大呼吸速率，生物质的呼吸速率下降不多于70%，所述最大呼吸速率通过生物质对最近供应基质的响应而实现。

基于观察到的生物质响应的动力学，可实时监测和调节限定足够大的脉冲体积的因素。工作范围为将生物质周期性暴露于以下范围峰刺激浓度的RBCOD的质量输入：优选20至500 mg-COD/L之间、更优选在40至200 mg-COD/L之间。

RBCOD输入量可恒定，但是由于在PHA积累过程期间聚合动力学降低，优选在开始时较高，并且随着时间的推移而变小。

以足够的频率提供RBCOD向生物质的输入，使得相对于响应最近的废水RBCOD输入而实现的呼吸速率，现存的生物质呼吸速率下降不多于70%，并优选不多于30%。

在RBCOD输入之间生物质的可接受的呼吸速率降低取决于输入事件的次数。输入事件或中断的次数越多，则如果希望分子量最大化，在事件之间现存的呼吸可降低得越少。

高初始生物质浓度和较低的流入液RBCOD浓度可导致需要增加次数的刺激事件。

由于在该过程中PHA积累的质量和/或微生物或其它非PHA生物质的生长，在PHA积累过程期间，生物质浓度提高。在总生物质和活性生物质之间可进行区别。在积累过程中的活性生物质浓度可定义为总生物质浓度(作为挥发性悬浮固体测定)减去PHA浓度。

当现存的呼吸降低不多于其现存的最大可能的30%时，PHA平均分子量可较少受到刺激事件频率的影响。

一旦生物质已被PHA饱和，并且在不存在一种或多种生长必需的其它营养物下，RBCOD可被生物质消耗，仅用于细胞维持和内源性呼吸。此时，PHA生产率降低，并且RBCOD去除速率显著降低。通常在此时混合培养物积累过程终止。悬浮的生物质和水相分离，并且产物为具有高水平积累的PHA的生物质。然而，在可允许流出物的最终排出之前，来自该积累过程的流出物可含有进一步处理所需的高水平的残余RBCOD。

如果在所有其它生长必需的营养物存在下，生物质被PHA饱和，则RBCOD可被生物质消耗，以除了支持同时发生的PHA储存以外，还支持非PHA相关的生长和维持的过程。在该阶段，可保持积累过程，直至这样的点：当反应器中的PHA质量已达到最优水平和/或在混合液中残余的可溶性COD的积累达到所选的最大水平。

本发明的一个实施方案是在敞口混合培养物中驱动PHA-积累过程，其中来自积累过程的水性排出物至少对于其RBCOD含量经生物学处理。本发明的另一个实施方案是使用实际的废水驱动PHA-积累过程，其中用于PHA生产的除RBCOD以外的营养物水平促进PHA储存和生物质非PHA生长代谢活性的组合过程。

在实际的应用中，体积受到限制，并且是用于积累过程的显著建造成本。对于PHA积累，良好的原料可不总是被显著浓缩，因此，问题可为达到足够浓度的RBCOD以便达到最优PHA积累速率和PHA品质。在任何情况下，更期望较低的进料输入量，这是因为进料频率越高，则对于以下的机会越多：更紧密的过程控制、进料组成的操作转换以及在PHA积累批次运行结束时避免溶液中RBCOD过量。使用较高频率的补料-分批输入的补料-分批操作开始接近连续进料策略的条件。当进料频率提高时，在补料-分批和连续进料策略之间的差别变得模糊。因此，体积进料速率，而不是剂量输入频率，变为在控制和过程操作中的等效参数。

