基因Ⅵb亚型新城疫病毒致弱株ⅥbI4及其构建方法

摘要

本发明涉及基因Ⅵb亚型鸽源新城疫病毒致弱株ⅥbI4及其构建方法。所述基因Ⅵb亚型鸽源新城疫病毒致弱株ⅥbI4，它的保藏号CGMCCNo：6149。本发明涉及应用反向遗传技术，利用含有鸽源新城疫病毒JS/07/04/Pi基因组全长的转录载体pTVT/071204，对其F基因进行致弱突变后获得转录载体ApTVT/071204，再将新城疫病毒rNDV/I4的NP、P和L基因片段替换ApTVT/071204上的对应部分，得到重组质粒ApTVT/ⅥbI4，该质粒与辅助质粒共转染BSR-T7/5细胞后成功拯救出重组病毒ⅥbI4。该病毒在鸡胚上具有较高的繁殖滴度，适合于疫苗的大规模生产，可用于制造疫苗。

说明书

技术领域

本发明涉及应用反向遗传技术，产生一种基因Ⅵb亚型新城疫病毒致弱株Ⅵ bI4，用于制造疫苗。

背景技术

反向遗传操作技术(Reverse genetics manipulation technique)是指在体外通过 构建RNA病毒的感染性分子克隆，将病毒基因组RNA逆转录成cDNA，在DNA 分子水平上对其进行各种体外人工操作，由病毒基因组cDNA和各种辅助蛋白 来组装新的RNA病毒的一项研究技术[Leyrer S,Neubert WJ,SedlmeierR.Rapid  and efficient recovery of Sendai virus from cDNA:factors influencing recombinant  virus rescue.J Virol Methods 1998,75(1):47-58.]，也叫全长感染性cDNA克隆技 术，又常被称为“病毒拯救”。由于最终“拯救”出的RNA病毒来源于cDNA克 隆，因此，可通过中间过程中人为加入的DNA环节，在DNA水平上对RNA病 毒基因组进行各种体外人工操作，如进行基因突变、基因插入、基因敲除（缺失）、 等改造，解决了对RNA病毒基因组难以操作这一难题，极大地方便了人们进行 病毒各基因的功能、致病机理和病毒病防制策略的研究，同时为新型疫苗的研制 和开发提供了新的思路[Engel-Herbert I,Werner O,Teifke JP，et al.Characterization  of a recombinant Newcastle disease virus expressing the green fluorescent protein.J  Virol Methods.2003,108(1):19-28.]。

鸽新城疫(Newcastle Disease)是由鸽Ⅰ型副黏病毒（pigeon paramyxovirus 1， PPMV-1）引起鸽的一种高度接触性，高发病率和高死亡率都很高的急性传染病， 其症状同鸡新城疫相似。PPMV-1属于禽副黏病毒科、腮腺炎病毒属，通常被认 为是鸡新城疫病毒（NDV）的变异株，基因组为单股负链RNA，长度为15kb， 基因组序列为3'-NP-P-M-F-HN-L-5'，分别编码6种蛋白：核衣壳蛋白（NP）、磷 蛋白（P）、基质蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素-神经氨酸酶蛋白（HN）和 大分子蛋白（L）。此外，P基因转录过程中，在484位会插入一或两个额外的非 模板鸟嘌呤核苷酸（G碱基），发生RNA编辑现象而产生V和W蛋白，它们和 P蛋白含有相同的N端，但是具有不同的C端[15]。其中F和HN两种糖蛋白位 于病毒囊膜表面，是分子生物学研究的首选基因。[Steward M,Vipond I B,Millar, et al.RNA editing in Newcastle disease virus.Journal of General Virology，1993,74: 2539-2547.]。

