利用体细胞胚繁育文山兜兰苗的方法

摘要

本发明提供一种利用体细胞胚繁育文山兜兰苗的方法，经过把成熟文山兜兰果实灭菌后，切开果实取出种子，接种于诱导萌发培养基中培养得到幼胚，再转接到液体培养基中得到体细胞胚；然后分化培养得到分化苗；再转接到生根培养基上进行生根培养，最后炼苗移栽，即得到文山兜兰苗。本发明通过使用文山兜兰成熟果实无菌萌发后获得的幼胚，打破芽的休眠，促进种子萌发，促进愈伤组织生长，对植物体细胞胚进行快速培养，使得文山兜兰组培增值系数由原来1倍提高到5倍以上，大大提高了文山兜兰的繁殖效率，移栽后成活率达90%以上。

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用体细胞胚繁育文山兜兰苗的方法，属于植物组织培养技术领域。

背景技术

文山兜兰（Paph. Wenshanense）为兰科（Orchidaceae）兜兰属（Paphiopedium）植物，是兰科中的珍品，被《华盛顿公约》列为iv级珍稀濒危物种，是极具观赏价值的世界级花卉名品。文山兜兰花期长，花色庄重、素雅，花型奇特，其唇瓣状如拖鞋，故有“拖鞋兰”之称，背萼特别发达，具有艳丽的花纹。中国的兜兰属植物虽然丰富，但由于过度采集，走私出境猖獗以及生境破坏等原因，近十几年来野生兜兰的数量急剧减少，分布区逐渐萎缩，不少种类已经到了灭绝的边缘。针对野生兜兰受到掠夺性采挖、交易而导致该类群植物迅速减少甚至灭绝的状况，《华盛顿公约》（即《濒危野生动植物种国际贸易公约》，（Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora, CITES）把所有兜兰属植物列入其附录一名录。

文山兜兰分布于云南东南部文山县，生长在海拔1000～1200m的石灰岩并有茂密灌木和草丛的地区。花朵呈乳白色或黄白色，中萼片具与花瓣具有褐红色粗斑点。由于文山兜兰生长分布区域狭窄，且原始生境受损严重，野生文山兜兰种质已变得极为稀少；同时，文山兜兰的种子与大多数兰花种子一样，没有胚乳，在自然环境下极难萌发。采用传统分株方式繁殖，繁殖系数也较低，难以达到保护及开发的要求。兜兰属植物采用传统兰花无菌播种技术进行繁殖，不仅难度大，且增殖困难，对文山兜兰的有效繁殖产生了较大的瓶颈。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是采用一种体细胞胚繁育技术来繁殖文山兜兰的方法，该方法通过对培养基的筛选、培养方法的选择，利用文山兜兰种子进行体细胞胚的诱导，最终得到文山兜兰苗。

本发明采用如下技术方案：一种利用体细胞胚繁育文山兜兰苗的方法，其特征在于经过下列各步骤：

（1）把成熟文山兜兰果实灭菌后，切开果实取出种子，接种于下列诱导萌发培养基中：Ms＋2.0mg/L的6-BA＋100ml/L的椰子汁＋80g/L的香蕉泥＋50g/L的土豆泥＋5g/L的活性炭＋30g/L的蔗糖+6g/L的琼脂，pH值为5.2～5.4；暗培养至种子萌发后，转入1000～1500lx的弱光下，培养25～35天，得到幼胚；

（2）将步骤（1）得到的幼胚转接到下列液体培养基中：Ms+2.0mg/L的6-BA+0.5mg/L的TDZ+100ml/L的椰子汁+80g/L的香蕉泥+50g/L的土豆泥+5g/L的活性炭+30g/L的蔗糖，pH值为5.2～5.4；在温度为26～27℃，光照强度为1000～1500lx，转速为120～150r/min的条件下，培养40～50天，每15天更换一次上述液体培养基，过滤分离出的培养物即为体细胞胚；

（3）把步骤（2）得到的体细胞胚切散后，转接到下列分化培养基上：1/2Ms+1.0mg/L的6-BA+100ml/L的椰子汁+80g/L的香蕉泥+50g/L的土豆泥+5g/L的活性炭+30g/L的蔗糖+6g/L的琼脂，pH值为5.2～5.4；在温度为26～27℃，光照强度为2000～2500lx条件下，培养90～120天，每45天更换一次上述分化培养基，直至小苗长出2～3片的伸长叶片，且株高2～3cm时，即得到分化苗；