通过在完全混合的反应器中施用于所有生物质的所选体积的不同剂量输入，可实现补料-分批操作。通过在侧流中或在与RBCOD输入接触的不同的反应器区内引入生物质，也可实现补料-分批操作，使得在生物质中的生物经历不同的基质供应刺激和不同的基质中断周期。当生物质在充分混合的反应器内或在各区或侧流内与基质接触时，可脉冲或连续供应进料。由于暴露于存在基质浓度的负梯度的环境，进料中断可定义为这样的情况：在生物质中的微生物经历进料供应时间或空间的减少。因此，用于在生物质中积累PHA的本发明方法所体现的构思包括脉冲进料以及进料中断。本文中使用某些术语来描述脉冲进料和进料中断两者。例如，“将基质间歇供应至生物质”或“中断进料”包括脉冲进料以及提供进料中断，尤其是包括将基质脉冲进料至生物质或将一部分生物质从具有相对低浓度基质的区循环至具有相对高浓度基质的区，同时连续或非连续进料基质。在任一种情况下，所述方法或过程将基质间歇供应至生物质。

在本发明的一个实施方案中，持续PHA积累过程，直至达到实际的限度、已实现进料目标、PHA-积累的饱和迹象明显和/或反应器中PHA的总质量已达到目标水平。这些事件的指示包括：

o 实际的限度包括反应器的物理限制，例如用于具有可变的反应器液体体积的补料-分批操作的可用槽体积。

o 实际的限度包括限制生物质与排出的流出物分离的动力学，用于具有恒定反应器液体体积的补料-分批操作。

o 进料目标包括废水RBCOD的添加，其基于建立的或具体情况观察到的生物质转化收率的标准，其可因废水而异。例如，对于发酵的乳品废水，通常观察到的转化率为0.4 kg-生产的PHA/kg-消耗的VFA-COD。因此，如果生物质具有已知的PHA积累容量，至初始生物质干重的100%，则目标废水添加为2.5 kg-COD/kg-初始生物质。

o PHA积累的饱和迹象或终点包括任何或全部的以下可测量信号：

? 在每次补料-分批输入之后剩余的积累反应器中开始RBCOD的积累。

? 基质吸收动力学降低，低于建立的阈值，该阈值对于所用的废水种类是特定的。

? 使用在线评价生物质反射率作为指示参数，观察到的生物质中PHA的饱和。

? 对于生物质生长和PHA储存同时发生的情况，使用生物质PHA含量(反射率)和生物质浓度(混合液浊度)的组合在线评价，观察到的PHA体积生产率的目标。

? 降低生物质呼吸测量至低于建立的阈值，该阈值对于所用的废水种类是特定的。

观察到的对于从补料-分批废水中的有机输入的响应，到对例如废水中氮输入的响应的生物质呼吸测量转变。

生物质积累PHA最大电位所需的时间可根据各批次而异。关于混合培养物过程的动力学和其它特性，可发生波动，例如，由于微生物群体动力学、代谢条件(生理状态)的转变和流入液进料特性的变化。合适的PHA积累原料可包括选自除了在用于生产积累PHA的生物质的废水中存在的那些以外的RBCOD来源的原料。这种迥然不同的原料可增强总体过程经济性，或者可改变RBCOD组成用于生产不同种类的PHA。

对于PHA-积累的补料-分批条件的确定

基于需氧丰富-匮乏(feast-famine)选择，在两个4升实验室规模序批反应器(SBR)中，使用富含PAB的活性污泥生物质进行实验。SBR与生物学废水处理过程平行操作。发酵的乳品工业废水用作富含PAB的生物质生产的进料。发酵的乳品废水COD包含约90%的VFA。发酵的废水补充了超过活性污泥代谢需求的大量营养物和微量营养物。在1天水力停留时间(HRT)和4天固体停留时间(SRT)情况下，操作SBR。1天HRT基于2×12小时循环/天，其中使用2 L反应器混合液体积的起点限定循环。在循环开始时，在需氧条件下快速进料2 L废水。废水和混合液与超过1 mg-O₂/L的溶解氧水平需氧反应约11小时。随后，停止曝气和混合，让混合液中的活性污泥在静止条件下沉降30分钟。沉降后，将2 L上清液倾析。在每2次循环之一中，恰好在停止曝气和混合以便沉降之前，将500 mL的混合液泵出(废弃)，用于SRT控制。当活性污泥从反应器中废弃时，仅将1.5 L的上清液倾析。丰富-匮乏循环为在进料后随即不多于2小时的丰富(feast)，接着不小于9小时的匮乏，这通过重复和详细的实验循环-研究和常规溶解氧监测评估。反应器支持约2 g/L稳态浓度的活性污泥。还在中试规模操作类似系统，其中使用一个工作体积为400 L的SBR。

