一种复合抗冻液及其应用和使用该抗冻液保存人羊膜的方法

摘要

本发明公开了一种复合抗冻液及其应用和使用该抗冻液保存人羊膜的方法。其中所述的复合抗冻液，是由基础抗冻液和海藻糖组成，所述的基础抗冻液由DMEM培养液、甘油和二甲基亚砜按4.5～5.5∶3.5～4.5∶0.5～1.5的体积比组成，所述海藻糖在复合抗冻液中的浓度为0.05～0.15mol/L。采用本发明所述复合抗冻液对新鲜人羊膜进行预处理后不需使用程序降温仪降温即可直接置于液氮中保存，在简化步骤、节约成本的同时缩短了预处理的时间、减少了污染，并可长期有效维持羊膜活性。

说明书

技术领域

本发明涉及组织细胞保存技术领域，具体涉及一种复合抗冻液及其在人 羊膜液氮保存中的应用和使用该抗冻液保存人羊膜的方法。

背景技术

人羊膜(以下简称羊膜)分为上皮层、基底膜层、致密层、纤维母细胞层 和海绵层，其中后三层又称为基质层。羊膜中有细胞与基质，其中细胞又分 为羊膜上皮细胞（为干细胞，分布在上皮层）和羊膜间充质干细胞（分布在 基质层），羊膜的这二种干细胞已被证明均具有进一步向不同组织细胞分化以 及分泌多种细胞因子的干细胞特性。其基质也是良好的细胞支架材料。另外， 羊膜还具有抗原性弱、无致瘤性、不受来源与伦理限制的优势。因此，羊膜 在医学多个领域的应用越来越广泛、需求也越来越大。

解决羊膜在多个领域越来越大的需求之措施是将新鲜羊膜长期保存并建 立羊膜库，并使保存的羊膜细胞及基质活性与新鲜羊膜相似，一旦需要随时 将保存羊膜复温即可应用。

目前羊膜的保存分为常温与深低温保存二大类：1、常温保存方法简单， 就是将新鲜羊膜放在某些培养液中置于普通冰箱保存，但保存时间短、1～2 周后其活性基本丧失，该方法显然只能对新鲜羊膜进行短暂的保存。2、深低 温保存方法又分为-80℃低温冰箱保存与-196℃液氮保存，因后者较前者保存 时间更长（理论上可“永久”保存）而用于羊膜的长期保存。

国外Lee和Tseng采用DMEM(Dulbecco′s modified Eagle′s medium)/ 甘油为抗冻剂成功地将羊膜在-80℃条件下储存，此法被美国食品药品管理局 所推荐；但也有研究表明DMEM／甘油深低温保存的羊膜活性锐减，其原因可 能是在-80℃条件下分子运动未完全受抑制、细胞代谢（包括酶代谢）过程并 未完全停止，随着保存时间的延长细胞活性减低乃至死亡、羊膜细胞分泌细 胞因子的功能也因此受到影响或障碍。而在-196℃液氮条件下，细胞内各种 代谢接近于“冬眠”或停止，理论上可“永久”保存羊膜细胞活性。

目前国内有学者采用简化一步保存法(以(M199液/lO%DMSO为抗冻剂) 将羊膜储存于液氮中，该方法属于慢降温法：是将羊膜经抗冻剂预处理后先 用程序降温仪（期间用液氮降温）将羊膜逐步降到-80℃后再放入液氮保存。 慢降温法需要昂贵的程序降温仪，其操作步骤多、耗时长、被污染的环节与 费用也增加，尤其是要大量保存羊膜并建立羊膜库时，简化一步保存法的不 足显而易见。如能研究一种无需程序降温仪、保存效果好的快速降温方法， 即：将经抗冻剂预处理的羊膜直接放入液氮保存即可，其优势是不言而喻的。

然而在液氮保存羊膜时，冰冻降温与复温二个阶段都会对羊膜干细胞造 成严重损伤，使保存的羊膜干细胞活性及其分泌功能受到明显的影响。为减 轻低温对羊膜干细胞损伤，公认的方法是先用抗冻剂对羊膜进行预处理再进 行冻存。

