植物矮化相关蛋白GA2ox及其编码基因和应用

摘要

本发明公开了一种植物矮化相关蛋白GA2ox及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物矮化相关的由序列1衍生的蛋白质。本发明中，将含有GA2ox基因的重组质粒通过农杆菌转化法导入烟草，获得了转基因烟草，该转基因烟草具有显著矮化的表型。本发明对于植物的矮化育种具有重要价值。

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物矮化相关蛋白GA2ox及其编码基因和应用。

背景技术

矮化育种在改善作物品质方面具有重大的意义。上个世纪的“绿色革命”，在水稻 和小麦中引入矮化品种，使水稻和小麦的产量有了大幅度的提高。研究表明引起矮化 性状的基因与赤霉素代谢或信号转导相关。

赤霉素(GA)是一类重要的植物激素，具有生物活性的赤霉素在高等植物的整个生 命周期中都发挥着重要的作用，它可以促进种子萌发、茎和根的伸长、叶片伸展、表 皮毛发育、花粉管伸长、花和果实的发育等，而且植物也可以通过调节内源赤霉素的 生物合成来介导自身对环境因子的应答。在GA2-氧化酶(gibberellin 2-oxidase， GA2ox)的介导下，活性赤霉素的C-2位置添加一个羟基基团变成没有活性的GA8和 GA34。因此GA2ox的活性直接影响到活性赤霉素的含量。

高羊茅又叫苇状羊茅、苇状狐茅，为冷地型草坪草，属禾本科羊茅属多年生草本 植物。高羊茅具有营养丰富、耐践踏、抗寒、抗病、抗旱等优点，在我国许多北方城 市的草坪种植中广泛应用。但由于高羊茅垂直生长量大，也引发了一系列问题，其中 最突出的表现是：修剪频率高，草坪品质难以保证。过频的修剪，不但使草坪管理成 本提高，观赏性状下降，还加速草体营养的匮乏，导致早衰。

通过传统的育种技术获得矮化表型是比较困难的，因为常规育种方法对高羊茅进 行种质改良周期长、成效低。近年来随着分子生物学技术的飞速发展，转基因技术成 为一种不错的选择。因此克隆高羊茅中赤霉素代谢途径中的关键酶基因并且进行功能 验证，可以为高羊茅的矮化育种打下坚实的基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物矮化相关蛋白GA2ox及其编码基因和应用。

本发明提供的蛋白质，名称为GA2ox蛋白，来源于高羊茅(Festuca arundinacea)， 是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添 加且与植物矮化相关的由序列1衍生的蛋白质。

为了使(a)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序 列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

  标签   残基   序列   Poly-Arg   5-6(通常为5个)   RRRRR   Poly-His   2-10(通常为6个)   HHHHHH   FLAG   8   DYKDDDDK   Strep-tag II   8   WSHPQFEK   c-myc   10   EQKLISEEDL

上述(b)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。 上述(b)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个 或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′ 端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码所述蛋白的基因(GA2ox基因)也属于本发明的保护范围。

所述基因可为如下1)至4)中任一所述的DNA分子：

1)序列表的序列2自5’末端第148至1173位核苷酸所示的DNA分子；

2)序列表中序列2所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码植物矮化相关蛋白的DNA 分子；

4)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码植物矮化相关蛋白的 DNA分子。

上述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃条 件下杂交并洗膜。

含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的 保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体 包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外 源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表 达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所 述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动 子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本 发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子， 这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列 的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源 是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或 结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载 体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、 具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。从转基因植物的安全性考虑， 可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

所述重组表达载体具体可为将所述基因插入载体pCAMBIA1302的多克隆位点得到 的重组质粒。

扩增所述基因的全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将所述基因导入目的植物中，得到 植株高度低于所述目的植物和/或节间距小于所述目的植物的转基因植物。所述基因具 体可通过所述重组表达载体导入所述目的植物中。携带有所述基因的表达载体可通过 使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介 导、基因枪等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。 所述目的植物既可以是单子叶植物也可以是双子叶植物。所述双子叶植物具体可为烟 草(如Nicotiana tabacum)。所述节间距具体可为植株从下往上数第二节间的长度。

