克隆甘薯褪绿矮化病毒SPCSV全基因组的引物对及方法

摘要

本发明涉及涉及一种克隆甘薯褪绿矮化病毒SPCSV全基因组的引物对及方法。该引物有五对，依次具有如SEQIDNO.1～SEQIDNO.10所示的核苷酸序列；以感染SPCSV的甘薯植株饲养烟粉虱，收集感染SPCSV的烟粉虱，提取其总RNA作为PCR模板，进行反转录，再以反转录产物作为模板，分别利用上述引物进行PCR扩增，对所得片段进行拼接，即获得SPCSV基因组全长序列。本发明所设计引物扩增片段相互重叠，覆盖了SPCSV基因组两条RNA近全长序列；本发明利用带毒烟粉虱克隆甘薯褪绿矮化病毒全基因组的方法，方法简便、有效，省时、省力，为研究SPCSV提供了一个有用工具。

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种克隆甘薯褪绿矮化病毒SPCSV全基因组的引物对及方法。

背景技术

甘薯褪绿矮化病毒(Sweet potato chlorotic stunt virus，SPCSV)属于长线形病毒科(Closteroviridae)毛形病毒属(Crinivirus)成员。SPCSV可与马铃薯Y病毒属（Potyvirus）的甘薯羽状斑驳病毒协生共侵染甘薯引起甘薯病毒病害SPVD（sweet potato virus disease，SPVD）。SPVD是甘薯上的毁灭性病害，通常可使甘薯减产50%～98%，甚至绝收。我国自2010年首次发现SPCSV以来，目前在全国多个甘薯种植区陆续检测到该病毒病的存在，严重威胁我国的甘薯产业。

分离克隆该病毒基因组的全长序列，进一步研究病毒基因组的结构和功能，有助于探索更有效的抗病毒基因工程途径，对于SPVD的防治具有重要意义。SPCSV的基因组为双组分单链正义RNA，基因组大小为17.6 kb左右，其基因组是已知的植物病毒中第二大的单链正义RNA病毒。分离克隆植物病毒全基因组的常规方法是首先提纯病毒，然后利用纯化病毒的RNA或感染病毒的植物叶片的总RNA进行克隆。由于SPCSV常常与多种病毒混合侵染甘薯，分离纯化极为困难，而且该病毒在甘薯体内含量很低，利用常规的克隆方法很难获得SPCSV基因组全长序列。因此，截止目前，国际上仅获得了两个SPCSV分离物的全基因组序列，国内尚未见有报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供了一组能使扩增片段相互重叠且覆盖SPCSV基因组两条RNA近全长序列的引物对；还提供了一种简便、有效的克隆甘薯褪绿矮化病毒全基因组的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

一种用于克隆甘薯褪绿矮化病毒SPCSV全基因组的引物对，包括五对引物，其核苷酸序列依次为：

RNA1-1-5'         5’-GAAATACTTCCAGCTATCCAAATTTGGTG-3’

RNA1-2989-3'      5’-ATACGTCTCTCTCCAACGACAAC-3’；

RNA1-2420-5'     5’-AGAGAACAACTTCATTTCTACTCAATTGT-3’

RNA1-5596-3'     5’-GATAAATAAGTTTACCTGTATTGTCGGTC-3’；

RNA1-4410-5'     5’-GAGCATCAACTGTGGACGGCGAACCAAGC-3’

RNA1-8637-3'     5’-AACCTAGTTATTTAAATACTAGGTTTTCC-3’；

RNA2-53-5'      5’-CATTGGTTGTCGTCATGACTCGCAT-3’

RNA2-5599-3'    5’-CCAACTTACCAGATTTCGAGAACTGTAC-3’ ；

RNA2-4440-5'     5’-ATGCGTCTCGTCGTGACGTCCAGACTG-3’