抗冻剂减轻冷冻过程中对组织损伤的作用机制较复杂，可能与下列因素 有关：1、减低冰晶形成速度与大小，从而减轻冰晶对细胞的直接损伤；2、 减轻了细胞内外冰晶形成带来的细胞内外通透性变化；3、稳定细胞膜的结构， 提高细胞膜流动性，减轻细胞膜损伤；4、二甲基亚砜(DMSO)还具有氧自由基 清除作用。但抗冻剂（尤其是高浓度穿透性抗冻剂）本身也会造成细胞损伤。 现有技术中，将抗冻剂分为穿透性与非穿透性二种，常用的抗冻剂有二甲基 亚砜(DMSO)、丙二醇、甘油等，各种抗冻剂作用机制有所不同。由于单一抗 冻剂很难达到冷冻保护的要求且毒性也大，因此目前常采用多种不同作用机 制的抗冻剂联合组成深低温冻存的保护剂。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种复合抗冻液及其应用和使用该抗冻 液保存人羊膜的方法。采用本发明所述复合抗冻液对新鲜人羊膜进行预处理 后不需使用程序降温仪降温即可直接置于液氮中保存，在简化步骤、节约成 本的同时缩短了预处理的时间、减少了污染，并可长期有效维持羊膜活性。

本发明所述的一种复合抗冻液，它由基础抗冻液和海藻糖组成，所述的 基础抗冻液由DMEM培养液、甘油和二甲基亚砜按4.5～5.5：3.5～4.5：0.5～ 1.5的体积比组成，所述海藻糖在复合抗冻液中的浓度为0.05～0.15mol/L。

上述复合抗冻液配方中，

所述基础抗冻液优选由DMEM培养液、甘油和二甲基亚砜按5：4：1的优 选体积比组成。其中DMEM培养液可以是高糖型的也可以是低糖型的，优选低 糖型。

所述海藻糖在复合抗冻液中的浓度优选为0.1mol/L。

上述复合抗冻液只需要按配比量量取相应组分混合均匀即可，具体为： 先按4.5～5.5：3.5～4.5：0.5～1.5的体积比量取DMEM培养液、甘油和二 甲基亚砜，混合均匀，得到基础抗冻液，然后再向基础抗冻液添加海藻糖， 控制海藻糖在复合抗冻液中的浓度为0.05～0.15mol/L。

本发明还包括上述复合抗冻液在保存羊膜活性中的应用。

本发明还包括用上述复合抗冻液保存人羊膜的方法，具体是将人羊膜浸 于0～4℃复合抗冻液中3～10min，取出，平铺于两层无菌塑料薄膜之间并用 封口机封口，于密封后的塑料薄膜上平铺一层塑料管，将密封后的塑料膜和 塑料管卷成筒状，外套橡皮筋固定，编号后立即置入液氮罐中保存。通过在 密封后的塑料薄膜上平铺一层塑料管再卷成筒状，使得在冷冻时包含有羊膜 的塑料薄膜的内、外层受冷均匀。

采用上述方法保存的人羊膜的复温方法为：取出人羊膜在40～42℃无菌 生理盐水水浴中复温90～120s，再放入0～4℃无菌生理盐水中清除人羊膜 上的复合抗冻液。

与现有技术相比，本发明的特点在于：

1、所述抗冻液选用穿透性抗冻剂(甘油、二甲基亚砜)和非穿透性抗冻剂 (海藻糖)结合，前者通过迅速渗透入细胞内部，稀释胞内电解质，降低冷冻 过程中的溶液效应，改变水分子的排列，从而改变胞内外的冰晶结构；而海 藻糖则在冷冻前使细胞脱水、避免防冻剂渗入细胞从而导致细胞的过度膨胀 和渗透性损伤，从而达到降低膜相变温度、稳定细胞内生物大分子结构以及 达到良好的玻璃化特性的目的。

2、用上述复合抗冻液对新鲜羊膜预处理后直接快速置于液氮中的方 法，主要是基于羊膜是由单层上皮细胞及基质组成的非常薄的具有半通透性 的半透明膜，对抗冻剂通透性好，快速降温后可使抗冻剂形成一种具有高黏 度的介于液态和固态之间的、非晶体状态的、杂乱无章的、透明的玻璃状态， 胞内外的液体可迅速通过-5～-15℃的冷冻敏感区，避免了冻存过程中的冰晶 形成，减少了对羊膜上皮细胞的损伤；另外，在-196℃条件下分子运动完全 受到抑制，细胞全部的生理和生化反应几乎完全停止，因而细胞处于休眠状 态，从而可以长期有效地保存羊膜活性。