（4）把步骤（3）得到的分化苗切去小苗基部黄、褐部分，再转接到下列生根培养基上：1/2Ms+0.5mg/L的6-BA+1.0mg/L的NAA+100ml/L的椰子汁+100g/L的香蕉泥+50g/L的土豆泥+5g/L的活性炭+30g/L的蔗糖+6g/L的琼脂,pH值为5.2～5.4；在温度为26～27℃，光照强度为2000～2500lx的条件下，培养至苗高为4～5cm，根长3cm以上，即得种苗；

（5）将步骤（4）所得种苗在30%遮阴度的自然光下放置7～10天后，用稀释1000倍的多菌灵溶液浸泡种苗10分钟后，移栽至下列质量比的混合基质中：蕨根:兰石:细树皮＝1:4:1，保持基质水分为70～85%，并适当通风，即得到可移栽的文山兜兰苗。

所述步骤（1）的成熟文山兜兰果实是指：在文山兜兰开花的季节，待开花后5～7天，选取健康无病植株于无雨的上午10～12点进行授粉自交，自交前1天及自交后1天，停止对植株进行水喷淋，授粉后140～150天，即得饱满的成熟文山兜兰果实。

所述步骤（1）的灭菌是：先用体积浓度为70%的酒精擦拭果实表面，然后用无菌水洗涤3次，再用质量浓度为0.1%的升汞灭菌10min，用无菌水洗涤3次，用质量浓度为10%的次氯酸钠浸泡10min，最后用无菌水洗涤3次，得灭菌的成熟文山兜兰果实。

所述步骤（2）得到的培养物在解剖镜下观察，呈现类似于圆球茎的体细胞胚集合体，并且有芽尖在体细胞胚顶端出现。

所述步骤（5）的30%遮阴度的自然光是指：在自然光下，采用30%遮阴度的遮阴网进行遮阴，以防光线过强造成叶面灼烧。

本发明优点和效果在于：通过使用文山兜兰成熟果实无菌萌发后获得的幼胚，采用TDZ促进植物芽的再生和繁殖，打破芽的休眠，促进种子萌发，促进愈伤组织生长，对其它的植物激素和生理活性物质进行调节；并利用液体培养增值速度快的特点，对植物体细胞胚进行快速培养，打破文山兜兰的增值休眠，提高增值效率及增值时间，使得文山兜兰组培的增值系数由原来1倍提高到5倍以上，大大提高了文山兜兰的繁殖效率，成苗存活率达95%，移栽后成活率达90%以上，对野生文山兜兰的保护及其他珍稀兜兰的保护和繁殖提供了科学依据。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明。

实施例1

（1）种子萌发：在文山兜兰开花的5月，待开花后5天，选取健康无病植株于无雨的上午11点进行授粉自交，自交前1天及自交后1天停止对植株进行水喷淋；授粉后150天果子成熟，选择饱满的果实作为成熟文山兜兰果实，把成熟文山兜兰果实进行下列灭菌：用体积比浓度为70%的酒精擦拭果实表面，然后用无菌水洗涤3次，用质量浓度为0.1%的升汞灭菌10min，用无菌水洗涤3次，再用质量浓度为10%的次氯酸钠浸泡10min，最后用无菌水洗涤3次，切开果实取出种子，接种于下列诱导萌发培养基中：Ms＋2.0mg/L的6-BA＋100ml/L的椰子汁＋80g/L的新鲜香蕉泥＋50g/L的土豆泥＋5g/L的活性炭＋30g/L的蔗糖+6g/L的琼脂，pH值为5.2；暗培养至种子萌发后，转入1200lx的弱光下，培养30天，得到幼胚；

（2）体细胞胚的诱导：将步骤（1）所得的刚开始膨大萌发的幼胚转接到下列液体培养基中：Ms+2.0mg/L的6-BA+0.5mg/L的TDZ+100ml/L的椰子汁+80g/L的新鲜香蕉泥+50g/L的土豆泥+5g/L的活性炭+30g/L的蔗糖，pH值为5.2，在温度为27℃，光照强度为1200lx，转速为120r/min的条件下培养45天，每15天更换1次液体培养基，然后用无菌筛网过滤出培养物，即得到诱导后的体细胞胚，该培养物在解剖镜下观察，呈现类似于圆球茎的体细胞胚集合体，有芽尖在体细胞胚顶端出现；