RNA2-8223-3'     5’-GGCCTAGTTATTTAAATACTAGGTTTTCC-3’ 。

一种克隆甘薯褪绿矮化病毒SPCSV全基因组的方法，包括如下步骤：

（1）按照上述五组引物核苷酸序列分别合成出对应的引物；

（2）将感染SPCSV的甘薯植株种植于防虫温室内，并以其饲养烟粉虱，收集以该感染SPCSV的甘薯植株饲养至少3天的烟粉虱用液氮速冻后，置于-70℃下保存备用；

（3）取上步所得烟粉虱至少10头，放入加有预冷RNA提取液的离心管中，提取烟粉虱的总RNA作为PCR模板，进行反转录；

（4）以上步所得反转录产物作为模板，分别利用上述步骤（1）所得的引物进行PCR扩增，预期扩增片段大小分别为2.9kb、3.2kb、4.2kb、5.6kb和3.8kb；

（5）用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，然后将PCR产物进行纯化，分别与pMD19-T载体连接，再将连接产物转化大肠杆菌TG1，经蓝白斑筛选和PCR鉴定后获得阳性克隆；核苷酸序列测定由TaKaRa公司完成，测序完成后，对5个片段进行拼接，即获得SPCSV基因组全长序列。

在所述步骤（3）中，反转录的反应体系为：3.75 μL RNA 模板，2μl 5×RT buffer，0.5μL浓度为10 μmol/L的下游引物，3 μL浓度为2.5 mmol/L 的dNTPs，0.25 μL浓度为40U/μl的RNase抑制剂和0.5 μL浓度为5U/μl的AMV反转录酶；所述下游引物为RNA1-2989-3'、RNA1-5596-3'、RNA1-8637-3'、RNA2-5599-3'或RNA2-8223-3'；反转录的反应程序为：42℃反转录60min，99℃ 5min，5℃ 5min，反应后得到反转录产物。

在所述步骤（4）中，PCR的反应体系为50μl，包括：5 μL10×PCR buffer，4μL浓度为2.5 mmol/L的dNTPs，浓度为10 μmol/L 的引物各1 μL，0.5μL浓度为5U/μL的LA Taq酶，5 μl反转录产物作模板，余量为ddH₂O；所述引物为RNA1-1-5'和RNA1-2989-3'，或为RNA1-2420-5'和RNA1-5596-3'，或为RNA1-4410-5'和RNA1-8637-3'，或为RNA2-53-5' 和RNA2-5599-3'，或为RNA2-4440-5'和RNA2-8223-3'；PCR反应程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30s，54℃退火30s，根据目的条带大小，按照1kb/min计算延伸时间，72℃延伸3～6 min，完成35个循环，最后72℃延伸10min。

本发明具有积极有益的效果：

1.本发明设计的5对引物扩增片段相互重叠，覆盖了SPCSV基因组两条RNA近全长序列。

2.由于SPCSV常常与多种病毒混合侵染甘薯，分离纯化极为困难，而且SPCSV在甘薯体内含量很低，因此，利用纯化病毒或提取感病甘薯叶片总RNA的常规方法很难获得该病毒基因组的全长序列。本项发明提供了一种利用带毒烟粉虱克隆甘薯褪绿矮化病毒全基因组的方法，方法简便、有效，省时、省力，为研究SPCSV提供了一个切实有效的途径。

附图说明

图1为利用引物RNA1-1-5'和RNA1-2989-3'从带毒烟粉虱中扩增出的大片段的电泳图；

图2为利用引物RNA1-2420-5'和RNA1-5596-3'从带毒烟粉虱中扩增出的大片段的电泳图；

图3为利用引物RNA2-53-5'和RNA2-5599-3'从带毒烟粉虱中扩增出的大片段的电泳图；

图4为利用引物RNA1-4410-5'和RNA1-8637-3'及RNA2-4440-5'和RNA2-8223-3'从带毒烟粉虱中扩增出的大片段的电泳图。

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步阐述本发明。下述实施例中所涉及的试验方法或分析方法，如无特别说明，均为常规方法，所用试剂如无特别说明，均为市售。