3、使用本发明所述复合抗冻液对新鲜羊膜进行处理后不需使用程序降温 仪降温即可直接置于液氮中保存，操作简单、成本低、减少了污染机会。

附图说明

图1为本发明所述实验例中未经任何处理的新鲜羊膜进行HE染色后羊膜 的细胞形态(光学显微镜×400)；

图2为本发明所述实验例中A组羊膜保存1个月后进行HE染色后羊膜的 细胞形态(光学显微镜×400)；

图3为本发明所述实验例中A组羊膜保存3个月后进行HE染色后羊膜的 细胞形态(光学显微镜×400)；

图4为本发明所述实验例中B组羊膜保存1个月后进行HE染色后羊膜的 细胞形态(光学显微镜×400)；

图5为本发明所述实验例中B组羊膜保存3个月后进行HE染色后羊膜的 细胞形态(光学显微镜×400)；

图6为本发明所述实验例中C组羊膜保存1个月后进行HE染色后羊膜的 细胞形态(光学显微镜×400)；

图7为本发明所述实验例中C组羊膜保存3个月后进行HE染色后羊膜的 细胞形态(光学显微镜×400)；

图8为本发明所述实验例中D组羊膜保存1个月后进行HE染色后羊膜的 细胞形态(光学显微镜×400)；

图9为本发明所述实验例中D组羊膜保存3个月后进行HE染色后羊膜的 细胞形态(光学显微镜×400)；

图10为本发明所述实验例中未经任何处理的新鲜羊膜进行台盼蓝染色 后羊膜上皮细胞的存活情况(光学显微镜×200)；

图11为本发明所述实验例中A组羊膜保存1个月后进行台盼蓝染色后羊 膜上皮细胞的存活情况(光学显微镜×200)；

图12为本发明所述实验例中A组羊膜保存3个月后进行台盼蓝染色后羊 膜上皮细胞的存活情况(光学显微镜×200)；

图13为本发明所述实验例中B组羊膜保存1个月后进行台盼蓝染色后羊 膜上皮细胞的存活情况(光学显微镜×20)；

图14为本发明所述实验例中B组羊膜保存3个月后进行台盼蓝染色后羊 膜上皮细胞的存活情况(光学显微镜×200)；

图15为本发明所述实验例中C组羊膜保存1个月后进行台盼蓝染色后羊 膜上皮细胞的存活情况(光学显微镜×200)；

图16为本发明所述实验例中C组羊膜保存3个月后进行台盼蓝染色后羊 膜上皮细胞的存活情况(光学显微镜×200)；

图17为本发明所述实验例中D组羊膜保存1个月后进行台盼蓝染色后羊 膜上皮细胞的存活情况(光学显微镜×200)；

图18为本发明所述实验例中D组羊膜保存3个月后进行台盼蓝染色后羊 膜上皮细胞的存活情况(光学显微镜×200)。

具体实施方式

下面以具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于这些实 施例。

实施例1：复合抗冻液

按5：4：1的体积比量取DMEM培养液、甘油和二甲基亚砜，混合均匀， 得到基础抗冻液，然后再向基础抗冻液中加入海藻糖，控制海藻糖在复合抗 冻液中的浓度为0.1mol/L，得到海藻糖终浓度为0.1mol/L的复合抗冻液。

实施例2：复合抗冻液

按4.5：4.5：1的体积比量取DMEM培养液、甘油和二甲基亚砜，混合均 匀，得到基础抗冻液，然后再向基础抗冻液中加入海藻糖，控制海藻糖在复 合抗冻液中的浓度为0.1mol/L，得到海藻糖终浓度为0.1mol/L的复合抗冻 液。

实施例3：复合抗冻液

按5.5：3.5：1.5的体积比量取DMEM培养液、甘油和二甲基亚砜，混合 均匀，得到基础抗冻液，然后再向基础抗冻液中加入海藻糖，控制海藻糖在 复合抗冻液中的浓度为0.05mol/L，得到海藻糖终浓度为0.05mol/L的复合 抗冻液。

实施例4：复合抗冻液

按5：3.5：0.5的体积比量取DMEM培养液、甘油和二甲基亚砜，混合均 匀，得到基础抗冻液，然后再向基础抗冻液中加入海藻糖，控制海藻糖在复 合抗冻液中的浓度为0.15mol/L，得到海藻糖终浓度为0.15mol/L的复合抗 冻液。