在跨度约3个月的SBR操作的一组重复实验中，废弃的生物质经历浓缩的乙酸或发酵的乳品废水的脉冲输入。目标是在生物质中现存的PHA含量可忽略的条件下，测量生物质对“丰富”刺激的响应。基于溶解氧趋势以及还基于在生物质对有机基质的相应脉冲输入的响应期间更详细的水质分析，监测生物质对这些基质输入的响应。生物质响应可通过如下形式的函数来建模(图1)：

          方程式1

R_r=q_sX                                    方程式2

其中，

q_s=特定的基质消耗速率(mg-COD/g-生物质/分钟)

k_s=对于基质刺激的生物质响应因素

s=提供刺激的基质初始浓度(mg-COD/L)

s_f=对于可测量的生物质响应，估计的阈值基质浓度

s_m=在基质消耗中实现最大响应的基质浓度

q_m=最大估计的特定的基质消耗速率

X=生物质浓度

R_r=基质从溶液中的去除速率

认为在较高刺激浓度下，模型偏差是由于在一系列刺激之后在生物质中的PHA积累。一旦生物质被VFA脉冲输入刺激，观察到VFA去除速率(R_r)遵循零级动力学以充分低于估计的S_f浓度，因此，在每个相应的刺激响应水平之后q_s大致恒定。该结果表明，需要足够的基质(s_f)来刺激可测量的丰富响应，并且对于低于浓度s_m的刺激，代谢响应对刺激的水平敏感。然而，一旦建立响应，则保持该响应，直至加入的VFA基本上被完全消耗。

虽然由这些实验观察到的趋势一致地再现，但发现在重复研究中在不同的天数响应的数量级可变。浓度s_m在40-115 mg-COD/L范围。成正比地，S_f在3-9 mg-COD/L范围，并且q_m在8-21 mg-COD/g-生物质/分钟范围。如果认为这些实验结果是典型的，则实现超过约150 mg-COD/L的补料-分批VFA添加应足以驱动PHA积累的过程，使得积累过程动力学仅受限于PHA聚合的细胞内速率。

然而，实现低至40 mg-COD/L的较低的补料-分批VFA添加亦可为足够的，这取决于用于PHA聚合的生物质的现存生理状态。当生物质含有显著水平的PHA时，较低的添加也是可能的，因为聚合动力学可与生物质PHA含量同步降低。由于观察到q_m与s_m相关，对于例如200 mg-COD/L的初始脉冲的生物质响应的动力学可用于实时评价实现聚合有限的PHA积累动力学所需的最小VFA质量添加。因此，呼吸测量动力学可用作对于补料-分批PHA积累过程的必需质量添加的直接反馈。

用于刺激理论PHA聚合限制动力学的VFA的量可变化。基于我们当前的实验结果的主体，保守的RBCOD-脉冲输入将是对于具有可忽略储存的PHA的生物质，实现200 mg-COD/L的初始刺激水平的输入。

由于s_m和q_m直接关联，所以基质消耗的动力学可用于在积累过程期间通过在线监测实时建立s_m。保持理论PHA聚合限制动力学所需加入的浓度s_m预期与积累过程同步降低，这是因为当生物质积累PHA时，PHA聚合的理论速率下降。

使用呼吸测量用于补料-分批控制

使用富含来自上述SBR废水处理系统的积累PHA的细菌的生物质，在用于实验室和中试规模PHA生产的需氧补料-分批反应器中，使用浓缩的发酵乳品废水和纯VFA混合物作为进料，我们进行了众多组的积累实验。使用基于溶解氧(DO)的对照策略，在富含VFA的废水的序贯输入下，操作补料-分批反应器，产生溶解氧的典型趋势，如图2所示。