实施例1：一种从烟粉虱中克隆甘薯褪绿矮化病毒SPCSV全长基因组的方法

（1）材料与方法

①供试毒源和烟粉虱：将感染SPCSV（2010年7月，采自江苏徐州，采集人张振臣）的甘薯植株种植于防虫温室内用于饲养烟粉虱，收集饲养3d以上的烟粉虱用液氮速冻后，置于-70℃保存备用。

②试剂及试剂盒：UNIQ-10柱式总RNA抽提试剂盒为上海生工生物工程公司产品；UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒购自北京百泰克生物技术公司；RNase 抑制剂、AMV反转录酶、LATaq DNA聚合酶、pMD19-T载体购自TaKaRa公司，其它常用试剂为国产分析纯。

③引物设计：根据GenBank中已登录的SPCSV全基因组（FJ807784和FJ807785）的核苷酸序列设计5对引物（如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.10所示）：

RNA1-1-5'：     5’-GAAATACTTCCAGCTATCCAAATTTGGTG-3’,

RNA1-2989-3'：  5’-ATACGTCTCTCTCCAACGACAAC-3’;

RNA1-2420-5'：  5’-AGAGAACAACTTCATTTCTACTCAATTGT-3’,

RNA1-5596-3'：  5’-GATAAATAAGTTTACCTGTATTGTCGGTC-3’;

RNA1-4410-5'：  5’-GAGCATCAACTGTGGACGGCGAACCAAGC-3’,

RNA1-8637-3'：  5’-AACCTAGTTATTTAAATACTAGGTTTTCC-3’;

RNA2-53-5'：    5’-CATTGGTTGTCGTCATGACTCGCAT-3’,

RNA2-5599-3'：  5’-CCAACTTACCAGATTTCGAGAACTGTAC-3’;

RNA2-4440-5'：  5’-ATGCGTCTCGTCGTGACGTCCAGACTG-3’,

RNA2-8223-3'：  5’-GGCCTAGTTATTTAAATACTAGGTTTTCC-3’。

设计的5对引物扩增片段相互重叠，覆盖了SPCSV基因组两条RNA近全长序列，预期扩增片段大小分别为2.9kb、3.2kb、4.2kb、5.6kb和3.8kb。引物由上海生工生物工程公司合成。

④ RT-PCR：取-70℃保存的烟粉虱10头以上，放入加有30μL预冷的RNA提取液(20mmol/L碳酸铵, pH9.0, 2%SDS, 2 mmol/L EDTA, 200μg/ ml 皂土)的1.5ml离心管中，用DEPC处理过的研磨棒充分研磨，再用170μL的抽提液冲洗研磨棒，然后按照UNIQ-10柱式总RNA抽提试剂盒说明书，提取烟粉虱体内总RNA。利用RT-PCR试剂盒进行反转录和PCR。反转录体系为10μl，包括：3.75 μL RNA 模板，2μl 5×RT buffer，0.5μL浓度为10 μmol/L的下游引物（RNA1-2989-3'、RNA1-5596-3'、RNA1-8637-3'、RNA2-5599-3'或RNA2-8223-3'），3 μL浓度为2.5 mmol/L 的dNTPs，0.25 μL浓度为40U/μl的RNase抑制剂和0.5 μL浓度为5U/μl的AMV反转录酶。反转录的反应程序为：42℃反转录60 min，99℃ 5 min，5℃ 5 min，反应后得到反转录产物。

PCR的反应体系为50μl，包括：5 μL10×PCR buffer，4μL浓度为2.5 mmol/L的dNTPs，浓度为10 μmol/L 的引物（RNA1-1-5'和RNA1-2989-3' ；RNA1-2420-5'和RNA1-5596-3'；RNA1-4410-5'和RNA1-8637-3'；RNA2-53-5' 和RNA2-5599-3'；RNA2-4440-5'和RNA2-8223-3'）各1 μL，0.5μL浓度为5U/μL的LA Taq酶，5 μl反转录产物作模板，余量为ddH₂O。