实验例：保存羊膜的实验

1、实验用材料：

桂林某医院剖宫产新鲜人胎盘12只，均为足月妊娠孕妇，年龄25～3O岁 获取胎盘时间为术后0.5～1h。产前通过血清学检查孕妇无人免疫缺陷病毒， 乙型、丙型肝炎病毒和梅毒感染。将胎盘用含有50μg／ml青霉素、50μg／ ml链霉素、100μg／ml新霉素和2.5μg／ml二性霉素B的无菌生理盐水反复冲 洗以去除积血，上皮面积血和基底面残存的绒毛膜和血管组织，钝性分离并 剪下完整羊膜置一无菌平盘中，此时肉眼观察其呈一半透明乳白色薄膜。然 后用无菌剪将其剪成5.0cm×5.0cm大小方形块备用。

2、实验用抗冻液

复合抗冻液1：取8ml DMEM培养液(低糖型，赛默飞世尓生物化学制品 （北京）有限公司)和8ml甘油(DMEM：甘油=1：1，体积)混合均匀，即得。

复合抗冻液2：取10ml DMEM培养液(低糖型，赛默飞世尓生物化学制品 （北京）有限公司)、8ml甘油和2ml二甲基亚砜(DMEM：甘油：二甲基亚砜 =5：4：1，体积)混合均匀，即得。

复合抗冻液3：取10ml DMEM培养液(低糖型，赛默飞世尓生物化学制品 （北京）有限公司)、8ml甘油和2ml二甲基亚砜(DMEM：甘油：二甲基亚砜 =5：4：1，体积)混合均匀，得到基础抗冻液，然后再向基础抗冻液添加0.684g 的海藻糖，得到海藻糖终浓度为0.1mol/L的复合抗冻液。

3、实验分组及保存方法

将上述取得的新鲜羊膜分成A组、B组、C组和D组，其中：

A组作为对照组，将其浸没于0～4℃生理盐水中5min，取出，平铺于两 层无菌塑料薄膜之间并用封口机封口，于密封后的塑料薄膜上平铺一层塑料 管，将密封后的塑料膜和塑料管卷成筒状，外套橡皮筋固定，编号后立即置 入液氮罐中保存。

B组、C组和D组作为实验组，将B组、C组和D组分别用上述复合抗冻 液1、复合抗冻液2和复合抗冻液3进行预处理后直接置于液氮中保存，具 体方法为：

将B组、C组和D组羊膜分别浸没于0～4℃生理盐水中5min，取出，分 别平铺于两层无菌塑料薄膜之间并用封口机封口，分别于密封后的塑料薄膜 上平铺一层塑料管，将密封后的塑料膜和塑料管卷成筒状，外套橡皮筋固定， 编号后立即置入液氮罐中保存。

4、复温方法

将各组羊膜从液氮取出后迅速置于40～42℃无菌生理盐水中复温100 秒，再将各组羊膜分别放入4℃无菌生理盐水中清除羊膜上的复合抗冻液。

5、羊膜细胞结构、活性及其分泌功能检测方法及结果

5.1HE染色方法及检测结果

取上述新鲜羊膜（未经任何处理）进行HE染色(HE染色方法参照病理检 验技术，邓步华，高等教育出版社，2005年第1版：80-83，下同)，并对羊 膜细胞形态进行检查(光学显微镜下×400)，如图1所示，可见，上皮层由单 层立方上皮细胞组成，细胞形态完好，胞核清晰居中，排列整齐紧密，其下 可见一层连续、均质红染的基底膜。

将上述A组、B组、C组和D组按上述3中所述方法保存1个月和3个月 后，分别进行取样，样品复温后分别进行HE染色，并对各组羊膜的结构进行 比较(光学显微镜下×400)，其结果如下：

A组：保存1个月可见上皮细胞变形，大小不一，细胞间距增加，胞核 深染皱缩，细胞膜较清晰，基底膜略完整，具体如图2所示；保存3个月可 见上皮细胞变形严重，排列稀疏、部分脱落，胞核不规则，部分细胞核消失， 细胞膜欠清，细胞融合，基底膜模糊不清，具体如图3所示。

B组：保存1个月可见上皮细胞扁化、排列较紧密，细胞核略有皱缩， 基底膜较完整，具体如图4所示；保存3个月可见上皮细胞变形，排列紧凑， 胞核固缩，部分靠近细胞基底部，部分细胞融合，基底膜变薄且不连续，具 体如图5所示。

C组：保存1个月可见上皮细胞结构完整，排列规则，基底膜连续，具 体如图6所示；保存3个月可见细胞及胞核扁平化，细胞间距加大，基底膜 较完整，具体如图7所示。

D组：保存1个月可见上皮细胞结构完好，胞核形态正常，细胞排列紧 凑，基底膜保存完整，形态结构更接近新鲜羊膜，具体如图8所示；保存3 个月细胞结构与保存1个月相近，具体如图9所示。