Dorina Ujvari等[Ujvari D,Wehmann E,Kaleta EF,et al.Phylogenetic analysis  reveals extensive evolution of avian paramyxovirus type 1 strains of pigeons (Columba livia)and suggests multiple species transmission.2003,96(1-2):63-73.]在 1978~2002年对16个国家的鸽源新城疫分离株进行序列比对发现，绝大多数属 于Ⅵb亚型。有研究表明Ⅵb亚型NDV大多数是从鸽群中分离得到[Kim LM,King  DJ,Guzman H,et al.Biological and phylogenetic characterization of pigeon  paramyxovirus serotypes 1 circulating in wild North American pigeons and doves. 2008,46(10):3303-3310.]，由此可见，Ⅵb亚型NDV对鸽子具有较强的宿主特异 性。近几年来，我国养鸽业发展迅速，该病在国内亦呈上升趋势，甚至一些养鸽 场呈暴发流行，给养鸽业带来较大的经济损失，并且常常引起鸡新城疫的流行。 近年来，基因Ⅱ型疫苗株LaSota已在鸽场得到了广泛使用，但免疫鸽群中仍可 发生Ⅵb亚型NDV的感染与流行，表明当前疫苗株并不能有效预防Ⅵb亚型NDV 的感染。

该类病毒的F蛋白含有典型的强毒裂解位点，有些对鸽致病力较强而对鸡却 属于弱或中等毒力。Ⅵb亚型NDV感染鸽后，体内带毒时间较长，排毒明显高 于其他基因型，吴双等[吴双王伟伟,曹军平,等.不同基因型新城疫病毒对美国 白羽王鸽的致病性研究.中国预防兽医学报2010,32:424.]对白羽王鸽的致病性 试验中，发现相对于JS-5-05-Go（Ⅶd亚型），WX-10-07-Pi（Ⅵb亚型）感染组 鸽的泄殖腔棉拭子在感染后第5d至15d内均可检测到排毒，而且排毒率明显高 于JS-5-05-Go感染组。加上鸽的活动范围较广，使得该类病毒在鸽群中传播迅 速，家鸽和野鸽与家禽的偶然接触也增加了其他家禽感染的风险。鸽源NDV通 过鸡或鸡胚传代后毒力增强的现象也多次被报道[Dortmans JC,Rottier PJ,Koch G， et al.Passaging of a Newcastle disease virus pigeon variant in chickens results in  selection of viruses with mutations in the polymerase complex enhancing virus  replication and virulence.2011,92(2):336-345.]。因此，鸽源NDV一旦突破了这种 宿主特异性而传染给其他家禽，将会给养禽业带来巨大的威胁。鸽源NDV被认 为是鸡源NDV的变异株，其在抗原性上与鸡源疫苗毒株存在明显的差异 [Dortmans JC,Koch G，Rottier PJ,et al.A comparative infection study of pigeon and  avian paramyxovirus type1viruses in pigeons:evaluation of clinical signs,virus  shedding and seroconversion.2011,40(2):125-130]。研究证实，使用与流行株基因 型一致的疫苗株能有效降低免疫禽群中NDV强毒的携带量及感染率（Hu S,Ma  H,Wu Y，et al.A vaccine candidate of attenuated genotype VII Newcastle disease  virus generated by reverse genetics.Vaccine2009,27(6):904-910.）。鸽新城疫的预防 应该使用专门的鸽源新城疫疫苗。

一个好的疫苗候选毒株需同时具有毒力弱、繁殖滴度高和遗传稳定性好的特 点，而目前国内外分离到的PPMV-1普遍存在强毒裂解位点、效价低和容易发生 变异等缺点。大部分PPMV-1F蛋白裂解位点序列为强毒特征，在CEF上可以形 成空斑，但对鸡的致病力较弱，推测这种毒力的差异可能由于病毒的复制能力的 差异而引起。Dortmans,J.C等将PPMV-1弱毒株AV324与强毒株Herts的NP、 P、M和L基因互换，利用反向遗传技术拯救出重组病毒，测定重组毒的ICPI、 空斑试验，生物学特性试验结果表明NP、P、L蛋白对病毒的复制能力和毒力有 直接影响[Dortmans JC,Rottier PJ,Koch G，et al.The viral replication complex is  associated with the virulence of Newcastle disease virus.2010, 84(19):10113-10120.]。