使用基于DO的对照策略，根据前述的脉冲补料-分批PHA积累的条件的实验结果，假定理论PHA聚合限制动力学。在每次输入后初始VFA浓度标称为200 mg-COD/L。由在线监测溶解氧(DO)浓度来控制补料-分批输入。对于恒定混合、恒定曝气和恒定的氧的气-液传质条件，DO变化可与生物质呼吸速率的潜在变化相关。DO向下转变表明生物质呼吸速率的相对提高，而DO向下转变表明生物质呼吸速率的相对降低。对照策略如下：

a. 在第一次VFA输入之前建立稳态DO水平。对于具有可忽略PHA含量的生物质，该参考DO水平(DO_r)建立初始背景(内源性)呼吸速率的参考。

b. 对于每一个相应的补料-分批VFA-输入刺激，生物质呼吸的最大速率用实现的最小DO水平(DO_m)来表示。

c. 通过相对提高DO(由于基质耗尽，代表生物质呼吸速率降低)触发随后的VFA-脉冲输入。在确定每一个DO_m之后，在某一时间相对提高DO(DO_t)超过预定的临界阈值(δ^*)如下用于触发来自VFA-进料泵的随后单一脉冲输入：

当超过δ^*时，估计在DO_m之后的进料     方程式3

d. 在设定时间内，并且使用不同量的初始生物质浓度来运行积累。在这些实验中积累时间在5-20小时范围。在一组实验中，控制积累过程，使得δ^*标称为0.35。通过在最大呼吸速率下使用不同的脉冲浓度(20-500 mg-COD/L)和不同的DO浓度(0.1-3.0 mg/L)，调节脉冲次数。

观察到补料-分批输入的次数影响所得PHA聚合物的分子量(图3)。同时在补料-分批输入降低的区域中，观察到分子量的变化程度。该变化可归因于不同的曝气条件，考虑到根据过程控制所用的相同标称δ^*，所述不同的曝气条件将导致对于呼吸测量转变的不同结果。因此，在补料-分批控制中明确维持生物质呼吸(与在方程式3中的DO相对)是显著的，并且补料-分批输入次数越多，则越显著。为了保持进料输入，使得RBCOD浓度尽可能低，需要更多的补料-分批输入事件。类似地，在反应器中活性生物质的浓度越高，则将需要越多的补料-分批输入来保持期望的生物质呼吸。

在类似的条件下但是在所选的δ^*范围内运行的不同组实验中，对于涉及向生物质的许多补料-分批输入的补料-分批积累，在积累结束时，较低的δ^*值倾向于导致较高的PHA分子量。进料脉冲输入实现200 mg-COD/L的脉冲-初始浓度，并且对照参数由方程式3限定(图4)。与图3中的结果类似，在0.3至0.4之间的δ^*区域中观察到高程度的变化(图4)。

通常，补料-分批输入次数越大，则用于实现较高的最终PHA平均分子量(报告为M_w)的聚合动力学维持越显著。在曝气氧传质动力学可被估计的实验中，进行氧质量平衡，并且明确确定来自进料脉冲刺激和中断的生物质呼吸转变。因此，对于每一个补料-分批积累实验，估计对应于所选的δ^*阈值的平均现存的呼吸降低(图5，6和7)。在图5中，每一个补料-分批输入对应于降低DO至最小值的趋势。根据方程式3触发每一个补料-分批输入，并且对于该积累，使用δ^*为0.3的设定点。

虽然观察到的变化表明其它因素促成最终PHA平均分子量，但在补料-分批输入事件之间的生物质呼吸速率的平均降低为实质控制参数。在本发明的一个实施方案中，生物质呼吸速率保持大于现存最大值的30%。在一个优选的实施方案中，生物质呼吸速率保持超过现存最大值的40%。在一个更优选的实施方案中，平均生物质呼吸速率保持超过现存最大值的70%。优选在补料-分批输入事件之间，相对呼吸速率降低最多30%，以降低在PHA积累过程期间理论链终止可能性增加的负面影响。通常认为在生物质中在PHA积累期间链终止的高可能性导致较低的平均分子量。

