一种兼抗烟草黑胫病和青枯病的生防菌株Trb3

摘要

本发明属于植物保护技术领域，涉及一种兼抗烟草黑胫病和青枯病的生防菌株Trb3，为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，所述菌株Trb3制备菌剂的方法是，将所述菌株Trb3在LB培养液28℃180rpm振荡培养36-40小时，然后6000rpm离心10分钟，用灭菌水配成进行稀释配制成菌剂，菌剂成品中活菌总浓度为1×109～1×1010u/ml。Trb3菌株菌剂在烟草移栽前蘸根或移栽时灌根使用，移栽后在烟草黑胫病和青枯病即将进入发病期时灌根使用。温室中Trb3菌株菌剂对烟草黑胫病防治效果达72.3％，对烟草青枯病防治效果为65.7％，田间施用菌株Trb3菌剂对烟草黑胫病、青枯病混发烟田防治效果为61.04％。

说明书

技术领域

本发明属于植物保护技术领域，特别是涉及一种兼抗烟草黑胫病和青枯病的生防菌株Trb3，用于烟草土传病害的无公害防治。 

背景技术

烟草黑胫病和青枯病是烟草上最具毁灭性的两种病害之一。 

烟草黑胫病又称烟草疫病，烟农称为“黑杆疯”、“黑根”、“乌头病”，是由Phytophthora parasitica var nicotianae引起的，中国各主要产烟区均有不同程度发生，发病较重的区域一般发病率达5％～15％，重者达30％以上，给烟草生产造成很大损失。 

烟草青枯病是由布可氏杆菌(Ralstonia solanacearum)引起的一种烟草土传病害，在我国南方烟区发病普遍，其中广东、广西、福建、四川、浙江、湖南和贵州较重，发病严重时可使全田烟草枯死。烟草黑胫病和青枯病田间发病条件和发病时期接近，云南、贵州、四川、湖南、广东、广西、福建等南方烟区发生亦相当普遍，并多与烟草青枯病混合发生，故危害更为严重。 

近年来，随着烟草种植年限延长，全国各烟区发病情况日趋严重。 

由于生产上栽培烟草品种对这两种病害抗性较差或综合抗性不足，目前仍依赖化学防治。防治烟草黑胫病主要农药品种为甲霜灵和霜霉威，防治烟草青枯病主用药剂为农用硫酸链霉素。药剂品种较为单一，且均已有十几年甚至几十年的使用历史，导致防治效果下降，防治成本增加，环境污染加剧。 

此外，烟草属于吸食性产品，随着人们对环境与健康的日益重视，减少农药使用，促进安全优质烟叶生产，对改善农业生态环境具有重要意义。 

生物防治对环境友好，在某些情况下防治效果优于化学药剂，特别是在病害发病高峰期常伴随高温多雨，化学药剂难以发挥作用。因此，生防菌剂的开发成为近期研究的热点，无致病力菌株、芽孢杆菌、假单胞菌、链霉菌等生防因子研究应用较多。 

但现有研究仅局限于单一防治对象筛选生防菌株，而烟草黑胫病和青枯病在多数烟区为混合发生，导致防病效果不佳。因此，筛选能够兼具抗烟草黑胫病、青枯病生防特性的菌株，对提高病害的防治效果、降低防治成本具有重要意义。 

由于当前烟草黑胫病和青枯病的生物防治技术均针对单一作用靶标，缺乏能同时对烟草黑胫病和青枯病有良好生防效果的菌剂，由于烟草黑胫病和青枯病在山东以及南方烟区多为混合发生，从而导致防治效果不佳、防治成本增高。 

发明内容

针对上述技术问题，本发明筛选出对烟草黑胫病和青枯病均具有良好生防效果的优良菌株，实现一菌两治，达到提高防效、降低成本的良好效果。 

本发明的技术方案如下： 

一种兼抗烟草黑胫病和青枯病的生防菌株Trb3，为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，于2012年3月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.5855。 

所述的生防菌株Trb3用于制备生防菌剂的方法如下： 

将所述的生防菌株Trb3在LB培养液28℃180rpm振荡培养36-40小时，然后6000rpm离心10分钟，用灭菌水配成进行稀释配制成菌剂，菌剂成品中活菌总浓度为1×10⁹～1×10¹⁰cfu/ml。 