2007年王伟伟等在发病的鸽群中，成功分离到了基因Ⅵb亚型鸽源新城疫 JS/07/04/Pi株，并进行了全基因组测序，登录号为FJ766526（王伟伟.江苏省新 城疫病毒分子流行病学研究及鸽源分离株基因组序列的分析.扬州大学硕士论 文.扬州,扬州大学,2009.）。2012年，朱艳梅等构建出了JS/07/04/Pi株的全长 表达克隆[朱艳梅,胡增垒,宋庆庆,等.鸽源新城疫病毒JS/07/04/Pi株感染性分子克 隆的构建及病毒拯救.病毒学报.2012,28（1）,67-72.]。2005年姚春峰等从发病鹅 群中分离到基因VII型NDV毒株JS-5-05-Go，其尿囊液的HA价为8log2明显高于 JS/07/04/Pi株（姚春峰.我国部分地区新城疫病毒的部分生物学特性鉴定及分子 流行病学研究.扬州大学硕士学位论文.扬州,2007,6.），2011年胡增磊等构建出 该毒株的全长表达克隆pNDV/I4，并成功将其致弱，致弱后的NDV/AI4，效价高 达10log2[Hu Z,Hu S,Meng C,et al.Generation of a genotype VII Newcastle disease  virus vaccine candidate with high yield in embryonated chicken eggs.Avian Dis2011, 55(3):391-397.]。

发明内容

本发明的第一个目的在于发明一种基因Ⅵb亚型鸽源新城疫病毒致弱株，从 而解决当前所用疫苗株与鸽新城疫流行株基因型不一致的问题。

本发明基因Ⅵb亚型新城疫病毒致弱株ⅥbI4，于2012年5月23日保藏于中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国，北京市朝阳区北 辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，其保藏号CGMCC No：6149。

本发明的第二个目的在于提供一种基因Ⅵb亚型鸽源新城疫病毒致弱株Ⅵ bI4的构建方法：

本发明利用已建立的鸽源新城疫病毒的反向遗传操作平台，将JS/07/04/Pi 株的F裂解位点突变致弱后，将繁殖性能较高的新城疫病毒rNDV/I4的NP、P 和L基因片段替换转录载体ApTVT/071204上的对应部分构建出重组质粒 ApTVT/ⅥbI4，该重组质粒与辅助质粒共转染BSR-T7/5细胞后，获得了具有较 高繁殖性能的基因Ⅵb亚型鸽源新城疫致弱株ⅥbI4，适合于疫苗的大规模生产。

另外，该致弱毒株为基因Ⅵb亚型与当前我国鸽新城疫流行株的基因型相一 致，因此，同常规疫苗（基因I和II型）相比，致弱株ⅥbI4在控制当前鸽新城 疫的发病和流行方面显示出了广阔的应用前景。

本发明包括以下具体步骤：

1）新城疫病毒JS/07/04/Pi株的F蛋白致弱突变

构建阳性质粒APF：分别从JS/07/04/Pi株基因组的4107nt~4903nt，4871nt ~5676nt位置通过Overlap PCR克隆出部分F基因片段，在质粒pCR2.1载体中 相连，获得阳性质粒APF；

分别将APF与P34用AflⅡ和Bsu36Ⅰ进行双酶切后，回收目的片段，连接 构建成AP34；将质粒AP34与P58用BstBⅠ和XbaⅠ双酶切，回收目的片段后 连接成中间质粒AP38，最后将AP38用AgeⅠ和MluⅠ双酶切后替换到 pTVT/071204的对应序列，构建出重组质粒ApTVT/071204，具体的构建模式见 图1。