在一个实施方案中，补料-分批输入控制基于呼吸触发点，而不是仅基于溶解氧。图6说明基于方程式3补料-分批输入触发的选择如何转化为在RBCOD刺激事件之间相对呼吸的相应的相对降低。由于反馈和控制延迟(?)，在进料时，δ^*设定点在估计的实际的δ^*之下。由于在开始积累时生物质更具活性的事实，在开始积累时，设定值和实际的δ^*值之间的差异最高。对应于实际的δ^*值，对下一次进料-输入之前现存呼吸速率所得到的相对降低进行估计(?)。

在本发明的一个优选的实施方案中，将补料-分批输入控制定量校准至生物质的实际呼吸测量速率转变。

PHA分子量的确定

平均分子量反映聚合物链长的平均大小。在大多数情况下，PHA为具有相对宽分子量分布的聚合物。M_n为数均摩尔质量，并且将其定义为：

    方程式4

其中N_i是摩尔质量为M_i的分子的数量。重均摩尔质量M_w定义为：

    方程式5

衡量分子量分布的多分散性指数(PDI)定义为：

    方程式6

M_w总是大于M_n，因此PDI总是大于1。PHA-树脂的PDI通常为约2，并且观察到M_w通常在10,000-3,000,000 Da范围。分子量分布可受到以下方法的影响：在生物质中积累PHA的方法、回收PHA树脂的方法以及将树脂进一步加工成为最终用户产品的方法。

在125℃下，PHA由经蒸馏水-漂洗和用丙酮干燥的生物质来提取(含有标称10 mg-PHA/mL丙酮的20 mg-生物质) 2小时。将在丙酮中提取的聚合物从残余生物质中倾析，并将溶剂蒸发。

通过尺寸排阻色谱法(SEC)确定提取的聚合物的分子量分布(参考聚苯乙烯标准物)。使用泵(Viscotek VE 1122)、双折射仪/粘度计-检测器(Viscotek型250)和三个串联偶联的线性柱(Shodex KF-805、Shodex KF-804和Shodex KF802.5)进行SEC。检测器温度为37℃，同时在室温下进行研究。所用的溶剂为氯仿(Merck pro分析>99%)，流速为1 mL/分钟。注射体积为100 μL。

参考具有已知的平均分子量(分别为1,800、650、96和30.3 kg/mol)的四种不同的聚苯乙烯标准物来校准分子量。测量折光指数的检测器用于检验标准物和样品的信号。

在100℃下，将通过SEC检验的样品溶解于氯仿中10分钟，至5 mg/mL的浓度。在将样品注射至柱中之前，将聚合物溶液过滤(PALL Life Sciences Acrodisc ? CR 25 mm Syringe Filter，具有0.45 μm孔径大小)。根据来自每一个样品的PHA的分辨的分子量分布，计算M_w、M_n和PDI的特性量。

对于本发明，PHA分子量采用公制的重均摩尔质量(重量)或M_w。

最大分子量和积累速率的确定

如上文所概述的，补料-分批PHA积累的挑战在于通过保持高速率且链终止可能性低的聚合实现最大分子量。以下方法可用于确定在具体设定的环境条件下对于具体生物质可得到的预期的最大分子量和积累速率。该最大值可用作在更容易实现的补料-分批条件下在更大规模系统中使用相同的生物质和RBCOD组合进行的补料-分批积累的参比点。

使用具有相当大的PHA-积累潜能但是具有低初始PHA含量(低于总悬浮固体的5%)的生物质。将生物质充分搅拌，并提供曝气，使得溶解氧浓度总是超过2 mg/L。

将RBCOD形式的碳基质加入到生物质中，使得产生相当大量的PHA，而无需多于三次基质的补料-分批输入。因此，暴露于生物质的RBCOD的浓度将不会比在积累实验过程期间三次的最大值多低于100 mg/L。这些进料中断在系统上保持最小值，例如，使用方程式3的控制策略。RBCOD的足够的补料-分批输入浓度在0.5-2 g/L范围。

在该实验结束时由生物质提取的PHA的分子量可参考使用给定的生物质和基质组合可得到的实际可实现的最大值。在该实验过程中观察到的PHA积累的最高特定速率(表示为g-PHA/g-‘活性生物质’/小时)可用于表明在代表性环境条件下生物质的PHA积累的最大速率。(参见，例如，Lemos等人，2006，Serafim等人，2004，Serafim等人，2008)。较高PHA分子量似乎与在进料-脉冲刺激事件之间保持平均较高的呼吸速率有关，如图7所示。