（3）分化培养：把步骤（2）诱导出的体细胞胚切散后转接到下列分化培养基上：1/2Ms+1.0mg/L的6-BA+100ml/L的椰子汁+80g/L的新鲜香蕉泥+50g/L的土豆泥+5g/L的活性炭+30g/L的蔗糖+6g/L的琼脂，pH值为5.3，在温度为26℃，光照强度为2000lx条件下，培养100天，每45天更换一次分化培养基，直至小苗长有2片伸长叶片、株高2cm时，即得到分化苗；

（4）生根培养：把步骤（3）得到的分化苗切去小苗基部黄、褐部分，转接到下列生根培养基上：1/2Ms+0.5mg/L的6-BA+1.0mg/L的NAA+100ml/L的椰子汁+100g/L的新鲜香蕉泥+50g/L的土豆泥+5g/L的活性炭+30g/L的蔗糖+6g/L的琼脂,pH值为5.4，在温度为27℃，光照强度为2000lx的条件下，培养至苗高为4cm，根长3cm以上，即得种苗；

（5）炼苗：每年3月后，将步骤（4）所得种苗置于自然光下10天，并采用30%遮阴度的遮阴网进行遮阴，以防治光线过强造成叶面灼烧，然后使用稀释1000倍的多菌灵溶液浸泡种苗10分钟，以洗净种苗后，移栽至下列质量比的混合基质中：蕨根:兰石:细树皮=1:4:1，保持基质的水分为80%，并适当通风，即得到可移栽的文山兜兰苗，移栽后成活率达90%。

实施例2

（1）种子萌发：在文山兜兰开花的5月，待开花后6天，选取健康无病植株于无雨的上午10点进行授粉自交，自交前1天及自交后1天不对植株进行水喷淋；授粉后150天果子成熟，选择饱满的果实作为成熟文山兜兰果实，把成熟文山兜兰果实进行灭菌，用体积比浓度为70%的酒精擦拭果实表面，然后依次用无菌水洗涤3次、质量比浓度为0.1%的升汞灭菌10min、无菌水洗涤3次，再用质量比浓度为10%的次氯酸钠浸泡10min，最后用无菌水洗涤3次，切开果实取出种子，接种于下列诱导萌发培养基中：Ms＋2.0mg/L的6-BA＋100ml/L的椰子汁＋80g/L的新鲜香蕉泥＋50g/L的土豆泥＋5g/L的活性炭＋30g/L的蔗糖+6g/L的琼脂，pH值为5.4；暗培养至种子萌发后，转入1000lx的弱光下，培养35天，得到幼胚；

（2）体细胞胚的诱导：将步骤（1）所得的刚开始膨大萌发的幼胚转接到下列液体培养基中：Ms+2.0mg/L的6-BA+0.5mg/L的TDZ+100ml/L的椰子汁+80g/L的新鲜香蕉泥+50g/L的土豆泥+5g/L的活性炭+30g/L的蔗糖，pH值为5.3，在温度为26℃，光照强度为1000lx，转速为150r/min的摇床下培养40天，每15天更换1次液体培养基，然后用无菌筛网过滤出培养物，即得到诱导后的体细胞胚，该培养物在解剖镜下观察，呈现类似于圆球茎的体细胞胚集合体，有芽尖在体细胞胚顶端出现；

（3）分化培养：把步骤（2）诱导出的体细胞胚切散后转接到下列分化培养基上：1/2Ms+1.0mg/L的6-BA+100ml/L的椰子汁+80g/L的新鲜香蕉泥+50g/L的土豆泥+5g/L的活性炭+30g/L的蔗糖+6g/L的琼脂，pH值为5.2，在温度为27℃，光照强度为2500lx条件下，培养90天，每45天更换一次分化培养基，直至小苗长有2片以上伸长叶片、株高2cm以上时，即得到分化苗；