两对突变引物分别是：

APF1 5'GTGATGTACTCGGACCTTCTGTGCTTGT3'（SEQ ID No.1）

APF2 5'ATAAGGCGCCCTTGCCTCCCTCCTCCTGATGTGGACA3'（SEQ  ID No.2）

APF3 5'ACATCAGGAGGAGGGAGGCAAGGGCGCCTTAT3'（SEQ ID  No.3）

APF4 5'TCAGTCTTTGAATACATGCAGGCTGATG3'（SEQ ID No.4）

2）重组病毒ⅥbI4株的拯救

由于rNDVI4和JS/07/04/Pi病毒基因组的2880bp和9520bp位置均有相同的 单酶切位点AgeⅠ和FspAⅠ，所以将pNDV/I4和ApTVT/071204用AgeⅠ和FspA Ⅰ双酶切后，回收ApTVT/071204小片断、pNDV/I4大片段，连接成重组质粒 ApTVT/ⅥbI4。具体的构建模式见图2。

将质粒ApTVT/ⅥbI4与pCI-NP、pCI-P和pCI-L三个真核表达质粒共转染 BSR-T7/5细胞，转染18h后加入终浓度为10%的SPF鸡胚尿囊液，转染60h后 将转染样品接种9~11日龄SPF鸡胚，即获得基因Ⅵb亚型新城疫病毒致弱株Ⅵ bI4。

上述基因Ⅵb亚型新城疫病毒致弱毒株ⅥbI4的构建方法，其特征在于步骤 1）中通过APF1+APF2和APF3+APF4两对突变引物分别扩增APFa和APFb两 个片段，凝胶电泳回收APFa和APFb，用引物APF1和APF4将以上两个扩增片 段通过Overlap PCR方法相连，得到裂解位点产生突变的扩增片段APF，将其替 换中间质粒P34的对应部分得到质粒AP34，该质粒AP34和P58相连得到AP38， 利用AP38中含有的Age I和MluⅠ，替换转录载体pTVT/071204上的对应部分从 而获得了突变后的质粒ApTVT/071204。

附图说明

图1重组质粒ApTVT/071204构建模式图。

图2重组质粒ApTVT/ⅥbI4构建模式图。

图3重组质粒ApTVT/ⅥbI4的AflⅡ和XhoⅠ酶切鉴定。其中1. ApTVT/ⅥbI4digested with AflⅡ；2.ApTVT/ⅥbI4digested with XhoⅠ；M.DNA Marker。

图4F蛋白裂解位点突变模式图（方框中为突变序列）。

图5致弱株ⅥbI4的RT-PCR鉴定。

图6致弱株ⅥbI4灭活苗免疫鸽后诱导抗体的产生情况（以鸽源毒株070422作 为检测抗原）。

具体实施方式

本发明构建的基因Ⅵb亚型鸽源新城疫病毒致弱毒株ⅥbI4于2012年5月23 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：中国 科学院微生物研究所，其保藏号CGMCC No：6149，其长度为：15192bp。

构建步骤一：鸽新城疫病毒致弱全长表达克隆构建

生物材料准备：

新城疫病毒JS/07/04/Pi株的全长表达克隆pTVT/071204，及其中间质粒P34、 P58[朱艳梅,胡增垒,宋庆庆,等.鸽源新城疫病毒JS/07/04/Pi株感染性分子克隆的 构建及病毒拯救.病毒学报.2012,28（1）,67-72.]由扬州大学农业部畜禽传染病实 验室构建、保存。申请人承诺自申请日起向公众发放二十年。

pCR2.1载体：购自Invitrogen公司。

1、F裂解位点的突变

设计2对引物用于突变扩增JS/07/04/Pi株基因组F基因4107nt~5676nt约 1569bp大小的片段。

两对突变引物分别是：

APF1 5'GTGATGTACTCGGACCTTCTGTGCTTGT3'

APF2 5'TCCTCCTGATGTGGACA3' 和

APF3 5'ACATCAGGAGGA3'

APF4 5'TCAGTCTTTGAATACATGCAGGCTGATG3'