PCR扩增反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，54℃退火30 s，根据目的条带大小，按照1kb/min计算延伸时间，72℃延伸3-6 min，完成35个循环，最后72℃延伸10 min。 

用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，检测时上样量为20μl，100V稳压电泳50 min，EB染色，经UVP凝胶成像系统观察和照相。

⑤RT-PCR扩增产物的克隆和序列测定：将RT-PCR产物进行纯化，分别与pMD19-T载体连接，连接产物转化大肠杆菌TG1，经蓝白斑筛选和PCR鉴定后获得阳性克隆。核苷酸序列测定由TaKaRa公司完成，利用DNAMAN和BLAST软件对所测序列进行比较分析。

（2）结果与分析

①RT-PCR扩增SPCSV基因组序列：以提取的烟粉虱总RNA为模板，分别利用上述的5对引物进行RT-PCR扩增。结果表明，从带毒烟粉虱中均能较容易地扩增出与预期大小一致的特异性条带（见附图1至图4）。

② RT-PCR扩增产物的克隆和序列测定：将RT-PCR产物进行纯化，分别与pMD19-T载体连接，连接产物转化大肠杆菌TG1，经蓝白斑筛选和PCR鉴定后获得阳性克隆。核苷酸序列测定由TaKaRa公司完成，利用DNAMAN和BLAST软件对所测序列进行比较分析。结果表明，所克隆的片段与已发表（Cuellar,W.J., Cruzado,R.K., Fuentes,S., Untiveros,M., Soto,M. and Kreuze,J.F. Sequence characterization of a Peruvian isolate of Sweet potato chlorotic stunt virus: Further variability and a model for p22 acquisition Virus Res. 157 (1), 111-115 (2011)）的东非株系的核苷酸序列一致性为82％，与已发表（FJ807784和FJ807785）的西非株系的核苷酸序列一致性分别为99％。

③SPCSV基因组近全长序列的拼接：利用DNAMAN软件对获得的各个片段进行拼接，对照测序峰图纠正错误碱基，获得SPCSV基因组全长序列。

 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

SEQUENCE LISTING

 

<110>  河南省农业科学院

<120>  克隆甘薯褪绿矮化病毒SPCSV全基因组的引物对及方法

<130>  /

<160>  10   

<170>  PatentIn version 3.2

<210>  1

<211>  29

<212>  DNA

<213>  人工合成

<400>  1

gaaatacttc cagctatcca aatttggtg                                       29

 

<210>  2

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工合成

<400>  2

atacgtctct ctccaacgac aac                                             23

 

<210>  3

<211>  29

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  3

agagaacaac ttcatttcta ctcaattgt                                       29

<210>  4

<211>  29

<212>  DNA

<213>  人工合成

<400>  4

gataaataag tttacctgta ttgtcggtc                                       29

 

<210>  5

<211>  29

<212>  DNA

<213>  人工合成

<400>  5

gagcatcaac tgtggacggc gaaccaagc                                       29

<210>  6

<211>  29

<212>  DNA

<213>  人工合成

<400>  6

aacctagtta tttaaatact aggttttcc                                       29

<210>  7

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工合成

<400>  7

cattggttgt cgtcatgact cgcat                                           25

<210>  8

<211>  28

<212>  DNA

<213>  人工合成

<400>  8

ccaacttacc agatttcgag aactgtac                                        28

<210>  9

<211>  27

<212>  DNA

<213>  人工合成

<400>  9

atgcgtctcg tcgtgacgtc cagactg                                         27

<210>  10

<211>  29

<212>  DNA

<213>  人工合成

<400>  10

ggcctagtta tttaaatact aggttttcc                                       29