所述LB培养液配方是酵母膏5g、蛋白胨10g、氯化钠10g、蒸馏水1000ml，并调节pH值为7.0。 

所述的生防菌剂在防治烟草黑胫病和青枯病的应用方法如下： 

在烟草移栽时蘸根20分钟，或稀释100倍后在移栽时灌根使用，每株灌40ml稀释液；移栽后在发病前或出现零星病株时，用该生防菌剂100倍液灌根，每株灌40ml稀释液，连续使用2-3次，每次间隔7-10天。 

与现有烟草黑胫病和青枯病防治技术相比，本发明的优点和积极效果表现在：本发明是专门针对烟草黑胫病和青枯病开发的生防制剂，由于是生物制剂，完全没有因化学农药的使用所带来的一系列问题，有利于烟草的无公害生产；生产中烟草黑胫病和青枯病普遍混合发生，本发明对两种病害兼防兼治，效果良好，一药两治还可以为农民节省防治成本；本发明菌株分离自烟草根际，占有良好的生态位，有利于充分发挥菌株优势。 

所述生防菌剂在烟草移栽前蘸根，也可以在移栽时灌根使用。移栽后，在烟草黑胫病和青枯病即将进入发病期时灌根使用，连续使用2-3次，每次间隔7-10天。使用后，菌株通过抑制病原菌、促进烟株生长等多种生防机制起作用，从而达到防病的效果。 

试验表明，在温室中所述生防菌剂对烟草黑胫病和青枯病均有防治效果，对烟草黑胫病防治效果达72.3％，对烟草青枯病防治效果为65.7％。田间施用Trb3菌株制剂对烟草黑胫病、青枯病混发烟田防治效果为61.04％。 

附图说明

图1是生防菌株Trb3的系统发育分析； 

图2是生防菌株Trb3对烟草黑胫病菌的抑制效果； 

图3是生防菌株Trb3对烟草青枯病菌的抑制效果。 

具体实施方式

一、菌种鉴定 

一种兼抗烟草黑胫病和青枯病的生防菌株Trb3，为枯草芽孢杆菌(Bacillus  subtilis)，Trb菌株菌体杆状，染色均匀，革兰氏染色阳性，鞭毛周生，产芽孢，在PDA平板培养基上菌落圆形，不透明，有皱纹，乳脂色；在平板培养基表面扩展很快，肉汤培养液中形成菌膜。根据形态特征和生理生化特征，见表1，初步认为生防菌株Trb3属于枯草芽孢杆菌。 

通过对生防菌株Trb3的16S rDNA序列分析，获得了1455bp的序列，在GenBank核酸序列数据库中，进行Blastn搜索，其中同源性最高的是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，选择与生防菌株Trb3同源性高的序列进行系统发育学分析，结果如图1所示，Trb3菌株与枯草芽孢杆菌同源性较高。依据此结果，再根据菌体形态和生理生化特征(如表1所示)可以将生防菌株Trb3归入芽孢杆菌属，与枯草芽孢杆菌形成一个类群。 

表1生防菌株Trb3主要形态和生理生化特征 

  菌落   圆形   水解淀粉反应   +   形状   杆状   降解酪氨酸反应   -   革兰氏染色   +   葡萄糖产酸   +   孢子染色   +   木糖产酸   +   41℃生长   +   阿拉伯糖产酸   +   4℃生长   -   甘露醇产酸   +   好氧和厌氧   +   卵磷脂利用   -   接触酶   +   柠檬酸盐利用   +   运动性   +   吲哚的产生   -   V-P实验   +   耐盐性5％NaCl   +

注：“+”表示阳性反应；“-”表示阴性反应 

二、生防菌株Trb3烟草黑胫病菌、烟草青枯病菌的抑菌效果 

1)生防菌株Trb3对烟草黑胫病菌的抑菌效果 

本发明中，LB培养液的配方是酵母膏5g、蛋白胨10g、氯化钠10g、蒸馏水1000ml，并调节pH值为7.0。 

生防菌株Trb3在LB培养液28℃180rpm振荡培养36-40小时，然后6000rpm 离心10分钟，备用。在无菌条件下将融化的适量固体燕麦培养基倒入平板内，凝固后，在平板中央接入直径5mm黑胫病菌菌丝块，然后用直径5.0mm无菌滤纸片蘸发酵液，将在培养皿边缘等距离接种3块蘸菌液滤纸片，以蘸无菌水滤纸片作对照。28℃培养3天后，检查结果见图2所示，Trb3对烟草黑胫病菌周围形成较大的抑菌圈，黑胫病菌菌丝生长稀疏，表明生防菌株Trb3对烟草黑胫病有较强的抑制效果，抑菌带宽达1.87cm，菌丝生长稀疏。 