突变碱基由斜体标注，重叠部分有下划线标注。以上引物由上海生物工程有 限公司合成。

PCR反应：以转录载体pTVT/071204为模板配制如下PCR反应体系：

PCR反应循环参数：94℃预变性2min；94℃20s，56℃30s，72℃延伸， 延伸时间为1min/kb，20循环后72℃延伸10min，4℃保存。

用引物APF1和APF2扩增病毒基因组的4107nt~4903nt区域，用引物APF3 和APF4扩增基因组的4871nt~5676nt区域。

Overlap PCR反应体系及条件：

PCR反应循环参数：94℃预变性4min；50℃退火1min，72℃延伸5min， 之后再94℃20s，56℃30s，72℃延伸2min30s，20循环后72℃延伸10min，4 ℃保存。

用引物APF1和APF4将以上两个扩增片段通过Overlap PCR方法相连 （Overlap部分在上述引物中以下划线标注），得到裂解位点发生4个氨基酸突变 的F基因片段，突变模式见图4。

2、全长致弱质粒的构建

PCR产物经回收纯化后与pCR2.1载体相连，转化至大肠杆菌DH5α感受态 细胞，提取质粒，质粒提取后送南京金斯瑞生物有限公司进行测序验证，阳性质 粒命名为APF，分别将APF与P34用AflⅡ和Bsu36Ⅰ进行双酶切后，回收目的 片段，连接构建成AP34；将质粒AP34与P58用BstBⅠ和XbaⅠ双酶切，回收 目的片段后连接成中间质粒AP38。

最后将目的片段AP38经AgeⅠ和MluⅠ酶切后替换转录载体pTVT/071204 上的对应序列。重组质粒用PCR方法鉴定，阳性克隆命名为ApTVT/071204。（见 图1）。

步骤二：重组病毒ⅥbI4株的拯救

生物材料准备

pNDV/I4：[Hu Z,Hu S,Meng C,et al.Generation of a genotype VII Newcastle  disease virus vaccine candidate with high yield in embryonated chicken eggs.Avian  Dis2011,55(3):391-397.]由扬州大学农业部畜禽传染病实验室构建、保存。

pCI-NP、pCI-P、pCI-L真核表达质粒：（胡顺林.鹅源新城疫病毒反向遗传 技术平台的建立及其应用.扬州:扬州大学;2007）由扬州大学农业部畜禽传染病 学重点开放实验室构建、保存。

BSR-T7/5细胞：[Romer-Oberdorfer,A.,et al.,Generation of recombinant  lentogenic Newcastle disease virus from cDNA.J Gen Virol,1999.80(11): 2987-2995.]由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所步志高研究员惠赠。

基因Ⅱ型疫苗株Lasota由扬州大学农业部畜禽传染病实验室保存。

Ⅵb亚型070422株由扬州大学农业部畜禽传染病实验室于2007年发病鸽中 分离并保存。

以上生物材料申请承诺自申请日起向公众提供20年。

1、NP、P、L基因的替换

将pNDV/I4和ApTVT/071204用AgeⅠ和FspAⅠ双酶切后，回收 ApTVT/071204小片断、pNDV/I4大片段，连接成重组质粒ApTVT/ⅥbI4。见图 2.

2、重组质粒ApTVT/ⅥbI4的酶切鉴定

质粒ApTVT/ⅥbI4经AflⅡ酶切电泳后将出现2.2kb、6.3kb、9.4kb大小的 条带，而经XhoⅠ酶切后出现1.7kb、1.8kb、6.3kb和8.4kb大小的条带，由于 1.7kb和1.8kb相差太小，电泳仅呈现一条带。（见图3）。