（4）生根培养：把步骤（3）得到的分化苗切去小苗基部黄、褐部分，转接到下列生根培养基上：1/2Ms+0.5mg/L的6-BA+1.0mg/L的NAA+100ml/L的椰子汁+100g/L的新鲜香蕉泥+50g/L的土豆泥+5g/L的活性炭+30g/L的蔗糖+6g/L的琼脂,pH值为5.2，在温度为26℃，光照强度为2500lx的条件下，培养至苗高为4.5cm，根长3cm以上，即得种苗；

（5）炼苗：每年3月后，将步骤（4）所得种苗置于自然光下10天，并采用30%遮阴度的遮阴网进行遮阴，以防治光线过强造成叶面灼烧，然后使用稀释1000倍的多菌灵溶液浸泡种苗10分钟，以洗净种苗后，移栽至下列质量比的混合基质中：蕨根:兰石:细树皮=1:4:1，保持基质的水分为80%，并适当通风，即得到可移栽的文山兜兰苗，移栽后成活率达90%。

实施例3

（1）种子萌发：在5月文山兜兰开花的季节，待开花后7天，选取健康无病植株于无雨的上午2点进行授粉自交，自交前1天及自交后1天不对植株进行水喷淋；授粉后150天果子成熟，选择饱满的果实作为成熟文山兜兰果实，把成熟文山兜兰果实进行灭菌，用体积比浓度为70%的酒精擦拭果实表面，然后依次用无菌水洗涤3次、质量比浓度为0.1%的升汞灭菌10min、无菌水洗涤3次，再用质量比浓度为10%的次氯酸钠浸泡10min，最后用无菌水洗涤3次，切开果实取出种子，接种于下列诱导萌发培养基中：Ms＋2.0mg/L的6-BA＋100ml/L的椰子汁＋80g/L的新鲜香蕉泥＋50g/L的土豆泥＋5g/L的活性炭＋30g/L的蔗糖+6g/L的琼脂，pH值为5.3；暗培养至种子萌发后，转入1500lx的弱光下，培养25天，得到幼胚；

（2）体细胞胚的诱导：将步骤（1）所得的刚开始膨大萌发的幼胚转接到下列液体培养基中：Ms+2.0mg/L的6-BA+0.5mg/L的TDZ+100ml/L的椰子汁+80g/L的新鲜香蕉泥+50g/L的土豆泥+5g/L的活性炭+30g/L的蔗糖，pH值为5.4，在温度为26℃，光照强度为1500lx，转速为120r/min的摇床下培养50天，每15天更换1次液体培养基，然后用无菌筛网过滤出培养物，即得到诱导后的体细胞胚，该培养物在解剖镜下观察，呈现类似于圆球茎的体细胞胚集合体，有芽尖在体细胞胚顶端出现；

（3）分化培养：把步骤（2）诱导出的体细胞胚切散后转接到下列分化培养基上：1/2Ms+1.0mg/L的6-BA+100ml/L的椰子汁+80g/L的新鲜香蕉泥+50g/L的土豆泥+5g/L的活性炭+30g/L的蔗糖+6g/L的琼脂，pH值为5.4，在温度为27℃，光照强度为2200lx条件下，培养100天，每45天更换一次分化培养基，直至小苗长有2片以上伸长叶片、株高2cm以上时，即得到分化苗；

（4）生根培养：把步骤（3）得到的分化苗切去小苗基部黄、褐部分，再转接到生根培养基上进行生根培养，生根培养基为1/2Ms+0.5mg/L的6-BA+1.0mg/L的NAA+100ml/L的椰子汁+100g/L的新鲜香蕉+50g/L的土豆泥+5g/L的活性炭+30g/L的蔗糖+6g/L的琼脂,pH值为5.3，在温度为27℃，光照强度为2200lx的条件下，培养至苗高为5cm，根长3cm以上，即得种苗；

（5）炼苗：每年3月后，将步骤（4）所得种苗置于自然光下10天，并采用30%遮阴度的遮阴网进行遮阴，以防治光线过强造成叶面灼烧，然后使用稀释1000倍的多菌灵溶液浸泡种苗10分钟，以洗净种苗后，移栽至下列质量比的混合基质中：蕨根:兰石:细树皮=1:4:1，保持基质的水分为80%，并适当通风，即得到可移栽的文山兜兰苗，移栽后成活率达90%。