2)生防菌株Trb3对烟草青枯病菌的抑菌效果 

生防菌株Trb3在LB培养液28℃180rpm振荡培养36-40小时，然后6000rpm离心10分钟，备用。在无菌条件下将融化的适量固体PDA培养基倒入平板内，在其上均匀涂布青枯病菌(3×10⁶cfu/ml)100μl。然后在平板中央接入蘸Trb菌株发酵液的无菌滤纸片，置将28℃培养24小时。结果如图3所示，生防菌株Trb3对青枯病菌具有强烈的抑制作用，抑菌圈直径达2.13cm。 

三、生防菌剂Trb3制备 

生防菌株Trb3用于制备生防菌剂Trb3的方法如下： 

将所述生防菌株Trb3在LB培养液28℃180rpm振荡培养36-40小时，然后6000rpm离心10分钟，用灭菌水配成进行稀释配制成菌剂，菌剂成品中活菌总浓度为1×10⁹～1×10¹⁰cfu/ml。 

四、生防菌剂Trb3对烟草黑胫病和青枯病的防效 

1)温室盆栽试验检测生防菌剂Trb3对烟草黑胫病和青枯病的防效 

选择大小一致、四叶一心的烟苗进行试验，共设七个处理：(1)移栽时采用20ml 10⁷cfu/ml菌剂对烟苗灌根，移栽后7天接种10⁷cfu/ml青枯菌Ralstonia solanacearum菌悬液20ml；(2)不用菌剂Trb3处理，移栽后7天直接接种10⁷cfu/ml青枯菌Ralstonia solanacearum菌悬液20ml；(3)移栽时采用20ml10⁷cfu/ml菌剂对烟苗灌根，移栽后7天接种黑胫病菌菌谷3g；(4)不用菌剂Trb3处理，移栽后7天接种黑胫病菌菌谷3g；(5)移栽时采用20ml 10⁷cfu/ml菌剂对烟苗灌根，移栽后7天分别接种10⁷cfu/ml青枯菌Ralstonia solanacearum 菌悬液20ml和黑胫病菌菌谷3g；(6)不用菌剂Trb3处理，移栽后7天分别接种10⁷cfu/ml青枯菌Ralstonia solanacearum菌悬液20ml和黑胫病菌菌谷3g；(7)不用菌剂Trb3处理，移栽后7天取20ml无菌水灌根。每个处理10株，三次重复，在温度30℃，光照为每天12小时，相对湿度85％条件下，15天后调查发病情况，计算病情指数和防效。 

结果如表2所示，生防菌剂Trb3对烟草青枯病防效为67.32％～79.74％，平均防效为74.63；对烟草黑胫病的防效为79.21％～87.49％，平均防效为83.74；对烟草黑胫病和青枯病混合接种防效为61.99～70.38％，平均为67.02％。 

表2生防菌剂Trb3对烟草青枯病和黑胫病的温室防治效果测定 

  处理   病情指数   防治效果(％)   (1)   9.46±2.4206A   74.63   (2)   39.47±2.4805B   -   (3)   4.04±1.0435A   83.74   (4)   24.87±1.8388B   -   (5)   13.16±1.7708A   67.02   (6)   39.91±1.2795B   -   (7)   0  

2)生防菌剂Trb3田间应用效果测定 

试验设在山东沂水烟田，试验烟田往年病害较重，且黑胫病与青枯病混发现象普遍，烟草2010年5月11日移栽，共设三个处理：(1)移栽时将Trb3生防菌剂100倍液灌根，每株40ml；6月25日、7月5日分别灌根2次；(2)移栽时58％甲霜灵锰锌400倍液灌根，每株40ml，6月25日、7月5日分别灌根2次；(3)对 照不使用任何农药。试验每个处理45株烟，三次重复，7月20日调查发病情况，计算病情指数和防治效果。 

结果如表3所示，本年度试验烟田黑胫病与青枯病混发，生防菌剂Trb3防治效果达到50％以上，明显优于防治烟草黑胫病对照药剂58％甲霜灵锰锌。 

表3生防菌剂Trb3田间应用效果 

  处理   病情指数   防效   (1)   15.84±0.6088Aa   52.21   (2)   18.77±0.7087Bb   43.39   (3)   33.15±0.9463Cc   -