积累过程中终点的确定

当富含PAB的生物质的敞口混合培养物已积累使用来源于废水的RBCOD产生的PHA时，不总是可能保持PHA储存作为占优势的代谢活性。如果废水含有非PHA微生物生长所需的其它必要的营养物，则一部分RBCOD可被消耗，以提高活性生物质的量。因此，在PHA积累过程期间，细胞内PHA储存和微生物生长二者可同时发生。在PHA积累过程期间微生物生长响应可提高，但是提高的生长响应不必然意味着在生物质中PHA积累的降低。例如，在若干实验中使用富含PAB的生物质和发酵的乳品废水进行PHA积累过程，该废水的氮含量有限但是仍含有足够的氮、磷和其它痕量营养物以支持在PHA积累过程期间在生物质中非PHA生长响应。生物质达到总悬浮固体的50%的标称PHA含量，但是在该点之后，组合的生长和PHA储存导致活性生物质和PHA含量二者的总体提高。生物质的相对PHA含量保持恒定或稍微提高。在这种情况下，由于在过程中总的生物质持续提高，在达到最大PHA含量之后很久，在生物质中高呼吸测量持续。相比之下，当相同生物质使用仅含有RBCOD的废水进料时，观察到一旦已积累最大量的PHA，生物质呼吸对RBCOD输入的响应显著减弱。由于自废水中RBCOD产生PHA的实践应适应含有RBCOD以及存在其它营养物的废水，所以单独的呼吸速率可不提供对于限定过程终点或终止标准的足够指示。已观察到富含PAB的生物质可呈现对于PHA积累的相同容量，但是具有可变的积累动力学，因此，对于该补料-分批过程，固定的持续时间也可能不是足够的标准。

本发明人已发现，当PHA积累时，生物质反射率或颜色变化。该颜色变化似乎与在生物质内所包含的PHA的量直接相关。因此，在一个实施方案中，本发明方法包括监测混合液悬浮固体浓度以及悬浮固体反射率(颜色)的相对变化，以监视PHA积累过程。在一个优选的实施方案中，使用在近红外波长下光反散射技术来监测生物质反射率或颜色变化。该监测数据的实例在图8中提供。在图8中，初始生物质浓度为1.5 g-VSS/L，并且对于每一个进料事件，进料脉冲输入导致55 mg-COD/L的理论标称最大RBCOD浓度。总共81次补料-分批输入用0.22的平均实际δ^*(方程式3)来进行，该平均实际δ^*用于保持呼吸速率平均为现存最大值的59%。在积累期间取六个抓取样品(grab sample)，并且通过GCMS定量的建立方法评价在这些样品中的PHA浓度(?)。趋势线报告了使用880 nm近红外光的反散射浊度测量的在线监测信号。

为了使来自PHA积累过程的期望PHA的回收最大化，在达到一个或多个阈值时，可终止该过程。通过过程呼吸测量、反应器PHA含量和残余RBCOD的组合测量，关于实际的过程容量、废水排出限制、PHA-体积生产率、基质上的PHA收率等，可建立终止标准。本领域技术人员可认识到用于确定何时终止PHA积累过程的实际、技术、经济和/或环境性能的限制。

实施例

以下实施例用于说明本发明的方法和过程，并且不应解释为对其进行限制。

可作为生物学废水处理过程的一部分，或作为废水处理过程的附加，或完全独立于废水处理过程，来进行这些实施例中和整个说明书中描述的PHA积累过程。在典型的生物学废水处理过程中，将废水流入液或废水流引向废水处理系统，该系统通常包含一个或多个反应器、固体分离器和其它附带的组件。活性污泥用于生物处理废水流入液。通常将活性污泥与废水流入液混合以形成混合液，并且将混合液生物处理。通常混合液经历需氧、缺氧和/或厌氧条件，以进行各种生物学处理过程。例如，已知生物处理废水以除去BOD、COD、磷、氮和其它污染物。固体分离器(例如澄清器)用于将活性污泥与废水分离，并且将已分离的活性污泥再循环，并与进入的废水流入液混合，同时将一部分活性污泥废弃。