3、重组病毒ⅥbI4株的拯救

将5×10⁵BSR-T7/5细胞接种于35mm dish中，用含1mg/mL G418和10%小 牛血清的DMEM培养过夜，约60%~80%铺满时用于转染。将pCI-NP、pCI-P和 pCI-L3个真核表达质粒与含有NDV基因组cDNA全长的转录载体(ApTVT/ⅥbI4) 共转染BSR-T7/5细胞，18-24h后加入10%SPF胚尿囊液，60h后将转染样品用封 口膜（parafilm）封好，转移到-70℃低温冰箱反复冻融2次，然后将转染细胞轻 轻刮下，与细胞上清充分混合后接种9~11日龄SPF鸡胚，每个样品接种3枚， 0.4mL/枚，37℃孵育。定时照胚，弃去24h内死亡胚。取出24h后死亡胚置于4 ℃充分冷却，待鸡胚血管收缩后收集尿囊液。

收集的尿囊液均按OIE标准所测HA效价为9log2，与母本Ⅵb亚型毒株 JS/07/04/Pi相比上升了2个滴度。

4、新城疫病毒致弱毒株ⅥbI4的RT-PCR鉴定

将HA和HI检测均为阳性的尿囊液在SPF鸡胚上传两代后，收集尿囊液， 抽提RNA用于RT-PCR反应，利用引物APF1和APF4扩增F基因长度约为 1500bp左右大小的片段，回收目的片段进行测序鉴定，扩增片段的测序结果显 示F基因的裂解位点已突变成功（图5）。

用于扩增新城疫病毒致弱毒株ⅥbI4中F基因的引物序列为：

APF1 5'GTGATGTACTCGGACCTTCTGTGCTTGT3'

APF4 5'TCAGTCTTTGAATACATGCAGGCTGATG3'

步骤三、致弱毒株的生物学特性鉴定

1、MDT与ICPI的测定

用灭菌生理盐水分别连续10倍（10^-3、10^-4……10^-7）递增稀释致弱病毒Ⅵ bI4，每个稀释度接种5只9～11日龄SPF鸡胚，37℃孵育5d，按OIE标准方法计 算病毒的MDT；致弱病毒的尿囊液以灭菌生理盐水10倍稀释后经脑内接种10 只1日龄的SPF鸡，按OIE标准方法计算病毒的ICPI。

病毒5个稀释度的接种鸡胚在120h内没有发生死亡，说明该毒株的MDT 值大于120h；尿囊液经脑内接种1日龄SPF鸡后，ICPI的测定值仅为0.15，表 明获救病毒的毒力完全符合弱毒株的标准。

2、致弱毒株的免疫原性试验

将30只40日龄非免疫肉鸽分为3组，每组10只。第1组和第2组按0.5ml/ 只的量，经肌肉注射基因Ⅱ型Lasota（IV系苗，市售）和本发明致弱疫苗株 ⅥbI4制成的油苗，第3组免疫相同剂量PBS做皮下注射。免疫后分别于第1周、 第2周、第3周、第4周采血分离血清，分别用基因Ⅵb亚型病毒JS-07-22-Pi（由 扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室分离保存，基因组序列登录号： FJ766526）和基因Ⅱ型LaSota为4单位抗原，测定6组鸽在第1-4周内的抗体水 平。结果：灭活苗组ⅥbI4同LaSota免疫组于第4周免疫鸽抗体水平均可达到6log2 以上，同时PBS免疫组一直为0并且用Ⅵb亚型毒株做抗原时。ⅥbI4灭活苗组的 抗体水平比LaSota组高2个滴度，表明ⅥbI4灭活苗在预防鸽新城疫方面明为优 于LaSota（图6）。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  扬州大学

 

<120>  基因Ⅵb亚型新城疫病毒致弱株ⅥbI4及其构建方法

 

<130> 

 

<160>  4    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  28

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

gtgatgtact cggaccttct gtgcttgt                                        28

 

 

<210>  2

<211>  37

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

ataaggcgcc cttgcctccc tcctcctgat gtggaca                              37

 

 

<210>  3

<211>  32

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

acatcaggag gagggaggca agggcgcctt at                                   32

 

 

<210>  4

<211>  28

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  4

tcagtctttg aatacatgca ggctgatg                                        28