5.2台盼蓝染色

对上述取得的新鲜羊膜（未经任何处理）进行台盼蓝染色(台盼蓝染色参 照许丽英，陈家棋，周世有等，新鲜羊膜的活性维持方法研究，中国实用眼 科杂志，2002，2(20)：137-139.，下同)，其存活情况如图10所示，可见上 皮细胞全部存活，细胞结构清晰，分布均匀(光学显微镜下×200)。

将上述A组、B组、C组和D组按上述3中所述方法保存1个月和3个月 后，分别进行取样，样品复温后分别进行台盼蓝染色，并对各组羊膜的存活 情况进行比较(光学显微镜下×200)，其结果如下：

A组：保存1个月可见上皮细胞多数死亡（蓝染），细胞结构清晰，具体 如图11所示；保存3个月可见绝大多数羊膜的上皮细胞死亡，部分细胞破碎， 具体如图12所示。

B组：保存1个月可见羊膜上皮细胞部分死亡，细胞结构清晰，分布均 匀，具体如图13所示；保存3个月可见上皮细胞大面积死亡，部分细胞结构 清晰，部分细胞破碎，具体如图14所示。

C组：保存1个月可见羊膜上皮细胞大部分存活，少量细胞死亡，细胞 结构清晰，分布均匀，具体如图15所示；保存3个月可见上皮细胞死亡数量 增多，细胞结构清晰，少量细胞破碎，具体如图16所示。

D组：保存1个月可见绝大多数羊膜上皮细胞存活，细胞结构清晰，分 布均匀，具体如图17所示；保存3个月羊膜上皮细胞存活良好，与保存1个 月结果相近，具体如图18所示。

参考台盼蓝染色排除法的改良方法，将羊膜块平铺在培养皿上(上皮面向 上)，PBS液漂洗两次，直接加入0.1%台盼兰染料，室温下(20～22℃)浸染3 分钟，取出羊膜块再次用PBS液冲洗1min。将羊膜平铺在载玻片上，光学显微 镜下（×200）计算上皮细胞被染成蓝色的死亡细胞百分比，每次随机选择6 个区域，每个区域共计算1000个细胞。羊膜细胞活性检测结果如下述表1所示。

表1：各组保存羊膜上皮细胞死亡率测定结果

D组与各组比较，**P＜0.01；*P＜0.05。

由表1数据可知，D组方法保存的羊膜上皮细胞成活率最高、保存效果最 好。

5.3免疫组织化学检测及结果

取各组羊膜块用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋后连续切片，厚度约4μm。 EGF免疫组织化学染色石蜡切片酶消化程序如下：石蜡切片脱蜡至水，蒸馏 水新鲜配置3%H₂O₂，室温10分钟，以灭活内源性过氧化物酶。蒸馏水洗2分 钟×3次。滴加复合消化液，放人37℃水浴箱内20分钟，蒸馏水洗2分钟×3 次。滴加山羊血清封闭液，室温20分钟，封闭非特异性结合位点。甩去多余 液体，不洗。滴加EGF-抗(兔IgG)，37℃水浴箱内孵育1.5小时，0.01M PBS 洗2分钟×3次。PBS代替1抗染色作为阴性对照。滴加生物素化山羊抗兔 IgG，37℃水浴箱内20分钟，0.01M PBS洗2分钟×3次，滴加试剂SABC， 37℃20分钟。0.01M PBS洗10分钟×4次。DAB显色，镜下控制反应时间， 约5分钟。蒸馏水洗涤5～7分钟。脱水、透明、封片。显微镜观察、照相， 每组随机选择6个高倍视野，并应用图象分析系统(Image-Pro Plus 6.0)测 量羊膜上皮层的平均积分光密度值。羊膜细胞因子（EGF）的表达（免疫组化） 如下述表2所示。

表2各组不同保存时间羊膜EGF表达组内比较（IOD/μm²，）

D组与各组比较，**P＜0.01；*P＜0.05。

由表2数据可知，D组方法保存的羊膜上皮细胞EGF表达最高且与未经深低 温保存的新鲜羊膜组（n=6，0.3588±0.0283）基本一致（P＞0.05）。

由以上实验数据可知：用本发明所述复合抗冻液并采用本发明所述方法 对新鲜羊膜进行保存的羊膜结构完整、上皮细胞存活良好、EGF仍有较高的 表达，证明用本发明所述复合抗冻液及所述方法可较好的维持羊膜活性。