形成一部分活性污泥或废活性污泥的生物质随后可用于本文描述的PHA积累过程。此处将生物质与活性污泥或废活性污泥分离，并引向采用PHA积累过程的一个或多个反应器。用于生物质的进料可取自通常包括RBCOD的废水流入液。存在这样的情况：在废水流入液中RBCOD浓度或RBCOD的类型不适于PHA积累过程。因此，在某些情况下，用备选的或增量的废水流或具有适当浓度和类型的RBCOD的另一进料流来对生物质进料。

第一实施例为其中在循环过程期间活性液体(混合液)体积增加的补料-分批PHA积累过程(图9和10)。第二实施例类似，不出之处在于示出了反应器构型，其中在积累循环期间活性液体体积恒定(图11)。以下简要描述积累循环。

两个实施例包括用于评价特定的基质消耗速率的监测策略(q_s，方程式2)。例如，q_s可通过测量以下来评价：

1. 生物质浓度X，基于UV/Vis光谱学。

2. RBCOD的去除速率，根据以下估计：

a. UV/Vis光谱学和/或

b. 生物质呼吸速率上移和下移趋势的间隔。

与每次废水输入一起进料至过程的质量或RBCOD可定量。如果仅RBCOD浓度已知，则进料至过程的质量等于进料体积乘以RBCOD浓度。

根据方程式1，对于各补料-分批输入，刺激RBCOD浓度s必须大于或等于s_m。采用该构思的方法可包括以下步骤：

1. 使用恒定保守的补料-分批输入以实现理论PHA聚合限制动力学。例如，基于目前可用的实验数据，200mg-RBCOD/L的初始刺激s是保守的。

2. 基于对于各补料-分批输入的生物质响应，估计现存的s_m。鉴于对于补料-分批输入刺激s所估计的q_s，由于观察到的在s_m和k_s之间的关系(方程式1)，可估计s_m。对于不同的废水进料，该关系可具体校准，如对图1所示结果所进行的。

3. 基于对于各补料-分批输入的生物质响应，从一个输入到下一个输入，使用小但显著的步进上升和/或步进下降变化的s，通过采用方程式1的预期关系，估计现存的s_m。在积累循环过程期间可将合适的优化控制算法用于监视s_m。

可变体积需氧PHA积累过程的实例如图9和10所示。该系统显示在积累过程开始时，在来自P2的第一废水进料之前。在图10中仅显示槽T2。该系统显示在积累过程(A)结束时，供应DAF进料(B)，以将流出物与浓缩的生物质(C)分离。