本发明中，将含有GA2ox基因的重组质粒通过农杆菌转化法导入烟草，获得了转 基因烟草，该转基因烟草具有显著矮化的表型。将GA2ox基因导入高羊茅，理论上可 以获得矮化的高羊茅品种，实现减少修剪频率，且不易倒伏的目标。本发明对于植物 的矮化育种具有重要价值。

附图说明

图1为重组质粒pCAMBIA1302-GA2ox的构建流程图。

图2为PCR扩增获得全长GA2ox基因的电泳图。

图3为T₀代转基因烟草的PCR鉴定电泳图；1为1kb DNA ladder，由下到上分别 为250bp，500bp，750bp，1000bp，1500bp，2000bp；2为阳性对照(重组质粒 pCAMBIA1302-GA2ox)；3为阴性对照(野生型烟草)；4-13依次为T₀代转基因烟草L1 至L10。

图4为T₀代转基因烟草的RT-PCR鉴定电泳图；WT为阴性对照(野生型烟草)；L3、 L4和L6依次为转基因烟草L3、L4和L6。

图5为T₀代转基因烟草的荧光显微镜观察照片；A为野生型烟草在自然光下的照 片；B为野生型烟草在绿色荧光下的照片；C为转基因烟草L3在自然光下的照片；D 为转基因烟草L3在绿色荧光下的照片。

图6为T₀代转基因烟草的表型照片；WT为阴性对照(野生型烟草)；L3、L4和L6 依次为转基因烟草L3、L4和L6。

图7为T₀代转基因烟草的节间距统计结果；WT为15株野生型烟草节间距的平均 值；GA2ox为15株T₀代植株(转基因烟草)节间距的平均值。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明， 均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实 验，结果取平均值。高羊茅(Festuca arundinacea)：中文名称为追寻者，英文名 称为Quest，购于东方草业公司。烟草(Nicotiana tabacum)：购于东方草业公司， 用作实施例的出发植物和野生型烟草对照。农杆菌LBA4404：购于天根生化科技有限 公司。

实施例1、GA2ox蛋白及其编码基因的发现

1、利用SDS法提取高羊茅的RNA。

2、以完整性好、无污染的RNA为模板，用M-MLV酶(购自Promage公司)反转录 RNA为cDNA。

3、中间片段的克隆

根据GA2ox的同源保守序列设计引物(F1和R1；M＝A/C，S＝G/C，V＝A/G/C)，以高羊 茅的cDNA为模板进行PCR扩增，产物经回收测序，获得244bp的中间片段。

F1(5’引物)：5’-MTS GGG TGG VTC GAG TAC-3’；

R1(3’引物)：5’-GGT AGT GGT TCA SSC GGA-3’。

4、3’-末端的克隆

根据中间片段的测序结果设计引物3’GSP I(gene-specific primer)，引物序列 是5’-CAC GTC CAC CGC GCT GAG AGA C-3’，为了提高产物特异性，在GSP I下游再 设计一个巣式引物3’GSPII，引物序列是5’-GCG TGC TGG CCG ACA TGG TGA C-3’。

利用的通用引物序列如下：

AP(adapter primer)：5’-ATT CTA GAG GCC GAG GCG GCC GAC ATG TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT V-3’(V＝A/G/C)。

AUAP(abridged universal amplification primer)：5’-ATT CTA GAG GCC GAG GCG GCC G-3’。

第一轮PCR反应体系(50μl)：10×PCR buffer 5μl，dNTP Mix(2.5mM each) 4μl，3’GSP I(10μM)1μl，AP(10μM)1μl，cDNA 2μl，Ex taq DNA聚合酶 0.25μl，ddH₂O 36.75μl。

第二轮PCR反应体系(50μl)：10×PCR buffer 5μl，dNTP Mix(2.5mM each) 4μl，3’GSP II(10μM)1μl，AUAP(10μM)1μl，PCR产物稀释10倍2μl，Ex taq DNA聚合酶0.25μl，ddH₂O 36.75μl。

将第二轮的PCR产物电泳检测，胶回收，测序分析，获得923bp的3’末端片段。

5、5’-末端的克隆

对cDNA3’末端进行加尾，反应体系(50μl；NEB公司提供)：末端转移酶TdT 0.5μl，10×buffer 5μl，dCTP(10mM)1μl，CoCl₂ 5μl，反转录产物20μl， ddH₂O 18.5μl。

利用的通用引物序列如下：

AAP(abridged anchor primer)：5’-GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACG GGI IGG GII GGG IIG-3’。

AUAP(abridged universal amplification primer)：5’-GGC CAC GCG TCG ACT AGT AC-3’。

根据中间片段的测序结果设计引物5’GSP I(gene-specific primer)，引物序列 为：5’-TGG TTC AGC CGG AAC ACC TGG TCG CTC-3’，为了提高产物特异性，在GSP I上游再设计一个巣式引物GSP II，引物序列为：5’-GCA CGG GAG GCC TTT TCG GA-3’。

第一轮PCR反应体系(50μl)：10×PCR buffer 5μl，dNTP Mix(2.5mM each) 4μl，5’GSP I(10μM)1μl，AAP(10μM)1μl，cDNA加尾产物2μl，Ex taq DNA 聚合酶0.25μl，ddH₂O 36.75μl。

第二轮PCR反应体系(50μl)：10×PCR buffer 5μl，dNTP Mix(2.5mM each) 4μl，5’GSP II(10μM)1μl，AUAP(10μM)1μl，PCR产物稀释10倍2μl，EX taq DNA聚合酶0.25μl，ddH₂O 36.75μl。

将第二轮的PCR产物电泳检测，胶回收，测序分析，获得530bp的5’末端片段。

6、全长序列的获得

以高羊茅的cDNA为模板，利用引物F2和R2进行PCR扩增。将PCR扩增产物进行 测序，测序结果表明，PCR扩增产物的核苷酸序列如序列表的序列2所示。

F2(5’引物)：5’-TGC ACC ACC GAA GCT CGA GCT-3’；

R2(3’引物)：5’-CTT AGC AAA CAC AAG ACT CCC ATA AAT AGA G-3’。

将序列表的序列1所示的蛋白质命名为GA2ox蛋白(由341个氨基酸残基组成)。 将GA2ox蛋白的编码基因命名为GA2ox基因，其全长序列如序列表的序列2所示，开 放阅读框为序列表的序列2自5’末端第148至1173位核苷酸。

实施例2、转基因植物的获得和鉴定

一、重组质粒pCAMBIA1302-GA2ox的构建

构建流程图见图1。

1、提取高羊茅的总RNA，反转录为cDNA。

2、以步骤1的cDNA为模板，用GA2ox_5’和GA2ox_3’组成的引物对进行PCR 扩增，得到PCR扩增产物(靶序列为去除终止密码子的GA2ox基因开放阅读框)。

GA2ox_5’：5’-ACT AGT ATG GTG GTG CTC GCG AAG-3’；

GA2ox_3’：5’-ACT AGT GGA CCG GTG GTG GTG GCC-3’。

PCR扩增产物的1.0％琼脂糖凝胶电泳图见图2。

3、将步骤2的PCR扩增产物插入pMD18-T simple载体(购自TaKaRa生物工程公 司)，得到重组质粒pMD18-Tsimple-GA2ox。

4、将重组质粒pMD18-Tsimple-GA2ox进行测序，测序结果表明，PCR扩增产物的 两端分别为Spe I酶切识别序列，酶切识别序列之间为序列表的序列2自5’末端第 148至1170位核苷酸所示的DNA。

5、用限制性内切酶Spe I单酶切重组质粒pMD18-Tsimple-GA2ox，回收小片段(约 1035bp)。

6、用限制性内切酶Spe I单酶切载体pCAMBIA1302(Center for the Application  of Molecular Biology to International Agriclture，www.cambia.org)，回收载体 骨架(约10549bp)。