T1—曝气的恒定体积槽，其用于将废水流入液(P2)与再循环的混合液(P3)快速混合。该槽为可曝气的完全混合的搅拌槽反应器。

T2—曝气槽，其可适应由于在T1中加入的废水流入液所致的体积增加。此处将混合液从T1再循环返回至反应器T2。该槽为曝气的完全混合的搅拌槽反应器。

DAF—用于供应溶解空气的储器，以实现T2中的溶气浮选(DAF)。在PHA积累过程之后或接近结束时，DAF将反应器T2中的混合液浓缩。

P5—泵和阀组件，用于在通过DAF的生物质分离之后，排出流出物和或增稠的生物质。

P1—用于化学添加的设备。化学品可用于出于改进的DAF分离的原因来调节生物质和/或出于在积累后改进的PHA回收的原因来调节生物质。

M1—在线监测在恒定体积槽T1中的水质、生物质呼吸和生物质反射率。

M2—在线监测在可变体积槽T2中的水质、生物质呼吸、生物质反射率和液体体积。

在一个实施方案中，积累过程如下进行：

1. 使用P4将来自废水处理厂(WWTP)的富含PAB的生物质的废活性污泥(WAS)进料至T2中。

2. 将在T2中的混合和曝气关闭。没有生物质再循环(P3)，使得所有的WAS流入液体积保持在T2中。

3. 通过DAF将WAS进一步浓缩，并且将下面的澄清流出物排出(P5)。因此在反应器T2中的混合液体积可变。

4. 启动T2和T1曝气，同时启动再循环泵P3。基于来自M1和M2的监测，评价生物质浓度、溶解的有机物质浓度和呼吸速率的初始条件。

5. 开始废水流入液的补料批次计量(P2)，使得：

a. 在T1中实现目标峰浓度，以提供对生物质足够的积累刺激。

b. 保持刺激，在线监测M1和M2，由于对于P2和P3所选的泵送速率，使得生物质呼吸速率保持其现存的最大值。

c. 废水流入液输入和再循环流速可基于：所测量的溶解有机物质浓度的耗尽、所估计的溶解有机物质浓度的耗尽速率和/或基于M1和M2呼吸速率的下移。

6. 继续废水输入，直至T2的可用反应器体积用完，已进料目标RBCOD质量，和/或生物质呈现PHA饱和迹象，由于例如生物质反射率趋势的平台期或目标。

7. 在补料-分批过程结束时，将在T1和T2中的曝气关闭，但是在两个槽中的混合和再循环可继续。此时可加入化学品(P1)，以抑制储存的PHA的降解并改进DAP分离。

8. 通过DAF将生物质在反应器T2中浓缩。通常，在PHA积累过程已开始并达到稳态条件后，在反应器T1中的混合液的体积保持通常恒定的水平，而在反应器T2中的混合液的体积变化。还注意到，在该实施方案中，反应器T1小于反应器T2，因此在反应器T1中的混合液的体积小于在反应器T2中的混合液的体积。

9. 将DAF-浓缩的生物质和流出物从该过程中排出。

10. 反应器已准备好用于下一个PHA-积累循环。

恒定体积需氧PHA积累过程的实例如图11所示。

A—内部空气补给系统(airlift)，将废水流入液和反应器混合液在体积减少的局部区域中快速混合。空气补给系统提供在反应器中的曝气和混合。在该实施例中，空气补给系统为内部敞口圆柱体。

B—降液管，在该说明中，其为同心圆柱体，其中将反应器内含物向下循环返回至空气补给系统的入口。

C—在反应器中的静止区，其中空气补给系统的气体不进入并且其中进入该区的悬浮固体将沉降并再次进入B区。

M1—在线监测空气补给系统中的水质、生物质呼吸和生物质反射率。

M2—在线监测降液管中的水质、生物质呼吸、生物质反射率和液体体积。

P1-P4. 泵，用于控制WAS流入液、废水流入液、化学添加、最终流出物排出(流出物-2)、生物质收获。

溢流(流出物-1)，用于从反应器排出过量的澄清液体，以保持恒定的总反应器液体体积。

在该实施方案中，积累过程如下进行：

1. 初始空的反应器泵送充满WAS (P2)。

2. 开始曝气。基于来自M1和M2的监测，评价生物质浓度、溶解有机物质的浓度和呼吸速率的初始条件。

3. 开始废水流入液的补料批次计量(P3)，使得：

a. 在A中达到目标峰浓度，以提供对生物质足够的积累刺激。

b. 保持刺激，使用基于在线监测M1和M2和/或评价的内部再循环速率，使得所有的生物质被暴露。

c. 随后的补料-分批废水流入液输入可基于：所测量的溶解有机物质浓度的耗尽、所估计的溶解有机物质浓度的耗尽速率和/或基于M1和M2呼吸速率的下移。

4. 继续废水输入，直至已进料目标RBCOD质量，和/或生物质呈现PHA饱和迹象，由于例如生物质反射率趋势的平台期。

5. 在补料-分批过程结束时，可简短地继续曝气，以便在加入化学品(P1)同时保持混合。可加入化学品，以抑制储存的PHA的降解并通过重力沉降改进生物质分离。

6. 通过重力沉降使生物质在反应器中浓缩。

7. 将浓缩的生物质和流出物从该过程中排出(D和P4)。

8. 反应器已准备好用于下一个PHA-积累循环。