7、将步骤5的小片段和步骤6的载体骨架连接，得到重组质粒pCAMBIA1302-GA2ox (GA2ox组成型高效表达载体)。

根据测序结果，对重组质粒pCAMBIA1302-GA2ox进行结构描述如下：在载体 pCAMBIA1302的Spe I酶切位点插入了序列表的序列2自5’末端第148至1170位核 苷酸所示的DNA(去除终止密码子的GA2ox基因和载体上的GFP基因形成融合基因)。

二、重组质粒pCAMBIA1302-GA2ox导入农杆菌

1、农杆菌感受态细胞的制备

(1)挑取农杆菌LBA4404单菌落接种于100ml YEB液体培养基中，振荡培养 (220rpm、28℃)至OD₆₀₀＝0.6；

(2)将步骤(1)的菌液转入无菌离心管，5000rpm离心5min，去上清，将沉淀 加入10ml预冷的0.15M CaCl₂水溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min；

(3)将步骤(2)的悬浮液离心(4℃、5000rpm)5min，去上清，将沉淀加入4ml 预冷的含10％(体积百分含量)甘油的0.15M CaCl₂水溶液，轻轻悬浮；

(4)将步骤(3)的悬浮液分装于无菌eppendorf管中，每管200μl，于液氮中 速冻1min，冻存于-70℃。

2、重组质粒转化农杆菌

取1μg重组质粒pCAMBIA1302-GA2ox加入到200μl农杆菌LBA4404感受态细胞中， 混匀，静止5min；液氮中速冻1min，37℃水浴5min，冰浴5min，加入1ml YEB液体 培养基，振荡培养(28℃、150rpm)4h；5000rpm离心3min，弃上清，沉淀加入0.1ml YEB液体培养基，重新悬浮细胞；涂布于含50μg/ml卡那霉素和75μg/ml利福平的 YEB固体平板上，28℃倒置培养约48h。

3、PCR鉴定阳性克隆

鉴定所用的引物如下(引物是针对骨架载体设计的，目标片段为1035bp左右)：

5’引物：5’-ACT AGT ATG GTG GTG CTC GCG AAG-3’；

3’引物：5’-ACT AGT GGA CCG GTG GTG GTG GCC-3’。

鉴定结果表明：重组质粒pCAMBIA1302-GA2ox已经成功转入农杆菌LBA4404中， 得到了重组农杆菌。

三、转化烟草

1、将步骤二得到的重组农杆菌接种于YEB液体培养液(含有100μg/ml卡那霉素、 100μg/ml链霉素和75μg/m利福平；卡那霉素抗性基因来自载体pCAMBIA1302，链霉 素抗性基因来自农杆菌LBA4404自带的辅助质粒pBA4404，利福平抗性基因来自农杆菌 LBA4404)，振荡培养(28℃、220rpm)至OD₆₀₀为0.6-0.8，4000rpm离心15分钟，去 上清，沉淀用5-10倍体积的MS液体培养基(pH5.8)悬浮，得到重组农杆菌菌液。

2、将无菌的烟草叶片切去边缘和主要叶脉，切成0.4×0.6cm²大小的外植体。

3、将步骤2的外植体在步骤1的重组农杆菌菌液中浸泡5分钟。

4、用无菌滤纸吸干植物材料表面的菌液，转入上铺一层滤纸的MS基本培养基， 25℃暗培养。

5、三天后，将植物材料转到含有抗生素的分化培养基(MS基本培养基+3mg/L 6- 苄氨基嘌呤+0.2mg/L a-萘乙酸+10mg/L潮霉素+500mg/L羧苄青霉素)中进行培养。

6、待抗性芽生长至2-3cm高时，切下小芽转入生根培养基(MS基本培养基+10mg/L 潮霉素+200mg/L羧苄青霉素)中诱导生根。

7、待根长至10-20cm长(约4周)，且具有一定数量即可去掉封口膜，在组培室 中锻炼2-3天，然后移栽在花盆中在室温下锻炼2-3周，最后移栽至大田栽种，即为 T₀代植株。

将载体pCAMBIA1302导入农杆菌LBA4404，得到对照农杆菌；用对照农杆菌代替 重组农杆菌进行步骤1至7，得到对照植株。

四、植株的鉴定

1、PCR鉴定

分别以T₀代植株和对照植株的基因组DNA为模板(重组质粒pCAMBIA1302-GA2ox 作为阳性对照、野生型烟草作为阴性对照)，用F3(对应GA2ox基因)和R3(对应GFP 基因)组成的引物对进行PCR鉴定。

F3(5’引物)：5’-CGA CTC CCT CCA GGT GCT GAC GAA T-3’；

R3(3’引物)：5’-GGC GGG TCT TGA AGT TGG CTT TGA T-3’。

PCR反应体系(50μl)：ddH₂O 37μl，10×PCR Buffer 5μl，dNTP(25mM)4μl， 5’引物(5pmol/μl)1μl，3’引物(5pmol/μl)1μl，rTaq酶(5U/μl)1μl， 模板(1μg/μl)1μl。

PCR反应程序：第一轮：94℃变性5min；第二轮：94℃变性50sec，66℃复性50sec， 72℃延伸70s，30个循环；第三轮：72℃延伸10min。

反应结束后，PCR扩增产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，目标条带为800bp左右。 T₀代植株中有25株鉴定为阳性。部分PCR阳性植株(L1至L10)的鉴定结果见图3。

2、RT-PCR鉴定

将PCR鉴定为阳性的25株植株中的三株(L3、L4和L6)和野生型烟草分别进行 步骤2的RT-PCR检测。

(1)Trizol法分别提取植株L3、L4和L6和野生型烟草的总RNA。

(2)以完整性好、无污染的总RNA为模板，用M-MLV酶(购自Promage公司)反 转录RNA为cDNA。

反转录反应体系(15.0μl)：RNA(1.0μg/μl)2.0μl，Oligd T 2.0μl，RNfree H₂O 11.0μl。将上述混合物混匀后，短暂离心将之收集于管底，72℃温育5min，再立 即置于冰上5min，再加入以下成分(总体积25.0μl)：5×M-MLV Buffer 5.0μl， dNTP(25mM)1.5μl，RTase M-MLV(200U/μl)1.0μl，HPR(40U/μl)0.65μl，RNfree H₂O 1.85μl。将上述混合物混匀，短暂离心将之收集于管底，在42℃温育60min，70℃ 反应15min，取出置于冰上，离心后储存于-20℃。

(3)以0.5μl步骤(2)的反转录产物(cDNA)为模板进行PCR扩增，用F3和 R3组成的引物对进行PCR鉴定。

PCR反应体系和PCR反应程序同步骤1。

将NtActin作为内参基因，PCR鉴定内参基因的引物对如下：

F4：5’-GGA ATA GTA AGC AAC TGG GAC GT-3’；

R4：5’-CTG AGC CAA TGG TAA TGA CCT G-3’。

结果见图4。L3、L4和L6均获得了预期约800bp的片段，表明GA2ox基因在烟 草中进行了RNA水平的表达。

3、荧光显微镜下观察GFP

去除终止密码子的GA2ox基因和载体上的GFP基因形成融合基因，因此可以通过 荧光显微镜下观察转基因烟草根中绿色荧光蛋白，来进行GA2ox基因的鉴定。

PCR鉴定为阳性的25株T₀代植株在荧光显微镜下均显示绿色荧光，野生型烟草不 能观察到绿色荧光。L3和野生型烟草在荧光显微镜下的照片见图5。

4、表型观察和性状统计分析

将PCR鉴定为阳性的15株T₀代植株、转空载体植株(15株)和野生型烟草(15 株)在成熟期拍照并测量从下往上数第二节间的长度(节间距)。结果均取15株的平 均值。

PCR鉴定为阳性的15株T₀代植株的节间距显著小于野生型植株的节间距。转空载 体植株的节间距与野生型植株的节间距没有显著差异。部分植株照片见图6。节间距 结果见表2和图7。

表2植株的节间长度

  节间距(cm)   野生型烟草   0.69±0.0446   PCR鉴定为阳性的T₀代植株   0.2±0.049

结果表明：PCR鉴定为阳性的15株T₀代植株(转基因烟草)节间长度明显变短， 即GA2ox基因引起了植株矮化。